大鼠局灶性脑缺血—再灌注损伤组织病理及超微结构研究
作者：张俊玲 丰宏林 蒋传路
单位：张俊玲(北京天坛医院保健科，100050)；丰宏林 蒋传路(哈尔滨医科大学第一临床医学院神经科)
关键词：局灶脑缺血；再灌注脑损伤；病理学；细胞凋亡
中国急救医学000602 [摘 要] 目的 为探讨脑缺血—再灌注损伤病理机制进行实验性研究。方法 应用鼠大脑中动脉局灶脑缺血—再灌注模型，进行组织病理超微结构研究。结果 ①缺血1、2小时再灌注脑损伤最轻，缺血4小时再灌注脑损伤最重，中性粒细胞出现在缺血损伤区，与单纯缺血4小时损伤程度相当。②缺血1小时再灌注，凋亡细胞最多；缺血2小时再灌注，凋亡细胞少于缺血1小时再灌注组；缺血3小时再灌注，凋亡细胞几乎是缺血1小时再灌注组的1/4，并与坏死细胞掺杂；缺血4小时再灌注，凋亡细胞不存在，主要以坏死细胞为主。结论 缺血性损伤发生不可逆时，在损伤中心区有中性粒细胞出现，循环破坏严重。不同强度的缺血导致细胞凋亡的发生从缺血损伤中心到半暗带，较温和的脑缺血损伤以细胞凋亡为主，剧烈脑缺血损伤以细胞坏死为主，坏死细胞的出现与中性粒细胞的出现相伴随。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R 743.31；R 361.3 [文献标识码] A
[文章编号] 1002-1949(2000)06-0322-02
Rat focal cerebral ischmia-reperfusion injury pathological maolecular injury and ultrastructure of histopathology experimental study
ZHANG Jun-ling
(Beijing Tiantan Hospital,Beijing 100050,China)
FENG Hong-lin,JIANG Chuan-lu.
, 百拇医药 [Abstract] Objective To probe into focal cerebral ischmia-reperfusion injury pathological maolecular injury in experimental study.Method It was applaied that pathological model of cerebral ischmia reperfusion to objective ultrastructure of histopathology.Results One hour and two hours ischmia following reperfusion cerebral injury were lightest,4 h ischmia following reperfusion cerebral injury was heavist,neutrophilic granulocyte emerged in ischemial injury region,corresponded to purely 4 h cerebral ischmia.One hour ischmia following reperfusion apoptosis was at the peak,2 h ischmia following reperfusion apoptosis was fewer 1 h than 1 h ischmia following reperfusion gooupe,3 h ischmia following reperfusion gooupe apoptosis was in the 1 h ischmia following reperfusion gooupe of one to four,and mixed up necrosis cell,4 h ischmia following reperfusion cerebral injury took necrosis cell as the dominant and no apoptosis.Conclusions Ischemic injury was no reverse that there were neutrophilic granulocyte emerged in,and injuried circulation,and apoptosis was majio in mild ischemic,necrosis cell and neutrophilic granulocyte emerged in ischemial injury region.
, http://www.100md.com
[Key words] Focal cerebral ischmia； Reperfusion injury； Pathology； Apoptosis▲
脑缺血再灌流后的继发损伤不是一个独立病理学作用结果，而是多种病理学因素相互作用的结果，其中缺血损伤灶出现炎性细胞—白细胞、巨噬细胞的病理学作用，已引起众多学者关注[1]。我们应用大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血—再灌注损伤病理模型，缺血不同时间段，再灌注后脑组织病理和超微结构观察报告如下。
1 材料与方法
Wistar雄性大鼠36只，体重270～320 g，随机分为缺血1小时—再灌注72小时(A1组)，缺血2小时—再灌注72小时(A2组)，缺血3小时—再灌注72小时(A3组)，缺血4小时—再灌注72小时(A4组)，单纯持续缺血4小时(B组)。所有大鼠均按Koizumi方法栓塞右侧大脑中动脉：将单股尼龙线的头端0.5 cm热膨胀并打磨后，经颈外动脉、颈总动脉、颈内动脉进入大脑中动脉起始部位，造成栓塞，于栓塞不同时间拔出尼龙线，形成缺血后再灌注。术后大鼠置单笼饲养观察。72小时后断头取脑，以视交叉为中心，向后连续切成1.8 mm后冠状脑片，共三片。其中第一片常规HE染色，光镜观察；第二片2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定2小时，用磷酸缓冲液(pH 7.2)冲洗3次，10分钟/次；1%锇酸固定2小时，蒸馏水冲洗3次，10分钟/次；梯度乙醇脱水，环氧四烷置换，纯树脂浸透，包埋，超薄切片，铅-轴染色，H-600电镜观察。第三片石蜡包埋固定，常规脱蜡，水冲洗20分钟；1×PBS(pH 7.4)平衡20分钟；蛋白酶K(2 μg/ml)消化，37℃ 1小时；PBS振洗5分钟×2；用Tunel+TdT反应液(9∶1)孵育切片，37 ℃ 2小时；PBS振洗5分钟×3；加入抗体Coverte-AP 37 ℃ 1.5小时；PBS振洗5分钟×3。NBT染色(避光)。显色满意后，用PBS终止。常规脱水，透明，封片。光镜下观察，凋亡细胞的染色质为蚕豆状浓染，并常可见紫蓝色凋亡小体。以切片平面的面积中凋亡细胞的实际量做计数依据，同时描述凋亡细胞的定位，用HE染色做对比观察。
, 百拇医药
2 结果
2.1 光镜、电镜观察 缺血1小时、2小时再灌注组无中心坏死区，缺血损伤累及广泛皮层及纹状体外侧，半暗带范围扩大，胞核固缩，胞浆消失，广泛性水肿，其间有少量形态完整的神经细胞。缺血3小时再灌注组，已有中心坏死区形成，神经元坏死性变性，胞浆嗜酸，胞核溶解，细胞周边呈扇形空泡改变，周边半暗带范围明显减少，但仍可见到一些形态完整的神经细胞。缺血4小时再灌注组，在坏死区有少量中性粒细胞出现，大量微小动、静脉淤滞，阻塞。持续缺血4小时组，几乎全为坏死区，并有多数中性粒细胞出现，神经元核膜破裂，核浆分界不清，神经网极度水肿，微血管内大量红细胞沉积，纤维蛋白形成，血管内皮细胞表面粗糙收缩，微循环破坏严重。
2.2 程序性细胞死亡的原位检测 缺血1小时再灌注组凋亡细胞最多；2小时再灌注组凋亡细胞少于缺血1小时再灌注组；缺血3小时再灌注组凋亡细胞几乎是缺血1小时再灌注组的1/4，主要分布于中心坏死区周边，并与坏死细胞参杂，坏死细胞在中心坏死区主要存在；缺血4小时再灌注组，凋亡细胞几乎不存在，中心坏死区及中心坏死区周边以坏死细胞为主，中心坏死区与HE染色下发现的坏死范围相当；持续缺血4小时组程序性细胞死亡的原位检测结果与缺血4小时再灌注组检测结果基本近似。
, http://www.100md.com
3 讨论
从我们的前期研究中[2]，缺血3～4小时在灌流至72小时的缺血范围与持续缺血4小时组损伤范围(梗死体积)基本一致，超过此极限，即使恢复血流供应也不能改善缺血组织预后，并且中心坏死区周围的半暗带范围随时间延长而减少，在局灶脑缺血3小时内行再灌注，可延缓梗死进展。
我们的研究结果提示，缺血性损伤发生不可逆时，在损伤中心区有中性粒细胞出现，循环破坏严重。不同强度的缺血导致细胞凋亡的发生，从缺血损伤中心到半暗带，较温和的脑缺血损伤以细胞凋亡为主，剧烈脑缺血损伤以细胞坏死为主，坏死细胞的出现与中性粒细胞的出现相伴随，二者的关系及意义，还有待更深入的研究，可能与细胞因子如TNF、IL-1、IL-6等激活小胶质细胞、中性粒细胞、巨噬细胞参与继发炎性反应加重脑缺血后再灌流的脑损伤[3，4]。
[基金来源] 国家自然科学基金资助课题(39600138)
, http://www.100md.com
[参考文献]
[1]江涛，戴黎萌，戴钦舜.白细胞、巨噬细胞与缺血再灌流后继发脑损伤[J].基础医学与临床，1998，18(2)：12-14.
[2]蒋传路，王美华，江涛，等.大鼠局灶性脑缺血—再灌注损伤时间窗病理学研究[J].中华神经外科，1997，13(6)：372.
[3]Kochanek PM,Hallenbeck JM.Polymorphonuclear leukocytes and monocytes/macrophages in the pathogenesis of cerebral ischemia and stroke[J].Stroke,1992,23:1367-1379.
[4]Pulsinelli W.Pathophysiology of acute cerebral ischemia[J].Lancet,1992,359:533-536.
[收稿：2000-03-21], 百拇医药
单位：张俊玲(北京天坛医院保健科，100050)；丰宏林 蒋传路(哈尔滨医科大学第一临床医学院神经科)
关键词：局灶脑缺血；再灌注脑损伤；病理学；细胞凋亡
中国急救医学000602 [摘 要] 目的 为探讨脑缺血—再灌注损伤病理机制进行实验性研究。方法 应用鼠大脑中动脉局灶脑缺血—再灌注模型，进行组织病理超微结构研究。结果 ①缺血1、2小时再灌注脑损伤最轻，缺血4小时再灌注脑损伤最重，中性粒细胞出现在缺血损伤区，与单纯缺血4小时损伤程度相当。②缺血1小时再灌注，凋亡细胞最多；缺血2小时再灌注，凋亡细胞少于缺血1小时再灌注组；缺血3小时再灌注，凋亡细胞几乎是缺血1小时再灌注组的1/4，并与坏死细胞掺杂；缺血4小时再灌注，凋亡细胞不存在，主要以坏死细胞为主。结论 缺血性损伤发生不可逆时，在损伤中心区有中性粒细胞出现，循环破坏严重。不同强度的缺血导致细胞凋亡的发生从缺血损伤中心到半暗带，较温和的脑缺血损伤以细胞凋亡为主，剧烈脑缺血损伤以细胞坏死为主，坏死细胞的出现与中性粒细胞的出现相伴随。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R 743.31；R 361.3 [文献标识码] A
[文章编号] 1002-1949(2000)06-0322-02
Rat focal cerebral ischmia-reperfusion injury pathological maolecular injury and ultrastructure of histopathology experimental study
ZHANG Jun-ling
(Beijing Tiantan Hospital,Beijing 100050,China)
FENG Hong-lin,JIANG Chuan-lu.
, 百拇医药 [Abstract] Objective To probe into focal cerebral ischmia-reperfusion injury pathological maolecular injury in experimental study.Method It was applaied that pathological model of cerebral ischmia reperfusion to objective ultrastructure of histopathology.Results One hour and two hours ischmia following reperfusion cerebral injury were lightest,4 h ischmia following reperfusion cerebral injury was heavist,neutrophilic granulocyte emerged in ischemial injury region,corresponded to purely 4 h cerebral ischmia.One hour ischmia following reperfusion apoptosis was at the peak,2 h ischmia following reperfusion apoptosis was fewer 1 h than 1 h ischmia following reperfusion gooupe,3 h ischmia following reperfusion gooupe apoptosis was in the 1 h ischmia following reperfusion gooupe of one to four,and mixed up necrosis cell,4 h ischmia following reperfusion cerebral injury took necrosis cell as the dominant and no apoptosis.Conclusions Ischemic injury was no reverse that there were neutrophilic granulocyte emerged in,and injuried circulation,and apoptosis was majio in mild ischemic,necrosis cell and neutrophilic granulocyte emerged in ischemial injury region.
, http://www.100md.com
[Key words] Focal cerebral ischmia； Reperfusion injury； Pathology； Apoptosis▲
脑缺血再灌流后的继发损伤不是一个独立病理学作用结果，而是多种病理学因素相互作用的结果，其中缺血损伤灶出现炎性细胞—白细胞、巨噬细胞的病理学作用，已引起众多学者关注[1]。我们应用大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血—再灌注损伤病理模型，缺血不同时间段，再灌注后脑组织病理和超微结构观察报告如下。
1 材料与方法
Wistar雄性大鼠36只，体重270～320 g，随机分为缺血1小时—再灌注72小时(A1组)，缺血2小时—再灌注72小时(A2组)，缺血3小时—再灌注72小时(A3组)，缺血4小时—再灌注72小时(A4组)，单纯持续缺血4小时(B组)。所有大鼠均按Koizumi方法栓塞右侧大脑中动脉：将单股尼龙线的头端0.5 cm热膨胀并打磨后，经颈外动脉、颈总动脉、颈内动脉进入大脑中动脉起始部位，造成栓塞，于栓塞不同时间拔出尼龙线，形成缺血后再灌注。术后大鼠置单笼饲养观察。72小时后断头取脑，以视交叉为中心，向后连续切成1.8 mm后冠状脑片，共三片。其中第一片常规HE染色，光镜观察；第二片2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定2小时，用磷酸缓冲液(pH 7.2)冲洗3次，10分钟/次；1%锇酸固定2小时，蒸馏水冲洗3次，10分钟/次；梯度乙醇脱水，环氧四烷置换，纯树脂浸透，包埋，超薄切片，铅-轴染色，H-600电镜观察。第三片石蜡包埋固定，常规脱蜡，水冲洗20分钟；1×PBS(pH 7.4)平衡20分钟；蛋白酶K(2 μg/ml)消化，37℃ 1小时；PBS振洗5分钟×2；用Tunel+TdT反应液(9∶1)孵育切片，37 ℃ 2小时；PBS振洗5分钟×3；加入抗体Coverte-AP 37 ℃ 1.5小时；PBS振洗5分钟×3。NBT染色(避光)。显色满意后，用PBS终止。常规脱水，透明，封片。光镜下观察，凋亡细胞的染色质为蚕豆状浓染，并常可见紫蓝色凋亡小体。以切片平面的面积中凋亡细胞的实际量做计数依据，同时描述凋亡细胞的定位，用HE染色做对比观察。
, 百拇医药
2 结果
2.1 光镜、电镜观察 缺血1小时、2小时再灌注组无中心坏死区，缺血损伤累及广泛皮层及纹状体外侧，半暗带范围扩大，胞核固缩，胞浆消失，广泛性水肿，其间有少量形态完整的神经细胞。缺血3小时再灌注组，已有中心坏死区形成，神经元坏死性变性，胞浆嗜酸，胞核溶解，细胞周边呈扇形空泡改变，周边半暗带范围明显减少，但仍可见到一些形态完整的神经细胞。缺血4小时再灌注组，在坏死区有少量中性粒细胞出现，大量微小动、静脉淤滞，阻塞。持续缺血4小时组，几乎全为坏死区，并有多数中性粒细胞出现，神经元核膜破裂，核浆分界不清，神经网极度水肿，微血管内大量红细胞沉积，纤维蛋白形成，血管内皮细胞表面粗糙收缩，微循环破坏严重。
2.2 程序性细胞死亡的原位检测 缺血1小时再灌注组凋亡细胞最多；2小时再灌注组凋亡细胞少于缺血1小时再灌注组；缺血3小时再灌注组凋亡细胞几乎是缺血1小时再灌注组的1/4，主要分布于中心坏死区周边，并与坏死细胞参杂，坏死细胞在中心坏死区主要存在；缺血4小时再灌注组，凋亡细胞几乎不存在，中心坏死区及中心坏死区周边以坏死细胞为主，中心坏死区与HE染色下发现的坏死范围相当；持续缺血4小时组程序性细胞死亡的原位检测结果与缺血4小时再灌注组检测结果基本近似。
, http://www.100md.com
3 讨论
从我们的前期研究中[2]，缺血3～4小时在灌流至72小时的缺血范围与持续缺血4小时组损伤范围(梗死体积)基本一致，超过此极限，即使恢复血流供应也不能改善缺血组织预后，并且中心坏死区周围的半暗带范围随时间延长而减少，在局灶脑缺血3小时内行再灌注，可延缓梗死进展。
我们的研究结果提示，缺血性损伤发生不可逆时，在损伤中心区有中性粒细胞出现，循环破坏严重。不同强度的缺血导致细胞凋亡的发生，从缺血损伤中心到半暗带，较温和的脑缺血损伤以细胞凋亡为主，剧烈脑缺血损伤以细胞坏死为主，坏死细胞的出现与中性粒细胞的出现相伴随，二者的关系及意义，还有待更深入的研究，可能与细胞因子如TNF、IL-1、IL-6等激活小胶质细胞、中性粒细胞、巨噬细胞参与继发炎性反应加重脑缺血后再灌流的脑损伤[3，4]。
[基金来源] 国家自然科学基金资助课题(39600138)
, http://www.100md.com
[参考文献]
[1]江涛，戴黎萌，戴钦舜.白细胞、巨噬细胞与缺血再灌流后继发脑损伤[J].基础医学与临床，1998，18(2)：12-14.
[2]蒋传路，王美华，江涛，等.大鼠局灶性脑缺血—再灌注损伤时间窗病理学研究[J].中华神经外科，1997，13(6)：372.
[3]Kochanek PM,Hallenbeck JM.Polymorphonuclear leukocytes and monocytes/macrophages in the pathogenesis of cerebral ischemia and stroke[J].Stroke,1992,23:1367-1379.
[4]Pulsinelli W.Pathophysiology of acute cerebral ischemia[J].Lancet,1992,359:533-536.
[收稿：2000-03-21], 百拇医药