IL-4、紫杉醇对Lewis肺癌细胞核形态DNA含量及AgNORs的影响胡
作者：雪峰 刘铭球 喻伦银 陈德基 刁路明 刘晓翌 江曼 夏东 李蓓云
单位：胡雪峰 刘铭球 喻伦银 陈德基 刁路明 刘晓翌 江曼 夏东 李蓓云(湖北医科大学病理学教研室 武汉 430071)
关键词：肺肿瘤；IL-4；紫杉醇；DNA含量；核仁组成区；肿瘤细胞，培养的；图像分析，计算机辅助
肿瘤000605
摘要：目的 探讨IL-4、紫杉醇对lewis肺癌的抑制作用。方法 将Lewis肺癌细胞(1.25×106个/鼠)接种于C57BL/6小鼠皮下。将40只小鼠随机分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组，接种后第5天起分别给予生理盐水、IL-4、紫杉醇、IL-4+紫杉醇。第18天处死动物。利用图像分析仪对肿瘤细胞核形态、DNA含量及AgNORs计数进行测量。结果 Ⅰ组核的面积为37.037±7.027 μm2，周长为22.762±4.312 μm，平均直径为(3.136±0.351) μm，积分光密度为(4.294±0.992)，AgNORs计数为(7.635±1.160)；Ⅱ组核面积(24.202±5.012)μm2、周长(18.625±4.180) μm、平均直径(2.642±0.291)μm、积分光密度(3.412±0.910)、AgNORs计数(5.313±0.820)比Ⅰ组小，差异均有显著性(P<0.05)；Ⅲ组核面积(18.373±4.833)μm2、周长(16.522±2.518)μm、平均直径(2.401±0.288)μm、积分光密度(3.096±0.771)、AgNORs计数(2.670±0.401)比Ⅰ组小，差异均有高度显著性(P<0.01)；Ⅳ组核面积(16.664±4.671)μm2、周长(15.901±2.700) μm、平均直径(2.283±0.308) μm、积分光密度(2.707±0.807)、AgNORs计数(1.552±0.316)比Ⅰ组小，差异均有高度显著性(P<0.01)。各用药组间参数差异均有显著性(P<0.05)。结论 IL-4、紫杉醇对Lewis肺癌均有抑制作用，紫杉醇疗效较好，两者联用疗效更好。
, 百拇医药
中图分类号：R734.2 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)06-0406-04
EFFECTS OF IL-4 AND TAXOL ON NUCLEAR MORPHOMETRY,DNA CONTENTS AND AgNORs COUNTING OF LEWIS LUNG CANCER
HU Xue-feng LIU Ming-qiu YU Lun-yin
Deparmtnet of Pathology,Wuhan University Medical College (Wuhan 430071,China)
Abstract：Objective To investigate the inhibiting effects of IL-4 and taxol on Lewis lung cancer (LLC).Methods Lewis lung cancer cells (1.25×106/mouse) were inoculated subcutaneously to each of 40 mice, they were randomly divided into 4 groups. From the 5th day, to group Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,0.9% natrii chloride, IL-4 or taxol were injected respectively;to group Ⅳ, IL-4 and taxol were injected. On the 18 th day, all the mice were killed. Nuclear morphometry, DNA contents and AgNORs were detected by image analysis.Results Nuclear area, perimeter, mean diameter, DNA contents and AgNORs counting in group Ⅰ were 37.037 μm2,22.762 μm,3.136 μm,4.294OD, and 7.635 counts respectively; in group Ⅱ were 24. 202 μm2, 18.626 μm, 2.642 μm, 3.412 OD, and 5.313 counts respectively; in group Ⅲ were 18.373 μm2, 16.522 μm，2.401 μm，3.096OD，and 2.670 counts respectively; in group Ⅳ were 16.664 μm2, 15.901 μm，2.283 μm，2.707 OD， and 1.552 counts respectively. The differences of parameters between group Ⅰ and group Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ were statistically significant (P<0.05，P<0.01 and P<0.01 respectively), and also between each other in group Ⅱ，Ⅲ and Ⅳ(P<0.05).Conclusion IL-4 and taxol all can inhibit LLC. The effect of combined treatment is the most significant, the effect of taxol is more significant than that of IL-4.
, 百拇医药
Key words： Lung neoplasms; IL-4; Taxol; DNA contents; Nucleolar organizer region； Image analysis,computer-assisted; Tumor cells,cultured
IL-4是机体免疫应答过程中的重要调控因子，可促进细胞毒T细胞分化、促进巨噬细胞的趋化及杀伤作用，对肿瘤的生长也有显著的抑制使用[1]。紫杉醇是一种从太平洋紫杉属短叶紫杉茎皮中提取的抗肿瘤药物，它属于细胞周期G2/M期阻滞剂，并能诱导肿瘤细胞凋亡[2]。体内外实验证明它对卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肺癌、淋巴瘤、白血病及头颈部肿瘤均有较好的疗效[3，4]。紫杉醇已用于临床肿瘤治疗，其作用突出，但仍有一定的毒副作用[5]。
本研究使用IL-4、紫杉醇单用及联合治疗Lewis肺癌，观察肿瘤细胞核形态，DNA含量及AgNORs计数的改变。
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材料与方法
一、实验材料
1.实验动物：C57BL/6小鼠40只，雌雄各半，体重为18 g～22 g，购自中国医学科学院医学实验动物研究所。
2.Lewis肺癌可移植性瘤株：自中国医学科学院药物研究所药理室购荷瘤C57BL/6小鼠，经体内传代保种。
3.L929传代细胞系：购自武汉大学典型培养物保藏中心。
4.鼠重组IL-4：购自英国Peprotech公司。
5.紫杉醇注射液：中国医学科学院药物研究所方起程老师惠赠，浓度为6 mg/ml。
, 百拇医药 6.Feulgen染液。
7.AgNO3染液。
8.图像分析仪：TJTY-300型，同济太阳电子公司产品。
二、实验方法
1.40只C57BL/6小鼠每只于右腋皮下接种Lewis肺癌细胞，含活细胞1.25×106个/鼠，接种后将动物随机分为四组，每组10只，雌雄各半，并编号，第5天开始给药。
Ⅰ组为对照组：由Ⅰa 5只、Ⅰb 5只作两种条件对照。Ⅰa每日每只肿瘤局部皮下注射生理盐水0.2 ml，Ⅰb 腹腔注射生理盐水0.2 ml，均连用10天。
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Ⅱ组为IL-4组：每日每只瘤周注射IL-4 50 ng含0.2 ml，连用7天[6]。
Ⅲ组为紫杉醇组：每日每只腹腔注射紫杉醇10 mg/kg，连用10天。
Ⅳ组为IL-4、紫杉醇合用组：每日每只腹腔注射紫杉醇5 mg/kg，连用10天，瘤周注射IL-4 50 ng，连用7天。
接种肿瘤后第18天处死动物。
2.接种肿瘤后第7天起，每隔一日用游标卡尺(精度为0.1 mm)测量肿瘤的最长径a和最短径b，按公式V=ab2/2计算肿瘤体积V，统计得出各组肿瘤平均体积，并绘制生长曲线。
3.接种后第18天断颈处死动物称鼠重，剥离皮下肿瘤结节后再称鼠重，两者之差即为瘤重(为了保证取瘤均衡，解剖由一人进行)。统计各组平均瘤重和除瘤后鼠重，组间比较。
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4.取局部肿瘤甲醛固定，常规透明、浸蜡、包埋、切片，Feulgen染色、嗜银染色。
5.将Feulgen染色切片在高倍镜(10×40)下观察细胞核，选择无重叠者为测试对象，由图像分析仪测肿瘤细胞核的面积、周长、平均直径、形状因子、积分光密度5项参数。每张切片测100个肿瘤细胞核[7]，计算每组各参数的平均值±标准差，然后组间比较，得出P值。
6.将嗜银染色切片在油镜(10×100)下随机观察2个视野，由图像分析仪测平均每个视野核、颗粒的数目，单个颗粒的面积、周长、平均直径、形状因子、数密度、面密度、AgNORs计数9个参数。公式计算如下：
形状因子=周长2/4π×面积
数密度=AgNORs颗粒数/视野面积
, http://www.100md.com (每个视野面积由微机得出为3694.18μm2)
面密度=AgNORs颗粒数×颗粒面积/视野面积
AgNORs计数=AgNORs颗粒数/胞核数
经计算，得出每组各参数的平均值±标准差，组间比较，得出P值。
7.统计学处理：用SAS统计包进行方差分析，再进行student's-T-Test。
结 果
对照组由Ⅰa、Ⅰb两种条件对照组成，两者各参数经统计学处理，差异无显著性(P>0.05)，故并为一组。
一、四组肿瘤体积的动态变化和生长曲线
, 百拇医药
接种肿瘤后第5天左右，各组小鼠开始出现可触摸的瘤结节，按不同的处理因素于接种肿瘤后第7、9、11、13、15、17天测量肿瘤体积(见表1)。
表1 肿瘤体积动态变化(
±s cm3) 组别
接种后天数
第7天
第9天
第11天
第13天
第15天
第17天
, 百拇医药 Ⅰ
0.066±0.008
0.194±0.014
0.548±0.022
1.012±0.012
1.507±0.008
2.007±0.006
Ⅱ
0.058±0.005
0.132±0.005
0.282±0.005
0.710±0.004
, http://www.100md.com
1.069±0.006
1.534±0.007
Ⅲ
0.042±0.004
0.061±0.004
0.092±0.007
0.196±0.015
0.292±0.006
0.404±0.010
Ⅳ
0.030±0.011
0.041±0.022
, http://www.100md.com
0.072±0.041
0.152±0.086
0.210±0.119
0.322±0.142
根据肿瘤体积的动态变化绘制时间-体积生长曲线(见图1)。
图1 各组肿瘤生长曲线
从图中可看出，Ⅰ组肿瘤生长速度最快，表现为曲线陡直，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组肿瘤生长速度均受不同程度的抑制，曲线变缓，其中Ⅳ组最为明显。
二、四组小鼠的平均瘤重和除瘤后鼠重
接种肿瘤后第18天，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组肿瘤的平均重量分别为(2.833±0.074) g,(2.060±0.080) g，(0.588±0.040) g，(0.420±0.188) g；各用药组与对照组比较：Ⅲ、Ⅳ组比Ⅰ组、Ⅱ组瘤重明显减轻(P<0.01)，Ⅱ组比Ⅰ组瘤重减轻(P<0.05)。Ⅳ组比Ⅲ组瘤重减轻(P<0.05)。提示紫杉醇与IL-4合用疗效最好，单一用药组紫杉醇的疗效较好。
, 百拇医药
用药前(接种后第4天)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组鼠重均值差异无显著性(P>0.05)。接种肿瘤后第18天，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组除瘤后鼠重分别为(34.805±3.012)g，(35.002±3.001) g，(22.673±2.801) g,(28.045±3.017) g。Ⅲ、Ⅳ组比Ⅰ、Ⅱ组除瘤后鼠重明显减轻(P<0.01)，Ⅳ组比Ⅲ组除瘤后鼠重加增(P<0.05)。提示鼠重减轻可能与药物毒性有关，紫杉醇单用毒性较大，与IL-4合用毒性减轻。
三、Lewis肺癌细胞形态测量和DNA含量测定
组织切片Feulgen染色，核呈深红色，胞浆不着色。Ⅰ组核大，多呈空泡状，染色质聚集成块，核分布紧密，核浆比例大。用药组，核缩小，染色质均匀分布，核间隙增宽，核浆比例缩小。从Ⅰ组至Ⅳ组，核面积、周长、平均直径、积分光密度均依次减少，而形状因子均依次增大。提示用药后肿瘤细胞体积缩小，生长受抑制，核DNA含量(积分光密度值)降低，肿瘤细胞核增殖能力减弱(见表2)。
, 百拇医药
表2 不同组间核形态参数和DNA含量结果(±s)
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
面积(μm2)
37.037±7.027
24.202±5.012
18.373±4.833
16.664±4.671
, 百拇医药 周长(μm)
22.762±4.312
18.625±4.180
16.522±2.518
15.901±2.700
平均直径(μm)
3.136±0.351
2.642±0.291
2.401±0.288
2.283±0.308
形状因子
, 百拇医药 1.113±0.065
1.141±0.075
1.186±0.081
1.207±0.084
积分光密度
4.294±0.992
3.412±0.910
3.096±0.771
2.707±0.807
P<0.05 Ⅱ：Ⅰ，Ⅳ：Ⅲ；P<0.01，Ⅲ、Ⅳ：Ⅰ、Ⅱ 四、AgNORs颗粒计数测定
组织切片银染，细胞核呈淡黄色，AgNORs呈棕褐色颗粒状。AgNORs颗粒多为弥散型，少见单一型和混合型。从第Ⅰ组至第Ⅳ组，胞核的数目，颗粒的面积、周长、平均直径均依次增大，而其它各参数均依次减小。以上参数各用药组与对照组比较：Ⅱ与Ⅰ比，差异有显著性(P<0.05)；Ⅲ、Ⅳ与Ⅰ比，差异有高度显著性(P<0.01)。Ⅳ与Ⅲ，差异有显著性(P<0.05)。说明从Ⅰ组至Ⅳ组，平均每个视野胞核的数目增多，胞核的体积就相对缩小，肿瘤细胞生长受到抑制，而AgNORs颗粒的体积逐渐增大，AgNORs计数逐渐减小(见封三图1，2)(见表3)。
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五、核DNA含量与AgNORs计数呈正相关
表1、2示，从Ⅰ组至Ⅳ组，DNA含量(积分光密度值)依次减少，AgNORs计数亦依次减小。DNA含量高的组别，其AgNORs计数亦高，反之亦然。经统计学处理，两者呈直线正相关，r为0.9611，P<0.01。
讨 论
一、IL-4对紫杉醇抑瘤作用的影响
本实验从肿瘤的体积、生长曲线和瘤重三方面看，IL-4、紫杉醇均有抑瘤作用，Ⅲ、Ⅳ与Ⅰ组比，差异有高度显著性(P<0.01)，Ⅱ组与Ⅰ组比，差异有显著性(P<0.05)，IL-4、紫杉醇联用比单用抑瘤更明显(P<0.05)，说明两者在抑瘤方面具协同效应。Ⅲ组在实验中于接种后第7、8天各有一只动物死亡，且该组小鼠比其它组明显消瘦(P<0.01)，说明紫杉醇有一定的毒副作用，两者联用除瘤后鼠重Ⅳ组比Ⅲ组增加，差异有显著性(P<0.05)，且无动物死亡，说明紫杉醇的毒副作用有所降低，这可能与实验中紫杉醇剂量减半有关，也可能是IL-4降低了紫杉醇的毒副作用。
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表3 不同组间AgNORs颗粒测定结果(±s)
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
X1
5.500±1.195
6.700±2.214
7.200±2.486
8.763±2.997
X2
, 百拇医药
41.993±6.960
35.597±4.880
19.224±3.858
13.600±2.169
X3(μm2)
0.675±0.112
0.744±0.118
1.130±0.252
1.767±0.371
X4(μm)
3.119±0.378
, 百拇医药
3.236±0.390
3.813±0.501
4.674±0.751
X5(μm)
0.437±0.026
0.501±0.030
0.581±0.031
0.665±0.034
X6
1.147±0.152
1.120±0.035
, 百拇医药
1.024±0.059
0.984±0.066
Z(×10-3)
7.673±2.506
7.170±2.365
5.880±1.613
6.505±2.112
Y(×10-3)
11.370±2.076
9.363±2.007
5.204±1.683
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3.681±1.136
P
7.635±1.160
5.313±0.820
2.670±0.401
1.552±0.316
注：X1：平均每个视野胞核的数目 X2：平均每个视野颗粒的数目X3颗粒的面积 X4颗粒的周长 X5颗粒的平均直径 X6颗粒的形状因子
Z：颗粒的数密度 Y：颗粒的面密度 P：AgNORs计数
, http://www.100md.com 其中X6=X24/4π*X3 Z=X2*X3/一个视野的面积(3694.18) Y=X2/3694.18 P=X2/X1
P<0.05 Ⅱ∶Ⅰ，Ⅳ∶Ⅲ；P<0.01 Ⅲ、Ⅳ∶Ⅰ、Ⅱ
二、Lewis肺癌细胞核形态测量与DNA含量测定的意义
药物对肿瘤的疗效在组织切片主要反映在细胞核上。细胞核 形态参数的均值反映了细胞核的大小，DNA含量则反映了肿瘤细胞的增殖特点。本实验显示使用IL-4、紫杉醇后肿瘤细胞核形态、DNA含量5个参数的改变。各用药组与对照组比，各用药组之间差异亦均有显著性(P<0.05)，因此肿瘤细胞核形态测量和DNA含量测定是判断肿瘤生长情况，分化程度及预后的一个重要指标。
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三、AgNORs计数在Lewis肺癌中的意义
本实验从Ⅰ组至Ⅳ组，AgNORs计数依次减少，各组间差异均有显著性(P<0.05)，AgNORs计数对良恶性肿瘤的鉴别已有大量的报道，是判别良恶性肿瘤的一个重要指标。本实验对AgNORs颗粒的大小进行了测量，从Ⅰ组至Ⅳ组，反映颗粒大小的几个参数如面积、周长、平均直径均依次增大，且各组间差异有显著性(P<0.05)，特别是镜下发现对照组AgNORs颗粒以弥散型为主，使用抑癌药后AgNORs颗粒单一型和混合型增多，单一型越多，疗效越好。AgNORs颗粒的大小与分型对于判断肿瘤的疗效、预后可能具有重要参考价值。
四、细胞核形态参数、DNA含量与AgNORs计数的关系
细胞核形态参数反映了细胞核的大小，DNA含量和AgNORs计数均反映了肿瘤细胞增殖特点，它们分别从静态和动态对Lewis肺癌的生长与分化提高信息，本实验显示它们之间有良好的相关性，肿瘤细胞核越大，DNA含量越高，AgNORs计数越多，将三者结合起来分析Lewis肺癌的性质，具有一定的实用价值。
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基金项目：湖北省自然科学基金(94J080)，湖北省科委重点科研课题(962P1106)湖北省教委重点科研课题[G9404(A015)]资助
胡雪峰，男，硕士，讲师。
参考文献
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[2]陈丽荣，郑树，Willingham MC,等.紫杉醇诱导的人乳癌细胞凋亡相关表达基因的克隆研究〔J〕.中国医学科学院学报，1997，19：197
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(收稿日期：1999-11-12), http://www.100md.com
单位：胡雪峰 刘铭球 喻伦银 陈德基 刁路明 刘晓翌 江曼 夏东 李蓓云(湖北医科大学病理学教研室 武汉 430071)
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EFFECTS OF IL-4 AND TAXOL ON NUCLEAR MORPHOMETRY,DNA CONTENTS AND AgNORs COUNTING OF LEWIS LUNG CANCER
HU Xue-feng LIU Ming-qiu YU Lun-yin
Deparmtnet of Pathology,Wuhan University Medical College (Wuhan 430071,China)
Abstract：Objective To investigate the inhibiting effects of IL-4 and taxol on Lewis lung cancer (LLC).Methods Lewis lung cancer cells (1.25×106/mouse) were inoculated subcutaneously to each of 40 mice, they were randomly divided into 4 groups. From the 5th day, to group Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,0.9% natrii chloride, IL-4 or taxol were injected respectively;to group Ⅳ, IL-4 and taxol were injected. On the 18 th day, all the mice were killed. Nuclear morphometry, DNA contents and AgNORs were detected by image analysis.Results Nuclear area, perimeter, mean diameter, DNA contents and AgNORs counting in group Ⅰ were 37.037 μm2,22.762 μm,3.136 μm,4.294OD, and 7.635 counts respectively; in group Ⅱ were 24. 202 μm2, 18.626 μm, 2.642 μm, 3.412 OD, and 5.313 counts respectively; in group Ⅲ were 18.373 μm2, 16.522 μm，2.401 μm，3.096OD，and 2.670 counts respectively; in group Ⅳ were 16.664 μm2, 15.901 μm，2.283 μm，2.707 OD， and 1.552 counts respectively. The differences of parameters between group Ⅰ and group Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ were statistically significant (P<0.05，P<0.01 and P<0.01 respectively), and also between each other in group Ⅱ，Ⅲ and Ⅳ(P<0.05).Conclusion IL-4 and taxol all can inhibit LLC. The effect of combined treatment is the most significant, the effect of taxol is more significant than that of IL-4.
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IL-4是机体免疫应答过程中的重要调控因子，可促进细胞毒T细胞分化、促进巨噬细胞的趋化及杀伤作用，对肿瘤的生长也有显著的抑制使用[1]。紫杉醇是一种从太平洋紫杉属短叶紫杉茎皮中提取的抗肿瘤药物，它属于细胞周期G2/M期阻滞剂，并能诱导肿瘤细胞凋亡[2]。体内外实验证明它对卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肺癌、淋巴瘤、白血病及头颈部肿瘤均有较好的疗效[3，4]。紫杉醇已用于临床肿瘤治疗，其作用突出，但仍有一定的毒副作用[5]。
本研究使用IL-4、紫杉醇单用及联合治疗Lewis肺癌，观察肿瘤细胞核形态，DNA含量及AgNORs计数的改变。
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材料与方法
一、实验材料
1.实验动物：C57BL/6小鼠40只，雌雄各半，体重为18 g～22 g，购自中国医学科学院医学实验动物研究所。
2.Lewis肺癌可移植性瘤株：自中国医学科学院药物研究所药理室购荷瘤C57BL/6小鼠，经体内传代保种。
3.L929传代细胞系：购自武汉大学典型培养物保藏中心。
4.鼠重组IL-4：购自英国Peprotech公司。
5.紫杉醇注射液：中国医学科学院药物研究所方起程老师惠赠，浓度为6 mg/ml。
, 百拇医药 6.Feulgen染液。
7.AgNO3染液。
8.图像分析仪：TJTY-300型，同济太阳电子公司产品。
二、实验方法
1.40只C57BL/6小鼠每只于右腋皮下接种Lewis肺癌细胞，含活细胞1.25×106个/鼠，接种后将动物随机分为四组，每组10只，雌雄各半，并编号，第5天开始给药。
Ⅰ组为对照组：由Ⅰa 5只、Ⅰb 5只作两种条件对照。Ⅰa每日每只肿瘤局部皮下注射生理盐水0.2 ml，Ⅰb 腹腔注射生理盐水0.2 ml，均连用10天。
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Ⅱ组为IL-4组：每日每只瘤周注射IL-4 50 ng含0.2 ml，连用7天[6]。
Ⅲ组为紫杉醇组：每日每只腹腔注射紫杉醇10 mg/kg，连用10天。
Ⅳ组为IL-4、紫杉醇合用组：每日每只腹腔注射紫杉醇5 mg/kg，连用10天，瘤周注射IL-4 50 ng，连用7天。
接种肿瘤后第18天处死动物。
2.接种肿瘤后第7天起，每隔一日用游标卡尺(精度为0.1 mm)测量肿瘤的最长径a和最短径b，按公式V=ab2/2计算肿瘤体积V，统计得出各组肿瘤平均体积，并绘制生长曲线。
3.接种后第18天断颈处死动物称鼠重，剥离皮下肿瘤结节后再称鼠重，两者之差即为瘤重(为了保证取瘤均衡，解剖由一人进行)。统计各组平均瘤重和除瘤后鼠重，组间比较。
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4.取局部肿瘤甲醛固定，常规透明、浸蜡、包埋、切片，Feulgen染色、嗜银染色。
5.将Feulgen染色切片在高倍镜(10×40)下观察细胞核，选择无重叠者为测试对象，由图像分析仪测肿瘤细胞核的面积、周长、平均直径、形状因子、积分光密度5项参数。每张切片测100个肿瘤细胞核[7]，计算每组各参数的平均值±标准差，然后组间比较，得出P值。
6.将嗜银染色切片在油镜(10×100)下随机观察2个视野，由图像分析仪测平均每个视野核、颗粒的数目，单个颗粒的面积、周长、平均直径、形状因子、数密度、面密度、AgNORs计数9个参数。公式计算如下：
形状因子=周长2/4π×面积
数密度=AgNORs颗粒数/视野面积
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面密度=AgNORs颗粒数×颗粒面积/视野面积
AgNORs计数=AgNORs颗粒数/胞核数
经计算，得出每组各参数的平均值±标准差，组间比较，得出P值。
7.统计学处理：用SAS统计包进行方差分析，再进行student's-T-Test。
结 果
对照组由Ⅰa、Ⅰb两种条件对照组成，两者各参数经统计学处理，差异无显著性(P>0.05)，故并为一组。
一、四组肿瘤体积的动态变化和生长曲线
, 百拇医药
接种肿瘤后第5天左右，各组小鼠开始出现可触摸的瘤结节，按不同的处理因素于接种肿瘤后第7、9、11、13、15、17天测量肿瘤体积(见表1)。
表1 肿瘤体积动态变化(
±s cm3) 组别接种后天数
第7天
第9天
第11天
第13天
第15天
第17天
, 百拇医药 Ⅰ
0.066±0.008
0.194±0.014
0.548±0.022
1.012±0.012
1.507±0.008
2.007±0.006
Ⅱ
0.058±0.005
0.132±0.005
0.282±0.005
0.710±0.004
, http://www.100md.com
1.069±0.006
1.534±0.007
Ⅲ
0.042±0.004
0.061±0.004
0.092±0.007
0.196±0.015
0.292±0.006
0.404±0.010
Ⅳ
0.030±0.011
0.041±0.022
, http://www.100md.com
0.072±0.041
0.152±0.086
0.210±0.119
0.322±0.142
根据肿瘤体积的动态变化绘制时间-体积生长曲线(见图1)。
图1 各组肿瘤生长曲线
从图中可看出，Ⅰ组肿瘤生长速度最快，表现为曲线陡直，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组肿瘤生长速度均受不同程度的抑制，曲线变缓，其中Ⅳ组最为明显。
二、四组小鼠的平均瘤重和除瘤后鼠重
接种肿瘤后第18天，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组肿瘤的平均重量分别为(2.833±0.074) g,(2.060±0.080) g，(0.588±0.040) g，(0.420±0.188) g；各用药组与对照组比较：Ⅲ、Ⅳ组比Ⅰ组、Ⅱ组瘤重明显减轻(P<0.01)，Ⅱ组比Ⅰ组瘤重减轻(P<0.05)。Ⅳ组比Ⅲ组瘤重减轻(P<0.05)。提示紫杉醇与IL-4合用疗效最好，单一用药组紫杉醇的疗效较好。
, 百拇医药
用药前(接种后第4天)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组鼠重均值差异无显著性(P>0.05)。接种肿瘤后第18天，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组除瘤后鼠重分别为(34.805±3.012)g，(35.002±3.001) g，(22.673±2.801) g,(28.045±3.017) g。Ⅲ、Ⅳ组比Ⅰ、Ⅱ组除瘤后鼠重明显减轻(P<0.01)，Ⅳ组比Ⅲ组除瘤后鼠重加增(P<0.05)。提示鼠重减轻可能与药物毒性有关，紫杉醇单用毒性较大，与IL-4合用毒性减轻。
三、Lewis肺癌细胞形态测量和DNA含量测定
组织切片Feulgen染色，核呈深红色，胞浆不着色。Ⅰ组核大，多呈空泡状，染色质聚集成块，核分布紧密，核浆比例大。用药组，核缩小，染色质均匀分布，核间隙增宽，核浆比例缩小。从Ⅰ组至Ⅳ组，核面积、周长、平均直径、积分光密度均依次减少，而形状因子均依次增大。提示用药后肿瘤细胞体积缩小，生长受抑制，核DNA含量(积分光密度值)降低，肿瘤细胞核增殖能力减弱(见表2)。
, 百拇医药
表2 不同组间核形态参数和DNA含量结果(
±s)Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
面积(μm2)
37.037±7.027
24.202±5.012
18.373±4.833
16.664±4.671
, 百拇医药 周长(μm)
22.762±4.312
18.625±4.180
16.522±2.518
15.901±2.700
平均直径(μm)
3.136±0.351
2.642±0.291
2.401±0.288
2.283±0.308
形状因子
, 百拇医药 1.113±0.065
1.141±0.075
1.186±0.081
1.207±0.084
积分光密度
4.294±0.992
3.412±0.910
3.096±0.771
2.707±0.807
P<0.05 Ⅱ：Ⅰ，Ⅳ：Ⅲ；P<0.01，Ⅲ、Ⅳ：Ⅰ、Ⅱ 四、AgNORs颗粒计数测定
组织切片银染，细胞核呈淡黄色，AgNORs呈棕褐色颗粒状。AgNORs颗粒多为弥散型，少见单一型和混合型。从第Ⅰ组至第Ⅳ组，胞核的数目，颗粒的面积、周长、平均直径均依次增大，而其它各参数均依次减小。以上参数各用药组与对照组比较：Ⅱ与Ⅰ比，差异有显著性(P<0.05)；Ⅲ、Ⅳ与Ⅰ比，差异有高度显著性(P<0.01)。Ⅳ与Ⅲ，差异有显著性(P<0.05)。说明从Ⅰ组至Ⅳ组，平均每个视野胞核的数目增多，胞核的体积就相对缩小，肿瘤细胞生长受到抑制，而AgNORs颗粒的体积逐渐增大，AgNORs计数逐渐减小(见封三图1，2)(见表3)。
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五、核DNA含量与AgNORs计数呈正相关
表1、2示，从Ⅰ组至Ⅳ组，DNA含量(积分光密度值)依次减少，AgNORs计数亦依次减小。DNA含量高的组别，其AgNORs计数亦高，反之亦然。经统计学处理，两者呈直线正相关，r为0.9611，P<0.01。
讨 论
一、IL-4对紫杉醇抑瘤作用的影响
本实验从肿瘤的体积、生长曲线和瘤重三方面看，IL-4、紫杉醇均有抑瘤作用，Ⅲ、Ⅳ与Ⅰ组比，差异有高度显著性(P<0.01)，Ⅱ组与Ⅰ组比，差异有显著性(P<0.05)，IL-4、紫杉醇联用比单用抑瘤更明显(P<0.05)，说明两者在抑瘤方面具协同效应。Ⅲ组在实验中于接种后第7、8天各有一只动物死亡，且该组小鼠比其它组明显消瘦(P<0.01)，说明紫杉醇有一定的毒副作用，两者联用除瘤后鼠重Ⅳ组比Ⅲ组增加，差异有显著性(P<0.05)，且无动物死亡，说明紫杉醇的毒副作用有所降低，这可能与实验中紫杉醇剂量减半有关，也可能是IL-4降低了紫杉醇的毒副作用。
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表3 不同组间AgNORs颗粒测定结果(
±s)Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
X1
5.500±1.195
6.700±2.214
7.200±2.486
8.763±2.997
X2
, 百拇医药
41.993±6.960
35.597±4.880
19.224±3.858
13.600±2.169
X3(μm2)
0.675±0.112
0.744±0.118
1.130±0.252
1.767±0.371
X4(μm)
3.119±0.378
, 百拇医药
3.236±0.390
3.813±0.501
4.674±0.751
X5(μm)
0.437±0.026
0.501±0.030
0.581±0.031
0.665±0.034
X6
1.147±0.152
1.120±0.035
, 百拇医药
1.024±0.059
0.984±0.066
Z(×10-3)
7.673±2.506
7.170±2.365
5.880±1.613
6.505±2.112
Y(×10-3)
11.370±2.076
9.363±2.007
5.204±1.683
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3.681±1.136
P
7.635±1.160
5.313±0.820
2.670±0.401
1.552±0.316
注：X1：平均每个视野胞核的数目 X2：平均每个视野颗粒的数目X3颗粒的面积 X4颗粒的周长 X5颗粒的平均直径 X6颗粒的形状因子
Z：颗粒的数密度 Y：颗粒的面密度 P：AgNORs计数
, http://www.100md.com 其中X6=X24/4π*X3 Z=X2*X3/一个视野的面积(3694.18) Y=X2/3694.18 P=X2/X1
P<0.05 Ⅱ∶Ⅰ，Ⅳ∶Ⅲ；P<0.01 Ⅲ、Ⅳ∶Ⅰ、Ⅱ
二、Lewis肺癌细胞核形态测量与DNA含量测定的意义
药物对肿瘤的疗效在组织切片主要反映在细胞核上。细胞核 形态参数的均值反映了细胞核的大小，DNA含量则反映了肿瘤细胞的增殖特点。本实验显示使用IL-4、紫杉醇后肿瘤细胞核形态、DNA含量5个参数的改变。各用药组与对照组比，各用药组之间差异亦均有显著性(P<0.05)，因此肿瘤细胞核形态测量和DNA含量测定是判断肿瘤生长情况，分化程度及预后的一个重要指标。
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三、AgNORs计数在Lewis肺癌中的意义
本实验从Ⅰ组至Ⅳ组，AgNORs计数依次减少，各组间差异均有显著性(P<0.05)，AgNORs计数对良恶性肿瘤的鉴别已有大量的报道，是判别良恶性肿瘤的一个重要指标。本实验对AgNORs颗粒的大小进行了测量，从Ⅰ组至Ⅳ组，反映颗粒大小的几个参数如面积、周长、平均直径均依次增大，且各组间差异有显著性(P<0.05)，特别是镜下发现对照组AgNORs颗粒以弥散型为主，使用抑癌药后AgNORs颗粒单一型和混合型增多，单一型越多，疗效越好。AgNORs颗粒的大小与分型对于判断肿瘤的疗效、预后可能具有重要参考价值。
四、细胞核形态参数、DNA含量与AgNORs计数的关系
细胞核形态参数反映了细胞核的大小，DNA含量和AgNORs计数均反映了肿瘤细胞增殖特点，它们分别从静态和动态对Lewis肺癌的生长与分化提高信息，本实验显示它们之间有良好的相关性，肿瘤细胞核越大，DNA含量越高，AgNORs计数越多，将三者结合起来分析Lewis肺癌的性质，具有一定的实用价值。
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基金项目：湖北省自然科学基金(94J080)，湖北省科委重点科研课题(962P1106)湖北省教委重点科研课题[G9404(A015)]资助
胡雪峰，男，硕士，讲师。
参考文献
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(收稿日期：1999-11-12), http://www.100md.com