一氧化氮合酶在缺血预处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤保护中的作用
刘少青 姜佑三 严博泉 权昌益
摘 要：目的：探讨一氧化氮合酶(NOS)在缺血预处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤保护中的作用。方法：将大鼠随机分为对照组(CON)、缺血-再灌注组(IR)和缺血预处理后缺血-再灌注组(IPC)。 光镜下观察并行肾小管评分，用免疫组化法检测各组中不同灌注时间的3种NOS的变化。结果：不同缺血-再灌注时间点病理组织学肾小管评分IPC组均低于IR组(P均<0.05),而IPC组和CON组之间无显著性差异(P均>0.05)；诱导型NOS(iNOS)在IR组中的表达明显高于IPC组和CON组(P<0.01或P<0.05)；而内皮型NOS(eNOS)和神经元型NOS(nNOS)在各组中的表达无显著性差异(P均>0.05)。结论：缺血预处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤有保护作用，其保护机制与iNOS的生成减少有关；eNOS和iNOS在缺血预处理过程中无明显变化。
关键词：缺血-再灌注损伤，肾 缺血预处理 一氧化氮合酶
, http://www.100md.com
自1986年Murry等〔1〕提出缺血预处理对心脏有保护作用以后，人们开始了通过各种预处理来调动脏器内源性保护作用的研究。最近，国内外学者在这方面开始了对肾脏的观察，但对其机制未作进一步的报道。本研究探讨缺血预处理对肾脏缺血再灌注损伤保护作用的可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组：健康成年Wistar大鼠81只，购自延边大学医学院实验动物科，雌雄不限，体重(237.28±16.60)g。将大鼠随机分为对照组(CON)、缺血再灌注组(IR)、缺血预处理后缺血再灌注组(IPC)，每组27只。每组再分为3个小组，每小组9只。IPC组切除右肾后，将左肾蒂血管用无损伤血管钳钳夹使左肾缺血5分钟，放松使之灌注5分钟，重复3次，然后再缺血1小时，再灌注0、2、6小时取左肾标本；IR组在切除右肾30分钟后，缺血1小时，然后再灌注0、2、6小时取左肾标本；对照组在游离出左肾蒂后，未做任何处理，但在切取左肾标本时在时间上和IPC组保持相同。标本用中性甲醛固定，制成石蜡切片，以备免疫组化和常规染色用。
, 百拇医药
1.2 组织中蛋白表达的检测：采用免疫组化(SABC)染色方法。一氧化氮合酶(NOS)抗体购自Santa Cruz公司，SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，实验按试剂盒说明书进行，略加修改，石蜡包埋切片行抗原酶消化处理，一抗用抗体稀释液1∶100稀释。用已知的阳性标本作阳性对照，用生理盐水代替一抗作阴性对照。有棕黄色为NOS阳性染色细胞。
1.3 结果判断：选取切片平展、细胞形态和组织结构清晰的组织切片进行分析。病变严重处组织常规HE染色和切片，在400倍光镜下观察，每个视野选择10个肾小管评分，按50个肾小管计分(即5个视野)，记分标准依据Paller氏法〔2〕。肾小管明显扩张，细胞扁平1分，刷状缘损伤或脱落1分或2分，管型2分，肾小管腔内有脱落的坏死细胞未形成管型或碎片1分。诱导型NOS(iNOS)和内皮型NOS(eNOS)免疫组化检测结果在400倍光镜下观察，随机选5个视野，计数阳性细胞数和总细胞数，计算出阳性细胞率，然后计分，无阳性细胞为阴性(0分)，阳性细胞在25%以下为弱阳性(2分)，25%～50%为阳性(4分)，50%以上为强阳性(6分)。神经元型NOS(nNOS)在肾脏内表达较低，仅以阳性和阴性(无阳性细胞)来划分。表达部位：NOS表达于细胞胞浆，iNOS主要分布于肾脏间质的巨噬细胞、肾小球(系膜细胞、毛细血管内皮细胞)和血管平滑肌；eNOS主要分布于肾血管的内皮细胞；nNOS主要存在于球旁器的致密斑集合管和髓袢细段。
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1.4 统计学方法：数据用均数±标准差(X±s)表示，用非配对t检验进行统计学处理。
2 结 果
2.1 肾小管评分：在再灌注后0、2和6小时，IPC组均低于IR组(P均<0.05)，CON组也明显低于IR组(P<0.01或P<0.05),而IPC组和CON组之间无显著性差异(P均>0.05)。见表1。
表1 3组大鼠肾小管评分(X±s) 分
组别
再灌注后时间(h)
0
2
6
, 百拇医药
IR组
39.90±9.70(9)
42.24±12.30(9)
44.12±11.26(9)
IPC组
28.21±11.32(9)*
31.18±8.60(9)*
32.48±11.10(9)*
CON组
26.28±12.21(9)**
, 百拇医药
30.42±10.86(9)*
28.64± 9.60(9)**
注：与IR组比较：*P<0.05,**P<0.01；( )内为动物数
2.2 iNOS的表达：IR组均分别高于IPC组和CON组(P<0.05或P<0.01)；但在IPC组和CON组之间，iNOS的表达无显著性差异(P均>0.05)。见表2。
表2 3组大鼠肾脏组织中iNOS的表达(X±s) 分
组别
再灌注后时间(h)
0
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2
6
IR组
3.56±0.88(9)
3.78±1.06(9)
3.78±1.20(9)
IPC组
2.22±1.20(9)*
2.00±1.00(9)*
2.22±0.67(9)*
CON组
, http://www.100md.com
1.78±1.20(9)**
2.22±0.67(9)*
1.56±1.33(9)**
注：与IR组比较：*P<0.05，**P<0.01；( )内为动物数
2.3 eNOS的表达：3组之间相互比较均无显著性差异(P均>0.05)。见表3。
表3 3组大鼠肾脏组织中eNOS的表达(X±s) 分
组别
再灌注后时间(h)
0
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2
6
IR组
1.33±1.00(9)
1.56±0.88(9)
1.78±0.67(9)
IPC组
2.00±1.00(9)
1.78±1.20(9)
2.44±1.33(9)
CON组
1.78±0.67(9)
, http://www.100md.com
2.22±0.67(9)
2.00±1.00(9)
注：( )内为动物数
2.4 nNOS在肾脏组织中的表达：其表达率很低，各组之间无显著性差异(P均>0.05)。见表4。
表4 3组大鼠肾脏组织中nNOS的阳性表达 只
组别
再灌注后时间(h)
0
2
6
IR组
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2
1
2
IPC组
1
3
1
CON组
3
0
2
3 讨 论
我们研究结果显示：光镜下观察见缺血再灌注组大鼠肾小管上皮细胞明显水肿样变性，肾小管刷状缘脱落或部分脱落，以近曲小管为重，并见管型，肾间质局部出血伴水肿；缺血预处理组仅见部分肾小管上皮细胞轻度水肿样变性，偶见管型。各组大鼠肾小球变化相差不大。可以看出，缺血预处理组肾小管评分明显优于缺血再灌注组，而缺血预处理组与对照组之间无显著性差异，可见缺血预处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤有明显保护作用。
, 百拇医药
缺血预处理的机制极为复杂，有大量假说在各种动物模型上证实。如心肌细胞cAMP生成减少，线粒体ATP酶抑制，微循环功能障碍减轻，细胞内酸中毒减轻，腺苷生成，儿茶酚胺生成，缓激肽生成，降钙素基因相关肽生成，氧自由基生成减少，ATP敏感钾通道开放，蛋白激酶C激活，热休克蛋白合成增多，丝裂素活化蛋白激酶激活等〔3〕。一氧化氮(NO)及NOS是否参与缺血预处理的保护作用，目前的国内外文献中未见报道。本研究IPC组中iNOS表达明显降低，与IR组比较有显著性差异，可见iNOS的减少参与了缺血预处理的保护作用。
NO是通过NOS产生的。NOS可分为两大类，一类是cNOS，它包括eNOS和nNOS；另一类是iNOS。基态的cNOS生成的NO有助于肾脏血流量和肾小球滤过率(GFR)的维持，而iNOS过量产生的NO及其毒性产物可引起严重的组织损伤。本研究结果显示，nNOS和eNOS在各组中的表达无明显差异，nNOS在肾脏组织中的表达率很低。说明在缺血预处理过程中nNOS和eNOS无明显变化。另外，iNOS在IR组的表达明显高于另外2组，说明缺血再灌注损伤主要与iNOS生成过量的NO有关，与基态型的cNOS生成的NO关系不大，这与郑旭等〔4〕的结果一致。IPC组中的iNOS低表达说明缺血预处理可减少iNOS的生成。至于缺血预处理如何使iNOS的生成减少，其具体机制目前还不甚清楚，许多文献〔5-7〕报道缺血预处理可以诱导热休克蛋白70的产生，而热休克蛋白70能抑制核转录因子κB(NF-κB)的活化，NF-κB可阻断促炎因子iNOS的表达。可见，缺血预处理使iNOS生成减少是由一系列保护因子作用的结果。
, 百拇医药
基金项目：延边大学医学院硕士研究生课题
作者简介：刘少青(1967-)，男(汉族)，山东沂水人，硕士，主治医师。
刘少青(延边大学医学院附属医院泌尿外科，吉林 延吉 133000)
姜佑三(延边大学医学院附属医院泌尿外科，吉林 延吉 133000)
严博泉(延边大学医学院附属医院泌尿外科，吉林 延吉 133000)
权昌益(延边大学医学院附属医院泌尿外科，吉林 延吉 133000)
参考文献：
〔1〕Murry C E,Jenings R B,Reimjer K A,et al.Preconditioning with ischemia:a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium.Circulation,1986,74(5):1124-1136.
, http://www.100md.com
〔2〕Paller M S.Oxygen free radicals in ischemic acute renal failure in the rat.J Clin Invest,1984，74:1156.
〔3〕Parratt J R.Possibilities for the pharmacological exploitation of ischemic preconditioning.J Mol Cell Cardiol,1995,24:99-11000.
〔4〕郑旭,罗杰,杨文英,等.一氧化氮在糖尿病肾病中的应用.中华肾脏病杂志,1999,15(2):9194.
〔5〕Wang HR,Ryan M,Mestri R.The heat shock response inhibits inducible nitric oxide synthase gene expression by blocking I-κB degradation and NF-κB nuclear translocation.Biochem Biophys Res Commun,1997,231:257.
, 百拇医药
〔6〕Feinstein D L,Galea E,Aquino D A,et al,Heat shock protein 70,suppresses astrogialinducible nitric oxide synthase expression by decreasing NF-κB activation.J Biol Chem,1996,271:17724.
〔7〕Knoulton A A,Brecher P,Apstein C S.Rapid expression of heat shock protein in the rabbit after brief cardiac ischemia.J Clin Invest,1991,87:139., 百拇医药
摘 要：目的：探讨一氧化氮合酶(NOS)在缺血预处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤保护中的作用。方法：将大鼠随机分为对照组(CON)、缺血-再灌注组(IR)和缺血预处理后缺血-再灌注组(IPC)。 光镜下观察并行肾小管评分，用免疫组化法检测各组中不同灌注时间的3种NOS的变化。结果：不同缺血-再灌注时间点病理组织学肾小管评分IPC组均低于IR组(P均<0.05),而IPC组和CON组之间无显著性差异(P均>0.05)；诱导型NOS(iNOS)在IR组中的表达明显高于IPC组和CON组(P<0.01或P<0.05)；而内皮型NOS(eNOS)和神经元型NOS(nNOS)在各组中的表达无显著性差异(P均>0.05)。结论：缺血预处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤有保护作用，其保护机制与iNOS的生成减少有关；eNOS和iNOS在缺血预处理过程中无明显变化。
关键词：缺血-再灌注损伤，肾 缺血预处理 一氧化氮合酶
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自1986年Murry等〔1〕提出缺血预处理对心脏有保护作用以后，人们开始了通过各种预处理来调动脏器内源性保护作用的研究。最近，国内外学者在这方面开始了对肾脏的观察，但对其机制未作进一步的报道。本研究探讨缺血预处理对肾脏缺血再灌注损伤保护作用的可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组：健康成年Wistar大鼠81只，购自延边大学医学院实验动物科，雌雄不限，体重(237.28±16.60)g。将大鼠随机分为对照组(CON)、缺血再灌注组(IR)、缺血预处理后缺血再灌注组(IPC)，每组27只。每组再分为3个小组，每小组9只。IPC组切除右肾后，将左肾蒂血管用无损伤血管钳钳夹使左肾缺血5分钟，放松使之灌注5分钟，重复3次，然后再缺血1小时，再灌注0、2、6小时取左肾标本；IR组在切除右肾30分钟后，缺血1小时，然后再灌注0、2、6小时取左肾标本；对照组在游离出左肾蒂后，未做任何处理，但在切取左肾标本时在时间上和IPC组保持相同。标本用中性甲醛固定，制成石蜡切片，以备免疫组化和常规染色用。
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1.2 组织中蛋白表达的检测：采用免疫组化(SABC)染色方法。一氧化氮合酶(NOS)抗体购自Santa Cruz公司，SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，实验按试剂盒说明书进行，略加修改，石蜡包埋切片行抗原酶消化处理，一抗用抗体稀释液1∶100稀释。用已知的阳性标本作阳性对照，用生理盐水代替一抗作阴性对照。有棕黄色为NOS阳性染色细胞。
1.3 结果判断：选取切片平展、细胞形态和组织结构清晰的组织切片进行分析。病变严重处组织常规HE染色和切片，在400倍光镜下观察，每个视野选择10个肾小管评分，按50个肾小管计分(即5个视野)，记分标准依据Paller氏法〔2〕。肾小管明显扩张，细胞扁平1分，刷状缘损伤或脱落1分或2分，管型2分，肾小管腔内有脱落的坏死细胞未形成管型或碎片1分。诱导型NOS(iNOS)和内皮型NOS(eNOS)免疫组化检测结果在400倍光镜下观察，随机选5个视野，计数阳性细胞数和总细胞数，计算出阳性细胞率，然后计分，无阳性细胞为阴性(0分)，阳性细胞在25%以下为弱阳性(2分)，25%～50%为阳性(4分)，50%以上为强阳性(6分)。神经元型NOS(nNOS)在肾脏内表达较低，仅以阳性和阴性(无阳性细胞)来划分。表达部位：NOS表达于细胞胞浆，iNOS主要分布于肾脏间质的巨噬细胞、肾小球(系膜细胞、毛细血管内皮细胞)和血管平滑肌；eNOS主要分布于肾血管的内皮细胞；nNOS主要存在于球旁器的致密斑集合管和髓袢细段。
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1.4 统计学方法：数据用均数±标准差(X±s)表示，用非配对t检验进行统计学处理。
2 结 果
2.1 肾小管评分：在再灌注后0、2和6小时，IPC组均低于IR组(P均<0.05)，CON组也明显低于IR组(P<0.01或P<0.05),而IPC组和CON组之间无显著性差异(P均>0.05)。见表1。
表1 3组大鼠肾小管评分(X±s) 分
组别
再灌注后时间(h)
0
2
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IR组
39.90±9.70(9)
42.24±12.30(9)
44.12±11.26(9)
IPC组
28.21±11.32(9)*
31.18±8.60(9)*
32.48±11.10(9)*
CON组
26.28±12.21(9)**
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30.42±10.86(9)*
28.64± 9.60(9)**
注：与IR组比较：*P<0.05,**P<0.01；( )内为动物数
2.2 iNOS的表达：IR组均分别高于IPC组和CON组(P<0.05或P<0.01)；但在IPC组和CON组之间，iNOS的表达无显著性差异(P均>0.05)。见表2。
表2 3组大鼠肾脏组织中iNOS的表达(X±s) 分
组别
再灌注后时间(h)
0
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IR组
3.56±0.88(9)
3.78±1.06(9)
3.78±1.20(9)
IPC组
2.22±1.20(9)*
2.00±1.00(9)*
2.22±0.67(9)*
CON组
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1.78±1.20(9)**
2.22±0.67(9)*
1.56±1.33(9)**
注：与IR组比较：*P<0.05，**P<0.01；( )内为动物数
2.3 eNOS的表达：3组之间相互比较均无显著性差异(P均>0.05)。见表3。
表3 3组大鼠肾脏组织中eNOS的表达(X±s) 分
组别
再灌注后时间(h)
0
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IR组
1.33±1.00(9)
1.56±0.88(9)
1.78±0.67(9)
IPC组
2.00±1.00(9)
1.78±1.20(9)
2.44±1.33(9)
CON组
1.78±0.67(9)
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2.22±0.67(9)
2.00±1.00(9)
注：( )内为动物数
2.4 nNOS在肾脏组织中的表达：其表达率很低，各组之间无显著性差异(P均>0.05)。见表4。
表4 3组大鼠肾脏组织中nNOS的阳性表达 只
组别
再灌注后时间(h)
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IR组
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IPC组
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CON组
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我们研究结果显示：光镜下观察见缺血再灌注组大鼠肾小管上皮细胞明显水肿样变性，肾小管刷状缘脱落或部分脱落，以近曲小管为重，并见管型，肾间质局部出血伴水肿；缺血预处理组仅见部分肾小管上皮细胞轻度水肿样变性，偶见管型。各组大鼠肾小球变化相差不大。可以看出，缺血预处理组肾小管评分明显优于缺血再灌注组，而缺血预处理组与对照组之间无显著性差异，可见缺血预处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤有明显保护作用。
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缺血预处理的机制极为复杂，有大量假说在各种动物模型上证实。如心肌细胞cAMP生成减少，线粒体ATP酶抑制，微循环功能障碍减轻，细胞内酸中毒减轻，腺苷生成，儿茶酚胺生成，缓激肽生成，降钙素基因相关肽生成，氧自由基生成减少，ATP敏感钾通道开放，蛋白激酶C激活，热休克蛋白合成增多，丝裂素活化蛋白激酶激活等〔3〕。一氧化氮(NO)及NOS是否参与缺血预处理的保护作用，目前的国内外文献中未见报道。本研究IPC组中iNOS表达明显降低，与IR组比较有显著性差异，可见iNOS的减少参与了缺血预处理的保护作用。
NO是通过NOS产生的。NOS可分为两大类，一类是cNOS，它包括eNOS和nNOS；另一类是iNOS。基态的cNOS生成的NO有助于肾脏血流量和肾小球滤过率(GFR)的维持，而iNOS过量产生的NO及其毒性产物可引起严重的组织损伤。本研究结果显示，nNOS和eNOS在各组中的表达无明显差异，nNOS在肾脏组织中的表达率很低。说明在缺血预处理过程中nNOS和eNOS无明显变化。另外，iNOS在IR组的表达明显高于另外2组，说明缺血再灌注损伤主要与iNOS生成过量的NO有关，与基态型的cNOS生成的NO关系不大，这与郑旭等〔4〕的结果一致。IPC组中的iNOS低表达说明缺血预处理可减少iNOS的生成。至于缺血预处理如何使iNOS的生成减少，其具体机制目前还不甚清楚，许多文献〔5-7〕报道缺血预处理可以诱导热休克蛋白70的产生，而热休克蛋白70能抑制核转录因子κB(NF-κB)的活化，NF-κB可阻断促炎因子iNOS的表达。可见，缺血预处理使iNOS生成减少是由一系列保护因子作用的结果。
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基金项目：延边大学医学院硕士研究生课题
作者简介：刘少青(1967-)，男(汉族)，山东沂水人，硕士，主治医师。
刘少青(延边大学医学院附属医院泌尿外科，吉林 延吉 133000)
姜佑三(延边大学医学院附属医院泌尿外科，吉林 延吉 133000)
严博泉(延边大学医学院附属医院泌尿外科，吉林 延吉 133000)
权昌益(延边大学医学院附属医院泌尿外科，吉林 延吉 133000)
参考文献：
〔1〕Murry C E,Jenings R B,Reimjer K A,et al.Preconditioning with ischemia:a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium.Circulation,1986,74(5):1124-1136.
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〔2〕Paller M S.Oxygen free radicals in ischemic acute renal failure in the rat.J Clin Invest,1984，74:1156.
〔3〕Parratt J R.Possibilities for the pharmacological exploitation of ischemic preconditioning.J Mol Cell Cardiol,1995,24:99-11000.
〔4〕郑旭,罗杰,杨文英,等.一氧化氮在糖尿病肾病中的应用.中华肾脏病杂志,1999,15(2):9194.
〔5〕Wang HR,Ryan M,Mestri R.The heat shock response inhibits inducible nitric oxide synthase gene expression by blocking I-κB degradation and NF-κB nuclear translocation.Biochem Biophys Res Commun,1997,231:257.
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〔6〕Feinstein D L,Galea E,Aquino D A,et al,Heat shock protein 70,suppresses astrogialinducible nitric oxide synthase expression by decreasing NF-κB activation.J Biol Chem,1996,271:17724.
〔7〕Knoulton A A,Brecher P,Apstein C S.Rapid expression of heat shock protein in the rabbit after brief cardiac ischemia.J Clin Invest,1991,87:139., 百拇医药