p53基因突变与人非小细胞肺癌临床病理生理分析
作者：张容轩 郑颂国 高文 张敏 孔洁
单位：张容轩(上海市肺科医院病理科 200433)；郑颂国(上海医科大学肿瘤医院分子生物研究室)；高文 张敏 孔洁(上海市肺科医院病理科 200433)
关键词：非小细胞肺癌；p53基因；突变；多态性分析法
中国肺癌杂志000614 【摘要】目的 探讨p53基因点突变与人非小细胞肺癌临床病理生理特征的联系。方法 应用聚合酶反应-单链构象多态性分析方法(PCR-SSCP)检测原发性非小细胞肺癌癌组织的p53基因第5～8外显子点突变。结果 40例肺癌组织中19例(47.5%)有点突变发生，8例良性肿瘤组织均无p53基因点突变发生。点突变发生与病理分期和淋巴结转移有明显关系(P<0.025)。结论 p53基因点突变在非小细胞肺癌的发生和进展中可能起重要作用。
【中图分类号】R734.2
, 百拇医药
Analysis of the relationship between p53 gene mutation and clinical pathophysiological characteristics of primary non-small cell lung cancer
ZHANG Rongxuan,ZHENG Songguo,GAO Wen,ZHANG Min,KONG Jie
(Shanghai Pulmonary Hospital and Shanghai Medical University,Shanghai 200433,P.R.China)
【Abstract】Objective To investigate the significance of p53 gene mutations in non-small cell lung cancer,with focusing on the four highly conserved regions of the p53 gene.Methods Point mutations of the p53 gene were detected in 40 lung cancer tissues and 8 benign pulmonary lesions as control by polymerase chain reaction--single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) analysis.Results Mutations of the p53 gene were found in 19 of 40 lung cancer samples (47.5%).The frequency of the p53 gene mutations varied among the different stage (stage Ⅰ+Ⅱ vs stage Ⅲ+Ⅳ was 22.2% vs 68.2%,P<0.005),and lymph node netastasis status (N1-2 vs N0 was 57.1% vs 16.7%,P<0.025) of non-small cell lung cancers.Conclusion The results suggest that p53 gene mutations may be associated with the carcinogenesis and progression of non-small cell lung cancer.
, 百拇医药
【Key words】Non-small cell lung cancer p53 gene Mutation SSCP analysis
p53基因研究已成为近年来医学生物学的热点课题之一，约50%的人类肿瘤有p53基因突变[1～3]。在原发性肺癌中，无论小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)还是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)均有肯定的p53基因突变发生[4，5]。我们采用银染聚合酶链反应-单链构象多态分析法(polymerase chain reaction--single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)，检测40例NSCLC癌组织和8例肺良性疾病组织p53基因的突变，以探讨p53 基因点突变在NSCLC的发生和临床进程中的价值。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 标本来源 收集上海市肺科医院病理科1995年原发性肺癌手术切除标本40例，其中鳞癌20例，腺癌20例；年龄范围33～71岁，中位年龄60岁；≥50岁30例，50岁10例；男性30例，女性10例；Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期分别为18例和22例；伴有淋巴结或远处转移者28例，不伴有转移者12例。另取良性肿瘤8例(包括炎性假瘤3例，错构瘤2例，硬化性血管瘤2例，肺泡Ⅱ型上皮腺瘤1例)作对照，以上病例均按WHO肺部肿瘤组织学诊断标准进行诊断。
1.2 方法 采用改良的银染SSCP法，具体方法如下：石蜡包埋组织块切成6～8 μm厚的薄片2张，置入2 ml eppendorft管中，常规二甲苯脱蜡，系列乙醇梯度水化，12 000 r/min下离心5分钟，室温下干燥数分钟，加1 ml SSC消化液(3 mol/L NaCl，0.3 mol/L柠檬酸钠*H2O，600 ml双蒸水，用1 mol/L HCl调至pH7.0后加双蒸水至1 L，用时再稀释20倍)，另加1% SDS和200 μg/ml的蛋白酶K，置37℃水浴过夜。等体积饱和酚抽提1次，氯仿-异戊醇(24∶1)抽提2次，加醋酸钠至0.3 mol/L，用2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀过夜。12 000 r/min下离心15分钟，加50 μl TE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA，pH7.8)溶解DNA(紫外分光光度计测定DNA含量)，置4℃冰箱保存备用。取1 μl约200 ng DNA作为PCR反应模板。本实验共设计了4套寡聚核苷酸引物以扩增p53基因外显子(exon)，具体引物及待扩增片段大小如下所示：
, 百拇医药
exon 5：5′-TTCCTCTTCCTGCAGTACTCC-3′
5′-GCCCCAGCTGCTCACCATCG-3′
exon 6：5′-CACTGATTGCTCTTAGGTCG-3′
5′-AGTTGCAAACCAGACCTCAGG-3′
exon 7：5′-TCTCCTAGGTTGGCTCTGAC-3′
5′-CAAGTGGCTCCTGACCTGGA-3′
exon 8：5′-CCTAATCCTGAGTAGTGGTAA-3′
5′-GTCCTGCTTGCTTACCTCG-3′
, 百拇医药
30 μl PCR 反应体系包括模板1.0 μl(约200 ng DNA)，Tag DNA聚合酶1.5单位，10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2 ，200 μmol/L dNTP和每对引物50 pmol/L，加入灭菌液体石蜡油防蒸发。94℃预变性10分钟，置冰块上，加入Tag酶，然后5 000 r/min离心30秒，置于美国Perkin-Elmer 480 DNA thermal cycler上开始扩增，进行40个循环(94℃×30秒，57℃×60秒，72℃×30秒)后72℃延伸5分钟，置冰上。SSCP分析在Orita等[6]报道的基础上加以改进，即取PCR产物3.5 μl加入SSCP上样缓冲液(95%甲酰胺，5 mol/L NaCl，0.1%溴酚兰，0.1%二甲苯氰兰和10 mmol/L EDTA)10 μl混匀，煮沸加热5分钟，冰上骤冷，8%的聚丙烯酰胺凝胶孔中电泳，电泳缓冲液1×TBE，电泳条件为室温下，180 V，约3小时。电泳结束后银染显示DNA带纹。每1例标本取相应正常肺组织作为内对照。
, http://www.100md.com
2 结果
40例肺癌中，19例(47.5%)有点突变发生，其中exon 5突变10例，exon 6突变3例，exon 8突变6例。不同分期和淋巴结转移状态组的p53基因点突变情况见表1，分期晚者p53基因突变率显著高于分期早者(P<0.005)，而有淋巴结转移者的突变率亦显著高于无淋巴结转移者(P<0.025)。
3 讨论
p53基因位于人类17号染色体短臂上(17p13.1)，编码一种分子量为53×103 u的核结合蛋白。p53蛋白的主要生物学功能是引起细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡，促进细胞分化。除G1期阻滞外，p53还可使细胞阻滞在G2期。此外，促进细胞终末分化可能是p53起抑癌基因作用的又一机制。肿瘤组织中p53的改变主要有突变、基因缺失和基因重组。最常见的p53基因突变为点突变。当基因发生突变时即由野生型变成了突变型，伴随基因突变而来的是p53肿瘤抑制功能的丧失和致癌功能的获得。
, http://www.100md.com
表1 p53基因点突变与肺癌临床病理特征的关系
Fig 1 The relationship between p53 gene mutations and
clinicopathological characteristics of non-small cell lung cancer Characteristics
No.of cases
No.of cases with
p53 gene mutations
(positive rate)
Pathological stage
, http://www.100md.com
Ⅰ+Ⅱ
18
4(22.2%)
Ⅲ+Ⅳ
22
15(68.2%)
Lymph node metastasis
N1-2
28
16(57.1%)
N0
12
2(16.7%)
, 百拇医药
p53基因突变常用的检测方法有免疫组化、PCR-SSCP、梯度变性剂凝胶电泳序列分析及化学酶切法。我们曾经运用免疫组化法监测p53基因，发现该方法阳性率偏高[1]。这是因为p53蛋白的半衰期很短，在肿瘤组织中检测到的p53可以看作是突变后的p53；但病毒癌蛋白可使p53稳定性增加，使其半衰期延长。因此免疫组化阳性不一定全部代表p53基因突变。PCR-SSCP法是又一广泛应用的检测p53基因突变的方法，其敏感性在80%～90%之间。本实验采用改良的银染PCR-SSCP法检测了40例NSCLC和8例肺良性肿瘤中p53基因突变情况，发现19例肺癌中有点突变发生，突变率为47.5%，与日本人群和美国人群相近[3]。统计分析发现有淋巴结转移组的点突变发生率(57.1%，16/28)明显高于无转移组(16.7%，2/12)(P<0.025)。
此外，随着病理分期的进展，p53基因突变发生率也有明显增高的趋势，Ⅲ～Ⅳ期患者突变率(68.2%，15/22)明显高于Ⅰ～Ⅱ期患者(22.2%，4/28)(P<0.005)。8例良性病变中无一例发生点突变，表明p53基因点突变与肺癌的发生、发展和转移有一定的相关性，并为肺癌的诊断和估计预后提供了一个有效的估计参数，同时也说明改良的银染PCR-SSCP法检测p53基因点突变的可靠性较好，比较适合于基层单位的推广应用。
, 百拇医药
参考文献
1，Koshland DE.Molecule of the year (editorial).Science,1993,262(5142)∶1953.
2，Takahash T,Nau MM,Chiba I,et al.p53: a frequent target for genetic abnormalities in lung cancer.Science，1989,246(4929)∶491-494.
3，Ogden GR,Hall PA.Field change,clonality,and early epithelial cancer: possible lesion from p53.J Pathol，1997,181(2)∶127-129.
4，Takahash T,Suzuki H,Hida T,et al.The p53 gene is very frequent mutated in small-cell lung cancer with distinct nucleotide substitution pattern.Oncogene，1991,6(10)∶1775-1778.
, 百拇医药
5，Chiba I,Takahashi T,Nau MM,et al.Mutations in the p53 gene are frequent in primary reseated non-small cell lung cancer.Oncogene，1990，5(10)∶1603-1610.
6，Orita M,Iwahana H,Kanazawa H,et al.Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophophoresis as single-stranded conformation polymophisms.Proc Natl Acad Sci USA，1989，86(8)∶2766-2770.
7，郑颂国，朱雄增，沈兆中，等.p53蛋白在原发性肺癌中过表达的临床病理意义.上海医科大学学报，1997，24∶262.
收稿日期：1999-10-25
修回日期：2000-02-19, 百拇医药
单位：张容轩(上海市肺科医院病理科 200433)；郑颂国(上海医科大学肿瘤医院分子生物研究室)；高文 张敏 孔洁(上海市肺科医院病理科 200433)
关键词：非小细胞肺癌；p53基因；突变；多态性分析法
中国肺癌杂志000614 【摘要】目的 探讨p53基因点突变与人非小细胞肺癌临床病理生理特征的联系。方法 应用聚合酶反应-单链构象多态性分析方法(PCR-SSCP)检测原发性非小细胞肺癌癌组织的p53基因第5～8外显子点突变。结果 40例肺癌组织中19例(47.5%)有点突变发生，8例良性肿瘤组织均无p53基因点突变发生。点突变发生与病理分期和淋巴结转移有明显关系(P<0.025)。结论 p53基因点突变在非小细胞肺癌的发生和进展中可能起重要作用。
【中图分类号】R734.2
, 百拇医药
Analysis of the relationship between p53 gene mutation and clinical pathophysiological characteristics of primary non-small cell lung cancer
ZHANG Rongxuan,ZHENG Songguo,GAO Wen,ZHANG Min,KONG Jie
(Shanghai Pulmonary Hospital and Shanghai Medical University,Shanghai 200433,P.R.China)
【Abstract】Objective To investigate the significance of p53 gene mutations in non-small cell lung cancer,with focusing on the four highly conserved regions of the p53 gene.Methods Point mutations of the p53 gene were detected in 40 lung cancer tissues and 8 benign pulmonary lesions as control by polymerase chain reaction--single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) analysis.Results Mutations of the p53 gene were found in 19 of 40 lung cancer samples (47.5%).The frequency of the p53 gene mutations varied among the different stage (stage Ⅰ+Ⅱ vs stage Ⅲ+Ⅳ was 22.2% vs 68.2%,P<0.005),and lymph node netastasis status (N1-2 vs N0 was 57.1% vs 16.7%,P<0.025) of non-small cell lung cancers.Conclusion The results suggest that p53 gene mutations may be associated with the carcinogenesis and progression of non-small cell lung cancer.
, 百拇医药
【Key words】Non-small cell lung cancer p53 gene Mutation SSCP analysis
p53基因研究已成为近年来医学生物学的热点课题之一，约50%的人类肿瘤有p53基因突变[1～3]。在原发性肺癌中，无论小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)还是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)均有肯定的p53基因突变发生[4，5]。我们采用银染聚合酶链反应-单链构象多态分析法(polymerase chain reaction--single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)，检测40例NSCLC癌组织和8例肺良性疾病组织p53基因的突变，以探讨p53 基因点突变在NSCLC的发生和临床进程中的价值。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 标本来源 收集上海市肺科医院病理科1995年原发性肺癌手术切除标本40例，其中鳞癌20例，腺癌20例；年龄范围33～71岁，中位年龄60岁；≥50岁30例，50岁10例；男性30例，女性10例；Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期分别为18例和22例；伴有淋巴结或远处转移者28例，不伴有转移者12例。另取良性肿瘤8例(包括炎性假瘤3例，错构瘤2例，硬化性血管瘤2例，肺泡Ⅱ型上皮腺瘤1例)作对照，以上病例均按WHO肺部肿瘤组织学诊断标准进行诊断。
1.2 方法 采用改良的银染SSCP法，具体方法如下：石蜡包埋组织块切成6～8 μm厚的薄片2张，置入2 ml eppendorft管中，常规二甲苯脱蜡，系列乙醇梯度水化，12 000 r/min下离心5分钟，室温下干燥数分钟，加1 ml SSC消化液(3 mol/L NaCl，0.3 mol/L柠檬酸钠*H2O，600 ml双蒸水，用1 mol/L HCl调至pH7.0后加双蒸水至1 L，用时再稀释20倍)，另加1% SDS和200 μg/ml的蛋白酶K，置37℃水浴过夜。等体积饱和酚抽提1次，氯仿-异戊醇(24∶1)抽提2次，加醋酸钠至0.3 mol/L，用2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀过夜。12 000 r/min下离心15分钟，加50 μl TE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA，pH7.8)溶解DNA(紫外分光光度计测定DNA含量)，置4℃冰箱保存备用。取1 μl约200 ng DNA作为PCR反应模板。本实验共设计了4套寡聚核苷酸引物以扩增p53基因外显子(exon)，具体引物及待扩增片段大小如下所示：
, 百拇医药
exon 5：5′-TTCCTCTTCCTGCAGTACTCC-3′
5′-GCCCCAGCTGCTCACCATCG-3′
exon 6：5′-CACTGATTGCTCTTAGGTCG-3′
5′-AGTTGCAAACCAGACCTCAGG-3′
exon 7：5′-TCTCCTAGGTTGGCTCTGAC-3′
5′-CAAGTGGCTCCTGACCTGGA-3′
exon 8：5′-CCTAATCCTGAGTAGTGGTAA-3′
5′-GTCCTGCTTGCTTACCTCG-3′
, 百拇医药
30 μl PCR 反应体系包括模板1.0 μl(约200 ng DNA)，Tag DNA聚合酶1.5单位，10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2 ，200 μmol/L dNTP和每对引物50 pmol/L，加入灭菌液体石蜡油防蒸发。94℃预变性10分钟，置冰块上，加入Tag酶，然后5 000 r/min离心30秒，置于美国Perkin-Elmer 480 DNA thermal cycler上开始扩增，进行40个循环(94℃×30秒，57℃×60秒，72℃×30秒)后72℃延伸5分钟，置冰上。SSCP分析在Orita等[6]报道的基础上加以改进，即取PCR产物3.5 μl加入SSCP上样缓冲液(95%甲酰胺，5 mol/L NaCl，0.1%溴酚兰，0.1%二甲苯氰兰和10 mmol/L EDTA)10 μl混匀，煮沸加热5分钟，冰上骤冷，8%的聚丙烯酰胺凝胶孔中电泳，电泳缓冲液1×TBE，电泳条件为室温下，180 V，约3小时。电泳结束后银染显示DNA带纹。每1例标本取相应正常肺组织作为内对照。
, http://www.100md.com
2 结果
40例肺癌中，19例(47.5%)有点突变发生，其中exon 5突变10例，exon 6突变3例，exon 8突变6例。不同分期和淋巴结转移状态组的p53基因点突变情况见表1，分期晚者p53基因突变率显著高于分期早者(P<0.005)，而有淋巴结转移者的突变率亦显著高于无淋巴结转移者(P<0.025)。
3 讨论
p53基因位于人类17号染色体短臂上(17p13.1)，编码一种分子量为53×103 u的核结合蛋白。p53蛋白的主要生物学功能是引起细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡，促进细胞分化。除G1期阻滞外，p53还可使细胞阻滞在G2期。此外，促进细胞终末分化可能是p53起抑癌基因作用的又一机制。肿瘤组织中p53的改变主要有突变、基因缺失和基因重组。最常见的p53基因突变为点突变。当基因发生突变时即由野生型变成了突变型，伴随基因突变而来的是p53肿瘤抑制功能的丧失和致癌功能的获得。
, http://www.100md.com
表1 p53基因点突变与肺癌临床病理特征的关系
Fig 1 The relationship between p53 gene mutations and
clinicopathological characteristics of non-small cell lung cancer Characteristics
No.of cases
No.of cases with
p53 gene mutations
(positive rate)
Pathological stage
, http://www.100md.com
Ⅰ+Ⅱ
18
4(22.2%)
Ⅲ+Ⅳ
22
15(68.2%)
Lymph node metastasis
N1-2
28
16(57.1%)
N0
12
2(16.7%)
, 百拇医药
p53基因突变常用的检测方法有免疫组化、PCR-SSCP、梯度变性剂凝胶电泳序列分析及化学酶切法。我们曾经运用免疫组化法监测p53基因，发现该方法阳性率偏高[1]。这是因为p53蛋白的半衰期很短，在肿瘤组织中检测到的p53可以看作是突变后的p53；但病毒癌蛋白可使p53稳定性增加，使其半衰期延长。因此免疫组化阳性不一定全部代表p53基因突变。PCR-SSCP法是又一广泛应用的检测p53基因突变的方法，其敏感性在80%～90%之间。本实验采用改良的银染PCR-SSCP法检测了40例NSCLC和8例肺良性肿瘤中p53基因突变情况，发现19例肺癌中有点突变发生，突变率为47.5%，与日本人群和美国人群相近[3]。统计分析发现有淋巴结转移组的点突变发生率(57.1%，16/28)明显高于无转移组(16.7%，2/12)(P<0.025)。
此外，随着病理分期的进展，p53基因突变发生率也有明显增高的趋势，Ⅲ～Ⅳ期患者突变率(68.2%，15/22)明显高于Ⅰ～Ⅱ期患者(22.2%，4/28)(P<0.005)。8例良性病变中无一例发生点突变，表明p53基因点突变与肺癌的发生、发展和转移有一定的相关性，并为肺癌的诊断和估计预后提供了一个有效的估计参数，同时也说明改良的银染PCR-SSCP法检测p53基因点突变的可靠性较好，比较适合于基层单位的推广应用。
, 百拇医药
参考文献
1，Koshland DE.Molecule of the year (editorial).Science,1993,262(5142)∶1953.
2，Takahash T,Nau MM,Chiba I,et al.p53: a frequent target for genetic abnormalities in lung cancer.Science，1989,246(4929)∶491-494.
3，Ogden GR,Hall PA.Field change,clonality,and early epithelial cancer: possible lesion from p53.J Pathol，1997,181(2)∶127-129.
4，Takahash T,Suzuki H,Hida T,et al.The p53 gene is very frequent mutated in small-cell lung cancer with distinct nucleotide substitution pattern.Oncogene，1991,6(10)∶1775-1778.
, 百拇医药
5，Chiba I,Takahashi T,Nau MM,et al.Mutations in the p53 gene are frequent in primary reseated non-small cell lung cancer.Oncogene，1990，5(10)∶1603-1610.
6，Orita M,Iwahana H,Kanazawa H,et al.Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophophoresis as single-stranded conformation polymophisms.Proc Natl Acad Sci USA，1989，86(8)∶2766-2770.
7，郑颂国，朱雄增，沈兆中，等.p53蛋白在原发性肺癌中过表达的临床病理意义.上海医科大学学报，1997，24∶262.
收稿日期：1999-10-25
修回日期：2000-02-19, 百拇医药