乙氧硬化醇对胃癌细胞体外杀伤作用的实验研究
作者：吴云林 程时丹 乔敏敏 章永平
单位：吴云林 程时丹 乔敏敏 章永平(上海第二医科大学附属瑞金医院消化科 上海 200025)
关键词：乙氧硬化醇；MTT法；肿瘤细胞，培养；胃肿瘤
肿瘤000607
摘要：目的 探讨乙氧硬化醇对胃癌细胞的体外杀伤作用。方法 采用MTT细胞毒试验分别测定乙氧硬化醇对三种不同分化程度的胃癌细胞株的杀伤率。结果 乙氧硬化醇对三株胃癌细胞株均存在抑制作用，且呈浓度-抑制率相关关系。结论 乙氧硬化醇能在体外杀伤胃癌细胞。
中图分类号：R73-361 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)06-0413-02
STUDY OF THE KILLING EFFECT OF AETHOXYSKLEXOL ON GASTRIC CANCER CELLS IN VITRO
, 百拇医药
WU Yun-lin CHENG Shi-dan QIAO Min-min
Ruijing Hosptial ,Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025,China
Abstract：Objective To study the killing effect of aethoxysklexol on gastric cancer cell lines in vitro.Methods Three gastric cancer cell lines with various degrees of differentiation were tested. The cytotoxicity of aethoxysklexol was examined by MTT method. Results Aethoxysklexol had a marked killing effect on three gastric cnacer cell lines, as well as a close relationship between concentration and inhibitory rate. Conclusion Aethoxysklexol has a killing effect on the gastric cancer cells in vitro.
, 百拇医药
Key words： Aethoxysklexol; MTT; Tumor cell,cultured; Gastric neoplasms
胃癌是人类消化道的常见恶性肿瘤之一，但我国的早期胃癌诊断率及手术率均较低，绝大部分患者诊断时已属进展期胃癌。姑息切除性胃癌或原发灶无法切除的胃癌，化疗为迄今沿用的重要治疗方法之一，其中内镜下胃癌灶内直接注射化疗药物、免疫调节剂或其他抗癌药物是现今公认的进展期胃癌主要的临床治疗方法[1]。乙氧硬化醇(Aethoxysklexol,商品名polido canol)是一种普遍应用的硬化剂，用于内镜下肝硬化食管和胃静脉曲张硬化治疗[2，3]。其主要作用是在食管上皮与曲张静脉之间形成一层厚的纤维化组织，加强血管抵抗力，闭塞血管以防止曲张静脉破裂出血。作者在应用乙氧硬化醇控制胃癌灶出血的治疗中，意外发现经乙氧硬化醇多点注射治疗的胃癌灶出现局限、缩小，病灶变平整等现象。本实验通过对三种不同分化程度的胃癌细胞株的研究，观察乙氧硬化醇对胃癌细胞的作用。
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材料与方法
一、细胞来源
SGC7901、MNK28和MNK45细胞株系三种不同分化程度的胃癌细胞株，其中MNK28为高分化，SGC7901为中分化，MNK45为低分化；上述胃癌细胞均由本实验室传代培养。三种胃癌细胞株均培养于RPMI 1640培养液中，内含20%小牛血清。培育在37℃，含5 % CO2细胞培养箱内。
二、主要试剂
1 %乙氧硬化醇由德国Chemishe Fabrik Kreussler公司提供，四氮唑盐(MTT)为瑞士Fluke公司产品，RPMI-1640由美国Life Technologies公司出品，318MC型酶标仪为上海三科仪器有限公司产品。
三、胃癌细胞生长抑制试验
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采用四氮唑盐法(MTT法)。细胞经对数生长期后，以1×104/孔细胞接种于96孔细胞培养板上，每孔总体积为0.1 ml。在37℃，含5 % CO2细胞培养箱内培育24 h后，加入不同浓度的乙氧硬化醇各0.1 ml(浓度范围0～1000 μg/ml)，每次每个浓度设三个复孔，并设立培养液及无细胞对照孔。作用72 h后倾去上清液，各孔加入四氮唑盐(MTT) 0.1 ml，继续培养4 h后，倾去上清液，加入二甲亚砚(DMSO)液0.1 ml于各孔，温育30 min，酶标仪570 nm处测定OD值，计算抑制率(抑制率=〔(OD对照组-OD测试组)/OD对照组〕×100%)，并绘制药物浓度-抑制率曲线，求出50%抑制浓度(IC50)。
结 果
用乙氧硬化醇对SGC7901、MNK28和MNK45三种不同分化程度的胃癌细胞株进行MTT试验，结果显示在加乙氧硬化醇前，各孔细胞贴壁生长良好。加用该药72 h后，细胞呈不同程度浮起，显示部分细胞已死亡，而对照组细胞仍贴壁生长良好。抑制率计算结果亦显示乙氧硬化醇对这三种细胞株均有一定的直接细胞毒作用(P<0.01)。在浓度为1 μg/ml时可见细胞杀伤率明显增高(见附表)，其对SGC7901、MNK28和MNK45细胞株的IC50分别为161.74 μg/ml，54.47 μg/ml和44.33 μg/ml。乙氧硬化醇对胃癌细胞株的细胞毒作用呈剂量依赖性(见附图，P<0.01)。
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附图 乙氧硬化醇对胃癌SGC7901、MNK28、MNK45细胞株的杀伤作用
附表 乙氧硬化醇对胃癌细胞株的抑制作用(抑制率%：
±s) 乙氧硬化醇(μg/ml)
例数
SGC7901
MNK28
MNK45
0
4
5.53±3.35
5.61±2.30
, 百拇医药
5.84±3.46
1
4
22.40±6.79
12.9±2.51
21.46±7.77
10
4
28.90±11.06
37.43±4.32
32.33±3.61
100
, 百拇医药
4
44.56±12.44
60.46±15.25
63.53±4.66
1900
4
64.17±7.71
70.66±3.84
71.96±0.28
讨 论
一、本研究首次表明，原应用于肝硬化食管和胃静脉曲线及其出血治疗的硬化剂乙氧硬化醇，具有明显的胃癌细胞杀伤作用，浓度仅为1 μg/ml时即可见细胞抑制率明显增高，且其对胃癌细胞株的细胞毒作用呈剂量依赖性。作者等在临床进展期胃癌出血内镜直视下乙氧硬化醇多点注射止血中，发现其对胃癌具有抑制作用的现象，本研究结果提示该现象很可能系多点注入癌组织中的乙氧硬化醇产生的直接癌细胞杀伤和抑制作用，导致胃癌组织局限、缩小，病灶可由结节状或极不规则状转变为平坦状。作者曾对1例胃窦癌累及幽门部引起幽门梗阻并发出血患者进行内镜下乙氧硬化醇止血治疗，出血癌灶处多点注入1%乙氧硬化醇12 ml，术后不仅出血停止，且幽门梗阻解除，能进半流质。术后2周内镜复查显示累及幽门管部的癌肿明显缩小，幽门管部分通畅。显然本研究结果为乙氧硬化醇的抗胃癌效应提供了初步实验依据。
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二、体外测定抗肿瘤药物细胞毒作用的方法众多，常用的包括同位素掺入法、体外干细胞集落培养法、台盼蓝活细胞拒染法等，本次研究采用Mosmann的MTT法[4]。MTT为细胞线粒体脱氢酶的底物，进入细胞体后，活细胞将其还原成深紫黑色的甲月 替结晶体(Formazan0；死细胞内的线粒体脱氢酶已失活，不能还原MTT，因而不显色。甲月 替不溶于水，但可被二甲亚砜溶解，在570 nm波长处有最大吸收峰，分光光度计可进行定量测定。作者经预试验等多次实验研究，证实乙氧硬化醇抗胃癌细胞株的MTT法具有快速、简易及重复性好的优点。
有关乙氧硬化醇抗胃癌作用机理，以及其联用各种细胞毒药物对胃癌细胞是否具有协同杀伤作用等，尚待进一步研究。
吴云林，男，教授，博士生导师。
参考文献
[1]吴云林.食管和胃静脉曲张出血的内镜现代治疗〔M〕.见王崇文主编.消化系疾病诊断治疗新进展〔M〕.第1版.江西科学技术出版社，1999：77
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[2]姜钰峰.进展期胃癌内镜下化疗及免疫治疗〔M〕.见吴云林主编.消化内镜操作技巧.第1版.上海科学技术文献出版社，1993：54-59
[3]Suzuki K, Chiba M, Yamamoto M, et al. Present status of endoscopic therapy for esophageal varices-endoscopic variceal ligation (EVL)〔J〕. Nippon Geka Gakkai-Zasshi, 1996,97:49
[4]Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assay〔J〕.J Immol Meth,1983,65:55
(收稿日期：1999-12-16), 百拇医药
单位：吴云林 程时丹 乔敏敏 章永平(上海第二医科大学附属瑞金医院消化科 上海 200025)
关键词：乙氧硬化醇；MTT法；肿瘤细胞，培养；胃肿瘤
肿瘤000607
摘要：目的 探讨乙氧硬化醇对胃癌细胞的体外杀伤作用。方法 采用MTT细胞毒试验分别测定乙氧硬化醇对三种不同分化程度的胃癌细胞株的杀伤率。结果 乙氧硬化醇对三株胃癌细胞株均存在抑制作用，且呈浓度-抑制率相关关系。结论 乙氧硬化醇能在体外杀伤胃癌细胞。
中图分类号：R73-361 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)06-0413-02
STUDY OF THE KILLING EFFECT OF AETHOXYSKLEXOL ON GASTRIC CANCER CELLS IN VITRO
, 百拇医药
WU Yun-lin CHENG Shi-dan QIAO Min-min
Ruijing Hosptial ,Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025,China
Abstract：Objective To study the killing effect of aethoxysklexol on gastric cancer cell lines in vitro.Methods Three gastric cancer cell lines with various degrees of differentiation were tested. The cytotoxicity of aethoxysklexol was examined by MTT method. Results Aethoxysklexol had a marked killing effect on three gastric cnacer cell lines, as well as a close relationship between concentration and inhibitory rate. Conclusion Aethoxysklexol has a killing effect on the gastric cancer cells in vitro.
, 百拇医药
Key words： Aethoxysklexol; MTT; Tumor cell,cultured; Gastric neoplasms
胃癌是人类消化道的常见恶性肿瘤之一，但我国的早期胃癌诊断率及手术率均较低，绝大部分患者诊断时已属进展期胃癌。姑息切除性胃癌或原发灶无法切除的胃癌，化疗为迄今沿用的重要治疗方法之一，其中内镜下胃癌灶内直接注射化疗药物、免疫调节剂或其他抗癌药物是现今公认的进展期胃癌主要的临床治疗方法[1]。乙氧硬化醇(Aethoxysklexol,商品名polido canol)是一种普遍应用的硬化剂，用于内镜下肝硬化食管和胃静脉曲张硬化治疗[2，3]。其主要作用是在食管上皮与曲张静脉之间形成一层厚的纤维化组织，加强血管抵抗力，闭塞血管以防止曲张静脉破裂出血。作者在应用乙氧硬化醇控制胃癌灶出血的治疗中，意外发现经乙氧硬化醇多点注射治疗的胃癌灶出现局限、缩小，病灶变平整等现象。本实验通过对三种不同分化程度的胃癌细胞株的研究，观察乙氧硬化醇对胃癌细胞的作用。
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材料与方法
一、细胞来源
SGC7901、MNK28和MNK45细胞株系三种不同分化程度的胃癌细胞株，其中MNK28为高分化，SGC7901为中分化，MNK45为低分化；上述胃癌细胞均由本实验室传代培养。三种胃癌细胞株均培养于RPMI 1640培养液中，内含20%小牛血清。培育在37℃，含5 % CO2细胞培养箱内。
二、主要试剂
1 %乙氧硬化醇由德国Chemishe Fabrik Kreussler公司提供，四氮唑盐(MTT)为瑞士Fluke公司产品，RPMI-1640由美国Life Technologies公司出品，318MC型酶标仪为上海三科仪器有限公司产品。
三、胃癌细胞生长抑制试验
, http://www.100md.com
采用四氮唑盐法(MTT法)。细胞经对数生长期后，以1×104/孔细胞接种于96孔细胞培养板上，每孔总体积为0.1 ml。在37℃，含5 % CO2细胞培养箱内培育24 h后，加入不同浓度的乙氧硬化醇各0.1 ml(浓度范围0～1000 μg/ml)，每次每个浓度设三个复孔，并设立培养液及无细胞对照孔。作用72 h后倾去上清液，各孔加入四氮唑盐(MTT) 0.1 ml，继续培养4 h后，倾去上清液，加入二甲亚砚(DMSO)液0.1 ml于各孔，温育30 min，酶标仪570 nm处测定OD值，计算抑制率(抑制率=〔(OD对照组-OD测试组)/OD对照组〕×100%)，并绘制药物浓度-抑制率曲线，求出50%抑制浓度(IC50)。
结 果
用乙氧硬化醇对SGC7901、MNK28和MNK45三种不同分化程度的胃癌细胞株进行MTT试验，结果显示在加乙氧硬化醇前，各孔细胞贴壁生长良好。加用该药72 h后，细胞呈不同程度浮起，显示部分细胞已死亡，而对照组细胞仍贴壁生长良好。抑制率计算结果亦显示乙氧硬化醇对这三种细胞株均有一定的直接细胞毒作用(P<0.01)。在浓度为1 μg/ml时可见细胞杀伤率明显增高(见附表)，其对SGC7901、MNK28和MNK45细胞株的IC50分别为161.74 μg/ml，54.47 μg/ml和44.33 μg/ml。乙氧硬化醇对胃癌细胞株的细胞毒作用呈剂量依赖性(见附图，P<0.01)。
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附图 乙氧硬化醇对胃癌SGC7901、MNK28、MNK45细胞株的杀伤作用
附表 乙氧硬化醇对胃癌细胞株的抑制作用(抑制率%：
±s) 乙氧硬化醇(μg/ml)例数
SGC7901
MNK28
MNK45
0
4
5.53±3.35
5.61±2.30
, 百拇医药
5.84±3.46
1
4
22.40±6.79
12.9±2.51
21.46±7.77
10
4
28.90±11.06
37.43±4.32
32.33±3.61
100
, 百拇医药
4
44.56±12.44
60.46±15.25
63.53±4.66
1900
4
64.17±7.71
70.66±3.84
71.96±0.28
讨 论
一、本研究首次表明，原应用于肝硬化食管和胃静脉曲线及其出血治疗的硬化剂乙氧硬化醇，具有明显的胃癌细胞杀伤作用，浓度仅为1 μg/ml时即可见细胞抑制率明显增高，且其对胃癌细胞株的细胞毒作用呈剂量依赖性。作者等在临床进展期胃癌出血内镜直视下乙氧硬化醇多点注射止血中，发现其对胃癌具有抑制作用的现象，本研究结果提示该现象很可能系多点注入癌组织中的乙氧硬化醇产生的直接癌细胞杀伤和抑制作用，导致胃癌组织局限、缩小，病灶可由结节状或极不规则状转变为平坦状。作者曾对1例胃窦癌累及幽门部引起幽门梗阻并发出血患者进行内镜下乙氧硬化醇止血治疗，出血癌灶处多点注入1%乙氧硬化醇12 ml，术后不仅出血停止，且幽门梗阻解除，能进半流质。术后2周内镜复查显示累及幽门管部的癌肿明显缩小，幽门管部分通畅。显然本研究结果为乙氧硬化醇的抗胃癌效应提供了初步实验依据。
, http://www.100md.com
二、体外测定抗肿瘤药物细胞毒作用的方法众多，常用的包括同位素掺入法、体外干细胞集落培养法、台盼蓝活细胞拒染法等，本次研究采用Mosmann的MTT法[4]。MTT为细胞线粒体脱氢酶的底物，进入细胞体后，活细胞将其还原成深紫黑色的甲月 替结晶体(Formazan0；死细胞内的线粒体脱氢酶已失活，不能还原MTT，因而不显色。甲月 替不溶于水，但可被二甲亚砜溶解，在570 nm波长处有最大吸收峰，分光光度计可进行定量测定。作者经预试验等多次实验研究，证实乙氧硬化醇抗胃癌细胞株的MTT法具有快速、简易及重复性好的优点。
有关乙氧硬化醇抗胃癌作用机理，以及其联用各种细胞毒药物对胃癌细胞是否具有协同杀伤作用等，尚待进一步研究。
吴云林，男，教授，博士生导师。
参考文献
[1]吴云林.食管和胃静脉曲张出血的内镜现代治疗〔M〕.见王崇文主编.消化系疾病诊断治疗新进展〔M〕.第1版.江西科学技术出版社，1999：77
, http://www.100md.com
[2]姜钰峰.进展期胃癌内镜下化疗及免疫治疗〔M〕.见吴云林主编.消化内镜操作技巧.第1版.上海科学技术文献出版社，1993：54-59
[3]Suzuki K, Chiba M, Yamamoto M, et al. Present status of endoscopic therapy for esophageal varices-endoscopic variceal ligation (EVL)〔J〕. Nippon Geka Gakkai-Zasshi, 1996,97:49
[4]Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assay〔J〕.J Immol Meth,1983,65:55
(收稿日期：1999-12-16), 百拇医药