肺耐药蛋白基因表达与肺癌临床病理生理特征的关系
作者：张予辉 王辰 庞宝森 张洪玉 刘敬忠 肖白
单位：张予辉 王辰 庞宝森 张洪玉(首都医科大学附属北京红十字朝阳医院呼吸疾病研究中心 北京，100020)刘敬忠 肖白(基础中心)
关键词：肺肿瘤；抗药性；基因表达；肺耐药蛋白
中国肺癌杂志000615 【摘要】目的 探讨肺耐药蛋白(LRP)基因表达与肺癌临床病理生理特征的关系。方法 采用逆转录—多聚酶链反应(RT-PCR)方法，检测49例肺癌组织和相应的41例癌旁肺组织中LRP基因表达水平。结果 肺癌与癌旁肺组织中均有LRP基因表达，两者的阳性率分别为63.3%(31/49)和21.9%(9/41)，具有显著性差异(P<0.01)；非小细胞肺癌LRP表达阳性率(70.7%，29/41)高于小细胞肺癌(25%，2/8)(P<0.05)，腺癌(91.7%，11/12)表达阳性率高于鳞癌(50%，11/22)(P<0.05)；吸烟患者的LRP基因表达(74.3%，26/35)显著高于非吸烟患者(35.7%，5/14)(P<0.05)。结论 LRP基因表达与肺癌耐药有关，吸烟可导致LRP基因表达增加。
, http://www.100md.com
【中图分类号】R734.2
Relationship between expression of lung resistance protein gene and clinical pathophysiological characteristics of lung cancer
ZHANG Yuhui,WANG Chen,PANG Baosen,ZHANG Hongyu,LIU Jinzhong,XIAO Bai
(Respiratory Disease Research Center,Beijing Red-Cross Chaoyang Hospital Affiliated to Capital University of Medical Science,Beijing 100020,P.R.China)
, http://www.100md.com 【Abstract】Objective To study the relationship between lung resistance protein gene (LRP) expression and clinical pathophysiological characteristics of lung cancer.Methods Expression of LRP gene was determined in 49 lung cancer samples and 41 corresponding paracancerous tissues by RT-PCR.Results LRP was expressed in lung cancers and corresponding paracancerous tissues.The positive expression rate was 63.3%(31/49)in cancer tissues and 21.9% (9/41) in corresponding paracancerous tissues respectively (P<0.01).The positive rate in NSCLC (29/41，70.7%)was significantly higher than that in SCLC (2/8，25%)(P<0.05),and the positive rate in adenocarcinoma (11/12，91.7%) was also remarkably higher than that in squamous cell carcinoma (11/22，50%)(P<0.05).In addition,LRP expression in the smokers (26/35，74.3%) was significantly higher than that in the non-smokers (5/14，35.7%)(P<0.05).Conclusion The expression of LRP may be related to drug resistance of lung cancer,and smoking may increase LRP gene expression.
, http://www.100md.com
【Key words】Lung neoplasms Drug resistance Gene expression Lung resistance protein
研究表明，肺癌的耐药机制非常复杂，与耐药基因MDR1、MRP，拓扑异构酶Ⅱ质和量的改变，谷胱甘肽转移酶π与硫蛋白等多因素有关。吸烟与肺癌发生有关，但与肺癌耐药的关系鲜有报道。近年从肺癌耐药细胞株中发现一新的基因，肺耐药蛋白基因(lung resistance protein，LRP)，初步研究表明其与肿瘤耐药有关[1]。我们应用RT-PCR 方法检测49例人肺癌组织及相应的41例癌旁肺组织中LRP基因表达，探讨其在人肺癌组织中的表达及与肺癌临床病理生理特征的关系。
1 材料与方法
1.1 临床资料 49例原发性肺癌组织及相应的远离癌组织的正常肺组织，均经病理学确诊。手术后1～3小时获得，-70℃冰箱保存。其中男35例，女14例，年龄为36～71岁，平均年龄53.5岁。吸烟者35例，且吸烟指数(每日吸烟支数×吸烟年数)均>200，不吸烟者14例。术前均未作过放疗和化疗。
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1.2 RNA的提取和鉴定 取200?mg肺组织，采用异硫氰酸胍一步法抽提总RNA，紫外分光光度计检测260?nm和280?nm下的光密度值(OD)，若OD260/OD280>2，说明所提取RNA无蛋白质和DNA污染，0.7%琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见清晰的18S和28S两条带型，说明RNA未降解。
1.3 cDNA的合成 20?μl逆转录反应体系，含10?μg待测RNA，200?u M-MLV逆转录酶，10?mmol/L NTPs 200?ng 6?nt随机引物等，37℃?1小时，97℃?7分钟灭活M-MLV，-20℃保存备用。
1.4 PCR扩增 LRP引物序列参见文献2，即5′-TTCTGGATTTGGTGGACGC-3′和5′-ACTTCTCTCCCTTGACCAC-3′。
30?μl PCR反应体系，加入LRP与内参β2-MG上、下游引物各25?pmol，1?U Tag酶，2?μl cDNA等。扩增条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，30个循环，72℃延伸5分钟，得到LRP 285?bp和β2-MG 120?bp的扩增产物。
, 百拇医药
1.5 cDNA的电泳、照相、定量 取扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳40分钟，紫外灯下照相，然后行光密度扫描，以β2-MG为内参，以LRP cDNA/β2-MG cDNA的比值来表示LRP mRNA的表达水平。
1.6 随访分析 对每个患者建立随访登记表，随访时间从肺癌手术后第1日开始，定期随访患者生存状况，并记录死亡时间、死亡原因及失访时间。
1.7 统计学处理 采用χ2检验，确切概率法。应用SPSS软件(7.0)行Kaplan-Meier生存率计算及Log-rank检验。
2 结果
2.1 LRP-mRNA表达与肺癌临床病理和吸烟的关系 LRP基因在肺癌癌组织与癌旁肺组织中均有表达，两者的表达阳性率分别为63.3%(31/49)与21.9%(9/41)，LRP/β2-MG平均值分别为0.55±0.45和0.25±0.42，具有显著性差异(P<0.01)。LRP-mRNA表达与肺癌组织学类型、病理分级、临床分期及吸烟的关系见表1。
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表1 LRP-mRNA表达与肺癌临床病理生理特征的关系
Tab 1 The relation between LRP-mRNA expression and clinical pathophysiological characteristics of lung cancer Characteristics
No.of cases
No.of cases with LRP expression
LRP expression level (
±s)
Histology
Non-small cell lung cancer
, http://www.100md.com
41
29
0.57±0.45
Adenocarcinoma
12
11
0.64±0.45
Squamous cell carcinoma
22
11
0.46±0.50
Adenosquamous carcinoma
, 百拇医药
3
3
0.57±0.40
Alveolar carcinoma
4
4
0.95±0.46
Small cell lung cancer
8
2
0.27±0.48
Pathologic Grade
, 百拇医药
High Differentiation
8
6
0.56±0.41
Middle and low differentiation
41
25
0.56±0.50
Clinical stage
Stage Ⅰ
17
13
, 百拇医药
0.53±0.46
Stage Ⅱ
12
9
0.50±0.42
Stage Ⅲ
20
9
0.56±0.54
Smoking
Smokers
35
26
, http://www.100md.com
0.69±0.42
Non-smoker
14
5
0.31±0.45
注：腺癌与鳞癌的LRP表达水平比较，小细胞肺癌与非小细胞肺癌比较，吸烟者与非吸烟者比较，P值均<0.05。
Note: The LRP expression level was calculated by the optical density ratio between LRP cDNA and β2-MG cDNA.The significant difference of LRP expression level was observed between adenocarcinoma and squamous cell carcinoma,small cell lung cancer and non-small cell lung cancer,and smokers and non-smokers (P<0.05).
, http://www.100md.com
2.2 LRP-mRNA表达与肺癌复发和预后的关系 随访两年，肺癌复发者有33例，其中LRP阳性者为23例，占69.7%；16例无复发者中LRP阳性8例，占50%，两组间的差异无显著性(P>0.05)。LRP-mRNA表达与肺癌预后的关系见表2，虽然LRP阴性组的生存率较阳性组有升高趋势，但Log-rank检验显示无显著性差异(P>0.05)(图1)。
表2 LRP-mRNA表达与肺癌预后的关系
Tab 2 The relation between LRP-mRNA expression
and prognosis of lung cancer LRP expression
No.of cases
Accumulative survival
, 百拇医药
P value
1-year
2-year
Negative
Positive
18
31
71.7%
51.7%
49.1%
30.7%
>0.05
, 百拇医药
图1 LRP-mRNA表达与肺癌预后的关系
Fig 1 The Kaplan-Meier survival curves of patients with lung cancer with different LRP-mRNA expression
3 讨论
LRP基因是从一株起源于人NSCLC耐阿霉素的细胞株SW1573/2R120中被克隆的新的基因。该基因定位于16号染色体p13区1带与p11区2带间，编码一分子量110×103?u的蛋白，该蛋白是人体主要的穹窿蛋白，与聚泡相关的细胞质微粒体。Scheper等[3]应用免疫组化法研究发现，在肺癌SW1573/2R120、GLC4/ADR、纤维肉瘤HT1080DR4、白血病8226/MR40等具有MDR表型的细胞株中无P-gp表达，而LRP过度表达，从而推测LRP与耐药有关。List等[4]研究了87例急性白血病患者，发现LRP表达阳性与阴性率分别为37%和63%，两组化疗缓解率分别为68%与35%，具有显著性差异(P<0.05)，应用Logistic回归分析，表明LRP是唯一独立反映患者预后的因素，提示LRP表达与急性白血病化疗耐药有关，检测LRP可预计化疗效果和预后。
, http://www.100md.com
我们应用RT-CPR方法检测了49例术前未经化疗、放疗肺癌细胞组织与相应的癌旁5?cm以远肺组织中LRP-mRNA表达，发现前者的表达阳性率和强度高于后者，与Sugawara等[2]研究相符，推测LRP表达可能是肺癌天然耐药的分子生物学基础。肺泡癌、腺鳞癌的LRP 表达阳性率均为100%，其中肺泡癌的表达强度在4种类型的肺癌组织中最强，但由于肺泡癌、腺鳞癌例数太少，未作统计分析，有待进一步探讨。腺癌LRP阳性率和强度高于鳞癌，与临床上鳞癌较腺癌化疗敏感相符，推测LRP表达与肺癌耐药有关。在不同病理分级、不同临床分期的肺癌组织中LRP-mANA表达无显著性差异，推测在不同病理分级与临床分期的肺癌耐药机制中，LRP基因表达可能不起主导作用，而另有其他机制。
我们同时发现吸烟组LRP阳性率和强度高于不吸烟组，具有显著性差异，推测吸烟可导致LRP基因表达增加，与肺癌耐药有关。这提醒我们在制订化疗方案时，对吸烟的肺癌患者应考虑耐药性存在的可能。
, 百拇医药
对49例患者进行随访，LRP基因表达阳性组复发率高于阴性组，1年和2年累计生存率及生存趋势低于阴性组，但均无显著性差异。提示肺癌预后可能受多因素的影响。
参考文献
1，Cole SPC,Bhardwaj G,Gerlach JH,et al.Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line.Science,1992,258(3)∶1650-1654.
2，Sugawara I,Akiyama S,Scheper RJ,et al.Lung resistance protein (LRP) expression in human normal tissues in comparison with that of MDR1 and MRP.Cancer Lett,1997,112(1)∶23-31.
, 百拇医药
3，Scheper RJ,Broxterman HT,Scheffer GL,et al.Overexpression of a Mr110,000 vesicular protein in Non-P-glycoprotein-mediated multidrug resistance.Cancer Res,1993,53(4)∶1475-1479.
4，List AF,Spier CS,Gragan TM,et al.Overexpression of the major vault transportor protein lung resistance protein predicts treatment outcome in acute myeloid leukemia.Blood,1996,87(6)∶2464-2469.
收稿日期：1999-11-17
修回日期：2000-03-29, 百拇医药
单位：张予辉 王辰 庞宝森 张洪玉(首都医科大学附属北京红十字朝阳医院呼吸疾病研究中心 北京，100020)刘敬忠 肖白(基础中心)
关键词：肺肿瘤；抗药性；基因表达；肺耐药蛋白
中国肺癌杂志000615 【摘要】目的 探讨肺耐药蛋白(LRP)基因表达与肺癌临床病理生理特征的关系。方法 采用逆转录—多聚酶链反应(RT-PCR)方法，检测49例肺癌组织和相应的41例癌旁肺组织中LRP基因表达水平。结果 肺癌与癌旁肺组织中均有LRP基因表达，两者的阳性率分别为63.3%(31/49)和21.9%(9/41)，具有显著性差异(P<0.01)；非小细胞肺癌LRP表达阳性率(70.7%，29/41)高于小细胞肺癌(25%，2/8)(P<0.05)，腺癌(91.7%，11/12)表达阳性率高于鳞癌(50%，11/22)(P<0.05)；吸烟患者的LRP基因表达(74.3%，26/35)显著高于非吸烟患者(35.7%，5/14)(P<0.05)。结论 LRP基因表达与肺癌耐药有关，吸烟可导致LRP基因表达增加。
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【中图分类号】R734.2
Relationship between expression of lung resistance protein gene and clinical pathophysiological characteristics of lung cancer
ZHANG Yuhui,WANG Chen,PANG Baosen,ZHANG Hongyu,LIU Jinzhong,XIAO Bai
(Respiratory Disease Research Center,Beijing Red-Cross Chaoyang Hospital Affiliated to Capital University of Medical Science,Beijing 100020,P.R.China)
, http://www.100md.com 【Abstract】Objective To study the relationship between lung resistance protein gene (LRP) expression and clinical pathophysiological characteristics of lung cancer.Methods Expression of LRP gene was determined in 49 lung cancer samples and 41 corresponding paracancerous tissues by RT-PCR.Results LRP was expressed in lung cancers and corresponding paracancerous tissues.The positive expression rate was 63.3%(31/49)in cancer tissues and 21.9% (9/41) in corresponding paracancerous tissues respectively (P<0.01).The positive rate in NSCLC (29/41，70.7%)was significantly higher than that in SCLC (2/8，25%)(P<0.05),and the positive rate in adenocarcinoma (11/12，91.7%) was also remarkably higher than that in squamous cell carcinoma (11/22，50%)(P<0.05).In addition,LRP expression in the smokers (26/35，74.3%) was significantly higher than that in the non-smokers (5/14，35.7%)(P<0.05).Conclusion The expression of LRP may be related to drug resistance of lung cancer,and smoking may increase LRP gene expression.
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【Key words】Lung neoplasms Drug resistance Gene expression Lung resistance protein
研究表明，肺癌的耐药机制非常复杂，与耐药基因MDR1、MRP，拓扑异构酶Ⅱ质和量的改变，谷胱甘肽转移酶π与硫蛋白等多因素有关。吸烟与肺癌发生有关，但与肺癌耐药的关系鲜有报道。近年从肺癌耐药细胞株中发现一新的基因，肺耐药蛋白基因(lung resistance protein，LRP)，初步研究表明其与肿瘤耐药有关[1]。我们应用RT-PCR 方法检测49例人肺癌组织及相应的41例癌旁肺组织中LRP基因表达，探讨其在人肺癌组织中的表达及与肺癌临床病理生理特征的关系。
1 材料与方法
1.1 临床资料 49例原发性肺癌组织及相应的远离癌组织的正常肺组织，均经病理学确诊。手术后1～3小时获得，-70℃冰箱保存。其中男35例，女14例，年龄为36～71岁，平均年龄53.5岁。吸烟者35例，且吸烟指数(每日吸烟支数×吸烟年数)均>200，不吸烟者14例。术前均未作过放疗和化疗。
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1.2 RNA的提取和鉴定 取200?mg肺组织，采用异硫氰酸胍一步法抽提总RNA，紫外分光光度计检测260?nm和280?nm下的光密度值(OD)，若OD260/OD280>2，说明所提取RNA无蛋白质和DNA污染，0.7%琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见清晰的18S和28S两条带型，说明RNA未降解。
1.3 cDNA的合成 20?μl逆转录反应体系，含10?μg待测RNA，200?u M-MLV逆转录酶，10?mmol/L NTPs 200?ng 6?nt随机引物等，37℃?1小时，97℃?7分钟灭活M-MLV，-20℃保存备用。
1.4 PCR扩增 LRP引物序列参见文献2，即5′-TTCTGGATTTGGTGGACGC-3′和5′-ACTTCTCTCCCTTGACCAC-3′。
30?μl PCR反应体系，加入LRP与内参β2-MG上、下游引物各25?pmol，1?U Tag酶，2?μl cDNA等。扩增条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，30个循环，72℃延伸5分钟，得到LRP 285?bp和β2-MG 120?bp的扩增产物。
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1.5 cDNA的电泳、照相、定量 取扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳40分钟，紫外灯下照相，然后行光密度扫描，以β2-MG为内参，以LRP cDNA/β2-MG cDNA的比值来表示LRP mRNA的表达水平。
1.6 随访分析 对每个患者建立随访登记表，随访时间从肺癌手术后第1日开始，定期随访患者生存状况，并记录死亡时间、死亡原因及失访时间。
1.7 统计学处理 采用χ2检验，确切概率法。应用SPSS软件(7.0)行Kaplan-Meier生存率计算及Log-rank检验。
2 结果
2.1 LRP-mRNA表达与肺癌临床病理和吸烟的关系 LRP基因在肺癌癌组织与癌旁肺组织中均有表达，两者的表达阳性率分别为63.3%(31/49)与21.9%(9/41)，LRP/β2-MG平均值分别为0.55±0.45和0.25±0.42，具有显著性差异(P<0.01)。LRP-mRNA表达与肺癌组织学类型、病理分级、临床分期及吸烟的关系见表1。
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表1 LRP-mRNA表达与肺癌临床病理生理特征的关系
Tab 1 The relation between LRP-mRNA expression and clinical pathophysiological characteristics of lung cancer Characteristics
No.of cases
No.of cases with LRP expression
LRP expression level (
±s)Histology
Non-small cell lung cancer
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41
29
0.57±0.45
Adenocarcinoma
12
11
0.64±0.45
Squamous cell carcinoma
22
11
0.46±0.50
Adenosquamous carcinoma
, 百拇医药
3
3
0.57±0.40
Alveolar carcinoma
4
4
0.95±0.46
Small cell lung cancer
8
2
0.27±0.48
Pathologic Grade
, 百拇医药
High Differentiation
8
6
0.56±0.41
Middle and low differentiation
41
25
0.56±0.50
Clinical stage
Stage Ⅰ
17
13
, 百拇医药
0.53±0.46
Stage Ⅱ
12
9
0.50±0.42
Stage Ⅲ
20
9
0.56±0.54
Smoking
Smokers
35
26
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0.69±0.42
Non-smoker
14
5
0.31±0.45
注：腺癌与鳞癌的LRP表达水平比较，小细胞肺癌与非小细胞肺癌比较，吸烟者与非吸烟者比较，P值均<0.05。
Note: The LRP expression level was calculated by the optical density ratio between LRP cDNA and β2-MG cDNA.The significant difference of LRP expression level was observed between adenocarcinoma and squamous cell carcinoma,small cell lung cancer and non-small cell lung cancer,and smokers and non-smokers (P<0.05).
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2.2 LRP-mRNA表达与肺癌复发和预后的关系 随访两年，肺癌复发者有33例，其中LRP阳性者为23例，占69.7%；16例无复发者中LRP阳性8例，占50%，两组间的差异无显著性(P>0.05)。LRP-mRNA表达与肺癌预后的关系见表2，虽然LRP阴性组的生存率较阳性组有升高趋势，但Log-rank检验显示无显著性差异(P>0.05)(图1)。
表2 LRP-mRNA表达与肺癌预后的关系
Tab 2 The relation between LRP-mRNA expression
and prognosis of lung cancer LRP expression
No.of cases
Accumulative survival
, 百拇医药
P value
1-year
2-year
Negative
Positive
18
31
71.7%
51.7%
49.1%
30.7%
>0.05
, 百拇医药
图1 LRP-mRNA表达与肺癌预后的关系
Fig 1 The Kaplan-Meier survival curves of patients with lung cancer with different LRP-mRNA expression
3 讨论
LRP基因是从一株起源于人NSCLC耐阿霉素的细胞株SW1573/2R120中被克隆的新的基因。该基因定位于16号染色体p13区1带与p11区2带间，编码一分子量110×103?u的蛋白，该蛋白是人体主要的穹窿蛋白，与聚泡相关的细胞质微粒体。Scheper等[3]应用免疫组化法研究发现，在肺癌SW1573/2R120、GLC4/ADR、纤维肉瘤HT1080DR4、白血病8226/MR40等具有MDR表型的细胞株中无P-gp表达，而LRP过度表达，从而推测LRP与耐药有关。List等[4]研究了87例急性白血病患者，发现LRP表达阳性与阴性率分别为37%和63%，两组化疗缓解率分别为68%与35%，具有显著性差异(P<0.05)，应用Logistic回归分析，表明LRP是唯一独立反映患者预后的因素，提示LRP表达与急性白血病化疗耐药有关，检测LRP可预计化疗效果和预后。
, http://www.100md.com
我们应用RT-CPR方法检测了49例术前未经化疗、放疗肺癌细胞组织与相应的癌旁5?cm以远肺组织中LRP-mRNA表达，发现前者的表达阳性率和强度高于后者，与Sugawara等[2]研究相符，推测LRP表达可能是肺癌天然耐药的分子生物学基础。肺泡癌、腺鳞癌的LRP 表达阳性率均为100%，其中肺泡癌的表达强度在4种类型的肺癌组织中最强，但由于肺泡癌、腺鳞癌例数太少，未作统计分析，有待进一步探讨。腺癌LRP阳性率和强度高于鳞癌，与临床上鳞癌较腺癌化疗敏感相符，推测LRP表达与肺癌耐药有关。在不同病理分级、不同临床分期的肺癌组织中LRP-mANA表达无显著性差异，推测在不同病理分级与临床分期的肺癌耐药机制中，LRP基因表达可能不起主导作用，而另有其他机制。
我们同时发现吸烟组LRP阳性率和强度高于不吸烟组，具有显著性差异，推测吸烟可导致LRP基因表达增加，与肺癌耐药有关。这提醒我们在制订化疗方案时，对吸烟的肺癌患者应考虑耐药性存在的可能。
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对49例患者进行随访，LRP基因表达阳性组复发率高于阴性组，1年和2年累计生存率及生存趋势低于阴性组，但均无显著性差异。提示肺癌预后可能受多因素的影响。
参考文献
1，Cole SPC,Bhardwaj G,Gerlach JH,et al.Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line.Science,1992,258(3)∶1650-1654.
2，Sugawara I,Akiyama S,Scheper RJ,et al.Lung resistance protein (LRP) expression in human normal tissues in comparison with that of MDR1 and MRP.Cancer Lett,1997,112(1)∶23-31.
, 百拇医药
3，Scheper RJ,Broxterman HT,Scheffer GL,et al.Overexpression of a Mr110,000 vesicular protein in Non-P-glycoprotein-mediated multidrug resistance.Cancer Res,1993,53(4)∶1475-1479.
4，List AF,Spier CS,Gragan TM,et al.Overexpression of the major vault transportor protein lung resistance protein predicts treatment outcome in acute myeloid leukemia.Blood,1996,87(6)∶2464-2469.
收稿日期：1999-11-17
修回日期：2000-03-29, 百拇医药