沙土鼠短暂性脑缺血后灰质区少突胶质细胞选择性易损性及亚低温的影响
作者：汪长胜 霍正禄 杨瑞和 龚志锦 齐跃
单位：汪长胜 齐跃(北京解放军第261医院神经外科 100094)；霍正禄 杨瑞和 龚志锦(第二军医大学病理解剖教研室)
关键词：脑缺血；少突胶质细胞；亚低温；脱髓鞘
临床神经病学杂志000602 【摘要】 目的 探讨沙土鼠短暂性脑缺血后灰质区少突胶质细胞选择性易损性及亚低温的影响。方法 阻断沙土鼠双侧颈总动脉15分钟造成前脑缺血模型。实验动物被随机分为假手术组、缺血再灌流组、亚低温(32.5±0.5℃)治疗组。采用细胞特异性抗原转铁蛋白(TF)免疫组化法标记少突胶质细胞。结果 缺血后再灌注1～2天，皮层区TF阳性的少突胶质细胞密度显著下调(P<0.01)，随后逐渐增加，于缺血后再灌注第14天达高峰。在亚低温处理的动物，皮层区TF阳性少突胶质细胞密度早期下调和晚期上调均受到显著抑制(P<0.01)。结论 灰质区少突胶质细胞具有选择性缺血易损性。亚低温治疗可防治缺血性少突胶质细胞损伤，并有可能用来防止缺血后脱髓鞘变性。
, http://www.100md.com
Oligodendrocyte selective vulnerability in gray matter area and the effect of subhypothermia after transient forebrain ischemia in gerbils
Wang Changsheng, Huo Zhenglu, Yang Ruihe, et al.
(Department of Neurosurgery, 261th Hospital of PLA,Beijing 100094)
【Abstract】 Objective To explore oligodendrocyte selective vulnerability in gray matter area and the effect of subhypothermia after transient forebrain ischemia in gerbils.Methods The gerbils model of forebrain ischemia was induced by 15 min bilateral carotid occlusion.All gerbils were divided randomly into sham operation group,ischemic reperfusion group and subhypothermia treatment group (32.5±0.5℃).Immunohistochemistry for cell specific antigens (transferrin,TF) was used to identify oligodendrocyte.Results The density of TF positive oligodendrocyte in the cortex at 1～2 days reperfusion following ischemia decreased remarkably (P<0.01), and then increased gradually, and reached the highest peak at 14th days reperfusion following ischemia.The TF positive oligodendrocyte density downregulation in early stage and upregulation in late stage in the cortex area of the animals postischemia was inhibited significantly in the subhypothermic animals(P<0.01).Conclusion The oligodendrocyte in gray matter area had selective vulnerability to ischemic injury.subhypothermia therapy might prevent and treat ischemic oligodendrocyte injury, and might be used to prevent demyelination degeneration following ischemia.
, 百拇医药
【Key words】 Cerebral ischemia Oligodendrocyte Subhypothermia Demyelination
神经元周围的胶质细胞具有支持、营养和保护神经元的作用，其死亡可致神经元功能不全，尤其是与迟发性神经元死亡密切相关。在中枢神经系统中，少突胶质细胞主要参与形成和维持髓鞘，其损伤可导致脱髓鞘变性。少突胶质细胞是中枢神经系统中仅次于神经元的易损细胞，在某些脑区，特别是灰质区也具有选择性缺血易损性[1]。亚低温对脑缺血后灰质区少突胶质细胞选择性损伤的影响至今尚未见报道。本研究采用沙土鼠短暂性前脑缺血模型，探讨脑缺血后皮层区少突胶质细胞损伤的时程特征及亚低温的影响，以期为临床缺血后脱髓鞘脑病的防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 雄性健康沙土鼠84只，体重60～85 g，由上海生物制品厂动物调剂中心提供。实验动物随机分为3组：(1)假手术组(Sham)35只；(2)缺血再灌注组(IR)35只；(3)亚低温治疗组(MHT)14只。
, 百拇医药
1.2 动物模型制作 采用Kirino[2]沙土鼠双侧颈总动脉阻断模型。动物脑缺血15分钟后恢复血流，丝线缝合切口。肛温监测：将数显温度计插入动物直肠中持续监测肛温，手术过程中保持动物肛温在37±0.5℃。亚低温治疗组于再灌流开始时行亚低温(32.5±0.5℃)处理，持续24小时后复温，常温下继续饲养，其余两组术后即在常温下继续饲养。亚低温处理方法[3]：丝线缝合切口之后，动物全身喷洒凉水(4 ℃)，使其体温迅速下降，再通过调节室温，辅以电热毯和加热灯，1小时内使动物肛温保持在32.5±0.5℃。Sham组和 IR组动物均在术后1、2、3、5、14天分次处死，MHT组则在术后2天、14天分次处死，每次7只。动物被迅速断头取脑组织，浸入含4%多聚甲醛PBS(0.1M，pH＝7.4 )中固定8小时，然后经背侧海马冠状切取约2 mm脑组织块，常规石蜡包埋做病理切片。
1.3 HE染色 按文献操作，光镜下观察。 免疫组化标记[4]：石蜡切片4 μm，脱蜡去水；0.1%胰蛋白酶37℃下消化30分钟；0.3%H2O2室温下30分钟；第一抗体为转铁蛋白(TF)抗体(1∶500，购自丹麦DAKO公司) 37℃下2小时；生物素化二抗 (1∶400) 37℃下30 分钟；Streptavidin-HRP(1∶400) 37℃下 30 分钟；DAB-H2O2呈色反应10分钟。每步骤间均用PBS洗3×3分钟，最后水洗，苏木素衬染，常规封片。
, 百拇医药
1.4 结果观察及统计学处理 在200倍光镜下，对大脑皮层区TF阳性的少突胶质细胞进行计数。实验结果以均数±标准差(
±s)表示，组间比较用t检验。
2 结 果
2.1 HE染色光镜观察 缺血后再灌注第1～2天，大脑皮层、丘脑等灰质区的神经元结构完整或仅有轻度水肿，部分神经元周围可见到胞体较小、核深染的凋亡细胞(图1)，亚低温组和假手术组未见到或仅有极少数的凋亡细胞。
2.2 脑缺血后大脑皮层区TF阳性少突胶质细胞密度变化及亚低温的影响 在Sham组各时相点，大脑皮层区TF阳性少突胶质细胞密度无明显变化。IR组再灌注1～2天，大脑皮层区TF阳性少突胶质细胞密度显著减少(P<0.01)，此后逐渐上升，至再灌注第5天时高于Sham组同时相点(P<0.05)，再灌注第14天时，大脑皮层区TF阳性少突胶质细胞密度达高峰(P<0.01)。MHT组再灌注第2天，大脑皮层区TF阳性少突胶质细胞密度显著低于IR组同时相点(P<0.01)，至再灌注第14天时又显著高于IR组同时相点(P<0.01)(图2)。见表1。
, 百拇医药
图1 再灌注第2天的大脑皮层，显示神经元周围凋亡的胶质细胞(SP×400)
图2 再灌注第2天的大脑皮层，显示阿米巴样的少突胶质细胞(SP×200)
表1 再灌注后大脑皮层区TF阳性少突胶质细胞密度变化及亚低温的影响(±s)
例数
术后 1天
术后 2天
术后 3天
术后 5天
, 百拇医药
术后14天
IR组
35
25.5±7.8**
18.7±5.9**
29.1±8.4
51.3±11.5*
72.7±18.5**
MHT组
14
37.4±6.8△
, 百拇医药
51.0±9.7*△
Sham组
35
40.5±8.3
41.8±6.2
39.5±9.6
42.4±8.5
43.5±6.9
与Sham组比较*P<0.05，**P<0.01；与IR组比较△P<0.013 讨 论
3.1 短暂性脑缺血后灰质区少突胶质细胞选择性易损性 本实验发现，灰质区的少突胶质细胞较该区神经元更容易受损，脑缺血后第1～2天即出现密度显著下调，缺血后第5天才开始增生，第14天时增生达高峰。提示灰质区少突胶质细胞具有选择性缺血易损性。其原因可能有： (1)少突胶质细胞能表达功能性的非NMDA受体，包括AMPA受体和kainate受体，故其对兴奋性氨基酸毒性易感[5]。(2)少突胶质细胞含有相对丰富的铁，谷胱甘肽含量却较低，容易受氧化应激损伤[6]。(3)少突胶质细胞含有相对高水平的神经鞘磷脂和酰基鞘氨醇，这两种化合物均可诱导细胞凋亡[7]。本实验也发现，脑缺血后灰质区，例如大脑皮层、丘脑区出现大量凋亡小体，它们位于神经元周围，从细胞定位来看应该是胶质细胞，Petito等[1]用双标记法证实为凋亡的少突胶质细胞。脑缺血后，神经元释放大量的兴奋性氨基酸和氧自由基，这是少突胶质细胞死亡的主要原因。脑缺血后也产生肿瘤坏死因子(TNF)、一氧化氮(NO)等毒性细胞因子，它们主要由活性小胶质细胞、星形胶质细胞、中性粒细胞和激活的巨噬细胞产生，但这些细胞的大量激活均出现在少突胶质细胞死亡之后[8]。因此，脑缺血后少突胶质细胞与神经元之间的相互作用是其死亡的主要原因，这似乎解释了为什么缺血后少突胶质细胞死亡易发生于灰质区或与灰质相邻的白质区。应该指出，人脑白质主要由较长的缺乏侧支循环的穿支动脉供血，急慢性脑部低灌流均可造成该区少突胶质细胞缺血性损伤。严重的缺血性损伤可使髓磷脂相关基因表达受到持久抑制，既使细胞最终存活，髓磷脂合成亦会逐渐减少，但由于髓磷脂具有较长的半衰期(2.5～8.7天),髓鞘坏死或脱髓鞘变性常发生在缺血后10～14天[6]。
, 百拇医药
3.2 亚低温防治缺血性少突胶质细胞损伤的机理 本实验发现，亚低温治疗既减轻了灰质区少突胶质细胞在缺血后再灌注早期的死亡，也抑制了其晚期的增生。提示缺血后早期的亚低温治疗对少突胶质细胞产生保护作用。脑缺血后少突胶质细胞和神经元产生相互作用，低温通过抑制神经元兴奋性氨基酸和氧自由基的释放，间接地保护了少突胶质细胞。当然，低温也通过降低细胞代谢，改善能量供给，减少细胞钙内流等途径产生直接保护作用。由于少突胶质细胞能表达多种表面分子抑制神经元轴突再生[9]，因而缺血后少突胶质细胞增生同样不利于损伤神经元的恢复。从这方面讲，亚低温对缺血后少突胶质细胞的影响也有利于神经元功能的最终恢复。
综上所述，可见灰质区少突胶质细胞具有选择性缺血易损性。亚低温治疗可减少缺血性少突胶质细胞损伤，并有可能用来防治缺血后脱髓鞘变性。
参 考 文 献
1，Petito CK, Olarte JP, Roberts B. Selective glial vulnerability following transient global ischemia in rat brain. J Neuropathol Exp Neurol, 1998, 57: 231
, http://www.100md.com
2，Kirino T, Sano K. Selective vulnerability in the gerbil hippocampus following transient ischemia. Acta Neuropathol Berl, 1984, 62: 201
3，Colbourne F,Corbett D.Delayed and prolonged post-ischemia hypothermia is neuroprotective in the gerbil. Brain Res, 1994, 654: 265
4，Benovic SA, Connor JR. Ferritin, transferrin, and iron in selected regions of the adult and aged rat brain. J Comp Neurol, 1993, 338: 97
, http://www.100md.com
5，McDonald JW, Althomsons SP, Hyrc KL, et al. Oligodendrocytes from forebrain are highly vulnerable to AMPA/kainate receptor-mediated excitotoxicity. Nat Med, 1998, 4: 291
6，Laszkiewicz I, Mouzannar R, Wiggins RC, et al. Delayed oligodendrocyte degeneration induced by brief exposure to hydrogen peroxide. J Neurosci Res, 1999, 55: 303
7，Jarvis WD, Kolesnick RN, Fornari FA, et al. Induction of apoptotic DNA damage and cell death by activation of the sphingomyelin pathway. Proc Natl Acad Sci USA,1994, 91: 73
8，Kato H, Kogure K, Araki T, et al. Astroglial and microglial reactions in the gerbil hippocampus with induced ischemic tolerance. Brain Res, 1994, 664: 69
9，Fawcett JW, Geller HM. Regeneration in the CNS: optimism mounts. Trends Neurosci, 1998, 21: 179
(收稿2000-04-28，修回2000-06-19), 百拇医药
单位：汪长胜 齐跃(北京解放军第261医院神经外科 100094)；霍正禄 杨瑞和 龚志锦(第二军医大学病理解剖教研室)
关键词：脑缺血；少突胶质细胞；亚低温；脱髓鞘
临床神经病学杂志000602 【摘要】 目的 探讨沙土鼠短暂性脑缺血后灰质区少突胶质细胞选择性易损性及亚低温的影响。方法 阻断沙土鼠双侧颈总动脉15分钟造成前脑缺血模型。实验动物被随机分为假手术组、缺血再灌流组、亚低温(32.5±0.5℃)治疗组。采用细胞特异性抗原转铁蛋白(TF)免疫组化法标记少突胶质细胞。结果 缺血后再灌注1～2天，皮层区TF阳性的少突胶质细胞密度显著下调(P<0.01)，随后逐渐增加，于缺血后再灌注第14天达高峰。在亚低温处理的动物，皮层区TF阳性少突胶质细胞密度早期下调和晚期上调均受到显著抑制(P<0.01)。结论 灰质区少突胶质细胞具有选择性缺血易损性。亚低温治疗可防治缺血性少突胶质细胞损伤，并有可能用来防止缺血后脱髓鞘变性。
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Oligodendrocyte selective vulnerability in gray matter area and the effect of subhypothermia after transient forebrain ischemia in gerbils
Wang Changsheng, Huo Zhenglu, Yang Ruihe, et al.
(Department of Neurosurgery, 261th Hospital of PLA,Beijing 100094)
【Abstract】 Objective To explore oligodendrocyte selective vulnerability in gray matter area and the effect of subhypothermia after transient forebrain ischemia in gerbils.Methods The gerbils model of forebrain ischemia was induced by 15 min bilateral carotid occlusion.All gerbils were divided randomly into sham operation group,ischemic reperfusion group and subhypothermia treatment group (32.5±0.5℃).Immunohistochemistry for cell specific antigens (transferrin,TF) was used to identify oligodendrocyte.Results The density of TF positive oligodendrocyte in the cortex at 1～2 days reperfusion following ischemia decreased remarkably (P<0.01), and then increased gradually, and reached the highest peak at 14th days reperfusion following ischemia.The TF positive oligodendrocyte density downregulation in early stage and upregulation in late stage in the cortex area of the animals postischemia was inhibited significantly in the subhypothermic animals(P<0.01).Conclusion The oligodendrocyte in gray matter area had selective vulnerability to ischemic injury.subhypothermia therapy might prevent and treat ischemic oligodendrocyte injury, and might be used to prevent demyelination degeneration following ischemia.
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【Key words】 Cerebral ischemia Oligodendrocyte Subhypothermia Demyelination
神经元周围的胶质细胞具有支持、营养和保护神经元的作用，其死亡可致神经元功能不全，尤其是与迟发性神经元死亡密切相关。在中枢神经系统中，少突胶质细胞主要参与形成和维持髓鞘，其损伤可导致脱髓鞘变性。少突胶质细胞是中枢神经系统中仅次于神经元的易损细胞，在某些脑区，特别是灰质区也具有选择性缺血易损性[1]。亚低温对脑缺血后灰质区少突胶质细胞选择性损伤的影响至今尚未见报道。本研究采用沙土鼠短暂性前脑缺血模型，探讨脑缺血后皮层区少突胶质细胞损伤的时程特征及亚低温的影响，以期为临床缺血后脱髓鞘脑病的防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 雄性健康沙土鼠84只，体重60～85 g，由上海生物制品厂动物调剂中心提供。实验动物随机分为3组：(1)假手术组(Sham)35只；(2)缺血再灌注组(IR)35只；(3)亚低温治疗组(MHT)14只。
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1.2 动物模型制作 采用Kirino[2]沙土鼠双侧颈总动脉阻断模型。动物脑缺血15分钟后恢复血流，丝线缝合切口。肛温监测：将数显温度计插入动物直肠中持续监测肛温，手术过程中保持动物肛温在37±0.5℃。亚低温治疗组于再灌流开始时行亚低温(32.5±0.5℃)处理，持续24小时后复温，常温下继续饲养，其余两组术后即在常温下继续饲养。亚低温处理方法[3]：丝线缝合切口之后，动物全身喷洒凉水(4 ℃)，使其体温迅速下降，再通过调节室温，辅以电热毯和加热灯，1小时内使动物肛温保持在32.5±0.5℃。Sham组和 IR组动物均在术后1、2、3、5、14天分次处死，MHT组则在术后2天、14天分次处死，每次7只。动物被迅速断头取脑组织，浸入含4%多聚甲醛PBS(0.1M，pH＝7.4 )中固定8小时，然后经背侧海马冠状切取约2 mm脑组织块，常规石蜡包埋做病理切片。
1.3 HE染色 按文献操作，光镜下观察。 免疫组化标记[4]：石蜡切片4 μm，脱蜡去水；0.1%胰蛋白酶37℃下消化30分钟；0.3%H2O2室温下30分钟；第一抗体为转铁蛋白(TF)抗体(1∶500，购自丹麦DAKO公司) 37℃下2小时；生物素化二抗 (1∶400) 37℃下30 分钟；Streptavidin-HRP(1∶400) 37℃下 30 分钟；DAB-H2O2呈色反应10分钟。每步骤间均用PBS洗3×3分钟，最后水洗，苏木素衬染，常规封片。
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1.4 结果观察及统计学处理 在200倍光镜下，对大脑皮层区TF阳性的少突胶质细胞进行计数。实验结果以均数±标准差(
±s)表示，组间比较用t检验。2 结 果
2.1 HE染色光镜观察 缺血后再灌注第1～2天，大脑皮层、丘脑等灰质区的神经元结构完整或仅有轻度水肿，部分神经元周围可见到胞体较小、核深染的凋亡细胞(图1)，亚低温组和假手术组未见到或仅有极少数的凋亡细胞。
2.2 脑缺血后大脑皮层区TF阳性少突胶质细胞密度变化及亚低温的影响 在Sham组各时相点，大脑皮层区TF阳性少突胶质细胞密度无明显变化。IR组再灌注1～2天，大脑皮层区TF阳性少突胶质细胞密度显著减少(P<0.01)，此后逐渐上升，至再灌注第5天时高于Sham组同时相点(P<0.05)，再灌注第14天时，大脑皮层区TF阳性少突胶质细胞密度达高峰(P<0.01)。MHT组再灌注第2天，大脑皮层区TF阳性少突胶质细胞密度显著低于IR组同时相点(P<0.01)，至再灌注第14天时又显著高于IR组同时相点(P<0.01)(图2)。见表1。
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图1 再灌注第2天的大脑皮层，显示神经元周围凋亡的胶质细胞(SP×400)
图2 再灌注第2天的大脑皮层，显示阿米巴样的少突胶质细胞(SP×200)
表1 再灌注后大脑皮层区TF阳性少突胶质细胞密度变化及亚低温的影响(
±s)例数
术后 1天
术后 2天
术后 3天
术后 5天
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术后14天
IR组
35
25.5±7.8**
18.7±5.9**
29.1±8.4
51.3±11.5*
72.7±18.5**
MHT组
14
37.4±6.8△
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51.0±9.7*△
Sham组
35
40.5±8.3
41.8±6.2
39.5±9.6
42.4±8.5
43.5±6.9
与Sham组比较*P<0.05，**P<0.01；与IR组比较△P<0.013 讨 论
3.1 短暂性脑缺血后灰质区少突胶质细胞选择性易损性 本实验发现，灰质区的少突胶质细胞较该区神经元更容易受损，脑缺血后第1～2天即出现密度显著下调，缺血后第5天才开始增生，第14天时增生达高峰。提示灰质区少突胶质细胞具有选择性缺血易损性。其原因可能有： (1)少突胶质细胞能表达功能性的非NMDA受体，包括AMPA受体和kainate受体，故其对兴奋性氨基酸毒性易感[5]。(2)少突胶质细胞含有相对丰富的铁，谷胱甘肽含量却较低，容易受氧化应激损伤[6]。(3)少突胶质细胞含有相对高水平的神经鞘磷脂和酰基鞘氨醇，这两种化合物均可诱导细胞凋亡[7]。本实验也发现，脑缺血后灰质区，例如大脑皮层、丘脑区出现大量凋亡小体，它们位于神经元周围，从细胞定位来看应该是胶质细胞，Petito等[1]用双标记法证实为凋亡的少突胶质细胞。脑缺血后，神经元释放大量的兴奋性氨基酸和氧自由基，这是少突胶质细胞死亡的主要原因。脑缺血后也产生肿瘤坏死因子(TNF)、一氧化氮(NO)等毒性细胞因子，它们主要由活性小胶质细胞、星形胶质细胞、中性粒细胞和激活的巨噬细胞产生，但这些细胞的大量激活均出现在少突胶质细胞死亡之后[8]。因此，脑缺血后少突胶质细胞与神经元之间的相互作用是其死亡的主要原因，这似乎解释了为什么缺血后少突胶质细胞死亡易发生于灰质区或与灰质相邻的白质区。应该指出，人脑白质主要由较长的缺乏侧支循环的穿支动脉供血，急慢性脑部低灌流均可造成该区少突胶质细胞缺血性损伤。严重的缺血性损伤可使髓磷脂相关基因表达受到持久抑制，既使细胞最终存活，髓磷脂合成亦会逐渐减少，但由于髓磷脂具有较长的半衰期(2.5～8.7天),髓鞘坏死或脱髓鞘变性常发生在缺血后10～14天[6]。
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3.2 亚低温防治缺血性少突胶质细胞损伤的机理 本实验发现，亚低温治疗既减轻了灰质区少突胶质细胞在缺血后再灌注早期的死亡，也抑制了其晚期的增生。提示缺血后早期的亚低温治疗对少突胶质细胞产生保护作用。脑缺血后少突胶质细胞和神经元产生相互作用，低温通过抑制神经元兴奋性氨基酸和氧自由基的释放，间接地保护了少突胶质细胞。当然，低温也通过降低细胞代谢，改善能量供给，减少细胞钙内流等途径产生直接保护作用。由于少突胶质细胞能表达多种表面分子抑制神经元轴突再生[9]，因而缺血后少突胶质细胞增生同样不利于损伤神经元的恢复。从这方面讲，亚低温对缺血后少突胶质细胞的影响也有利于神经元功能的最终恢复。
综上所述，可见灰质区少突胶质细胞具有选择性缺血易损性。亚低温治疗可减少缺血性少突胶质细胞损伤，并有可能用来防治缺血后脱髓鞘变性。
参 考 文 献
1，Petito CK, Olarte JP, Roberts B. Selective glial vulnerability following transient global ischemia in rat brain. J Neuropathol Exp Neurol, 1998, 57: 231
, http://www.100md.com
2，Kirino T, Sano K. Selective vulnerability in the gerbil hippocampus following transient ischemia. Acta Neuropathol Berl, 1984, 62: 201
3，Colbourne F,Corbett D.Delayed and prolonged post-ischemia hypothermia is neuroprotective in the gerbil. Brain Res, 1994, 654: 265
4，Benovic SA, Connor JR. Ferritin, transferrin, and iron in selected regions of the adult and aged rat brain. J Comp Neurol, 1993, 338: 97
, http://www.100md.com
5，McDonald JW, Althomsons SP, Hyrc KL, et al. Oligodendrocytes from forebrain are highly vulnerable to AMPA/kainate receptor-mediated excitotoxicity. Nat Med, 1998, 4: 291
6，Laszkiewicz I, Mouzannar R, Wiggins RC, et al. Delayed oligodendrocyte degeneration induced by brief exposure to hydrogen peroxide. J Neurosci Res, 1999, 55: 303
7，Jarvis WD, Kolesnick RN, Fornari FA, et al. Induction of apoptotic DNA damage and cell death by activation of the sphingomyelin pathway. Proc Natl Acad Sci USA,1994, 91: 73
8，Kato H, Kogure K, Araki T, et al. Astroglial and microglial reactions in the gerbil hippocampus with induced ischemic tolerance. Brain Res, 1994, 664: 69
9，Fawcett JW, Geller HM. Regeneration in the CNS: optimism mounts. Trends Neurosci, 1998, 21: 179
(收稿2000-04-28，修回2000-06-19), 百拇医药