自制HYD液对大鼠肝脏低温保存后生化功能影响的研究
自制HYD液对大鼠肝脏低温保存后生化功能影响的研究
孙备 姜洪池 赵金鹏
摘要 目的：研究自制HYD液对大鼠肝脏低温保存后生化功能的影响。方法：采用大鼠肝脏非循环离体灌注模型，比较HYD液、UW液和乳酸林格液(LR液)对大鼠肝脏6、12、24、30、36h保存后生化功能的影响。结果：保存12h的肝脏，其各项生化功能HYD组明显优于LR组(P<0.05)。三磷酸腺苷(ATP)、磷酸腺苷(TAN)含量及Atkinson能荷(AEC)，HYD组略高于UW组，且保存36h差异有显著性(P<0.05)。线粒体H+-ATP酶水解活性及肝脏分泌胆汁量，HYD组略高于UW组，但差异无显著性(P>0.05)。保存30、36h后保存液pH值，HYD组明显高于UW组(P<0.05)。流出液酶学含量，HYD组与UW组差异无显著性(P>0.05)。结论：HYD液保存鼠肝12h效果明显优于LR液，保存36h与UW液相当，在改善低温保存及再灌注肝脏能量代谢、预防细胞内酸中毒、分泌胆汁量及肝脏原位灌洗等方面，HYD液略优于UW液。
, 百拇医药
关键词：肝脏 灌洗 保存液
我们研制出一种以蔗糖为主要非渗透性因子、具有极强缓冲能力、含有三种中药的等渗保存液-HYD液。观察该液对大鼠肝脏冷保存后生化功能的影响，并与乳酸林格液(LR液)、UW液进行了比较。
材料和方法
一、实验动物及分组
Wister纯种大鼠96只，由哈尔滨医科大学附一医院实验动物中心提供，体重(250±20)g，雌雄不限。根据使用灌洗保存液的种类将大鼠随机分为HYD组(n=40)、UW组(n=40)和LR组(n=16)。再根据不同保存时间分别将HYD组、UW组分为保存6、12、24、30、36h5个亚组，将LR组分为保存6、12h2个亚组，每个亚组8只大鼠。
二、灌洗保存液
, 百拇医药
UW液购于美国DupontCriticalCare公司，LR液购于中国大冢制药公司，成分均为标准配方。HYD液成分见表1。
表1 HYD保存液的组成
成分
含量
蔗糖
120(mmol/L)
棉子糖
30(mmol/L)
组氨酸
90(mmol/L)
磷酸二氢钾
, http://www.100md.com
40(mmol/L)
硫酸镁
5(mmol/L)
药物H
400(mg/L)
药物Y
400(mg/L)
药物D
600(mg/L)
注：pH值7.40±0.02；渗透压：(320±5)mOsm/L
三、动物模型
以大鼠离体肝脏灌注(IPRL)为肝脏保存再灌注模型：腹部“+”切口入腹，经下腔静脉注入2.5万U/L肝素生理盐水2ml，分离胆管、门静脉，插入导管后立即开始灌注0℃灌洗液20ml，切取肝脏后置于0℃该灌洗液中保存。按各组不同时间保存后，将肝脏经门静脉恒温37℃行再灌注30min。实验采取非循环灌注，再灌注液为Kreb-Henseleit，其中另加入20μmol/L牛磺胆酸钠。
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四、检测指标
1.肝组织能量物质测定：利用快速等浓度高效液相色谱技术[1]，检测肝脏不同保存时间再灌注30min后三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、腺苷酸(AMP)，计算磷酸腺苷(TAN)总量和Atkinson能荷(AEC)。TAN=ATP+ADP+AMP，ACE=(ATP+0.5ADP)/TAN。
2.肝脏线粒体H+-ATP酶水解活性测定：采用定磷法检测肝脏低温保存再灌注30min后线粒体H+-ATP酶水解活性[2]。
3.保存液pH值测定：检测肝脏低温保存后各保存液pH值。
4.分泌胆汁量测定：收集离体灌注30min内大鼠肝脏分泌胆汁总量。
, 百拇医药 5.流出液酶学测定：取第30min流出液2ml，用GEMSTAR生化自动分析仪检测天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)含量。
6.统计：实验结果以x±s表示，采用t检验，以P<0.05为差异有显著性。
结 果
一、肝细胞能量物质含量见表2。随着保存时间的延长，肝组织ATP、TAN含量及AEC逐渐降低，LR组尤为明显。LR组保存12h肝组织ATP、TAN含量及AEC明显低于UW组和HYD组(P<0.05)。HYD组ATP、TAN含量及AEC较UW组下降略为缓慢，且保存36h明显高于UW组(P<0.05)。
表2 肝组织保存不同时间的能量物质含量(x±s)
组别
, http://www.100md.com
保存
时间(h)
肝组织能量物质含量(μmol/g)
ATP
ADP
AMP
TAN
AEC
LR组
6
7.05±0.95
5.20±0.84
3.90±0.62
, http://www.100md.com
16.15±2.41
0.60±0.08
12
2.52±0.31*
3.90±0.68
5.75±0.92
12.47±1.91*
0.24±0.03*
UW组
6
7.45±0.85
, http://www.100md.com
5.24±0.70
3.85±0.61
16.54±2.16
0.61±0.07
12
6.58±0.81
4.85±0.60
4.25±0.48
15.68±1.89
0.57±0.05
24
4.80±0.52
, 百拇医药
4.05±0.57
6.08±0.91
14.93±2.00
0.46±0.05
30
3.52±0.41
3.80±0.39
5.86±0.74
13.18±1.54
0.42±0.04
36
3.08±0.31#
, http://www.100md.com
2.98±0.32
5.66±0.64
11.72±1.27#
0.39±0.03#
HYD组
6
7.58±0.84
5.30±0.78
3.88±0.62
16.76±2.24
0.61±0.08
, http://www.100md.com
12
6.80±0.81
4.85±0.61
4.12±0.39
15.87±1.81
0.58±0.05
24
4.95±0.71
4.20±0.63
6.16±0.81
15.31±2.15
0.47±0.04
, http://www.100md.com
30
4.05±0.39
4.12±0.52
5.44±0.49
13.61±1.40
0.45±0.04
36
3.94±0.31
3.92±0.28
5.73±0.59
13.59±1.18
0.44±0.04
, 百拇医药
注：*与UW组和HYD组相比，P<0.05；#与HYD组相比，P<0.05
二、肝脏线粒体H+-ATP酶水解活性：该酶活性随着保存时间延长而降低，LR组为著。保存12h，LR组(0.24μmol.mg-1.min-1)明显低于UW组(0.52μmol.mg-1.min-1，P<0.05)和HYD组(0.54μmol.mg-1.min-1，P<0.05)，其他各保存时间HYD组较UW组略高，但差异无显著性。
三、保存液pH值：肝组织保存6、12h后，保存液pH值LR组(7.20，6.95)明显低于UW组(7.38，7.32，P<0.05)和HYD组(7.38，7.36，P<0.05)；保存30、36h后，UW组pH值(7.20、7.18)显著低于HYD组(7.33，7.32，P<0.05)。
, 百拇医药
四、分泌胆汁量见表3。肝组织保存12h，检测胆汁分泌量LR组显著低于UW组和HYD组(P<0.05)。UW组胆汁分泌量略低于HYD组，但差异无显著性。
五、流出液酶学结果见表3。随着保存时间延长，流出液中ALT、LDH逐渐升高，LR组升高明显。UW组与HYD组同步升高，差异无显著性。
表3 肝组织保存不同时间的流出液中酶学变化及分泌胆汁量(x±s)
组别
保存时
间(h)
流出液中酶含量(U/L)
胆汁量
(μl/30min)
, 百拇医药
ALT
LDH
LR组
6
71.2±8.5
188.4±21.5
77.2±6.4
12
134.0±12.3*
432.7±41.6*
28.7±4.1*
UW组
, 百拇医药
6
65.4±7.9
168.5±19.4
84.6±8.1
12
74.8±7.6
189.4±20.2
78.1±6.2
24
84.5±8.4
207.8±23.4
60.4±5.8
, http://www.100md.com
30
96.8±9.2
212.4±21.5
48.1±5.1
36
98.4±10.1
225.7±23.4
34.0±4.1
HTD组
6
68.7±6.4
160.5±12.5
, 百拇医药
88.4±7.9
12
72.6±6.3
192.7±18.4
82.4±6.8
24
87.4±7.1
214.8±22.5
62.8±5.2
30
94.5±8.7
221.3±24.2
, 百拇医药
51.4±4.9
36
102.7±9.5
229.4±25.6
38.5±4.2
*与UW组和HYD组相比，P<0.05
讨 论
我们研制的HYD多器官保存液是在全面细致分析UW液、HTK液配方的基础上，加以改良，并应用三种中药成分，即集中UW液、HTK液及祖国医学的优点，主要特点为：(1)以蔗糖替代UW液中乳果糖为主要非渗透性因子；(2)应用HTK液中组氨酸成分(90mmol/L)，并提高UW液中磷酸二氢钾浓度至40mmol/L，使该溶液具有极强的缓冲能力；(3)应用H、Y、D三种中药改善低温保存及再灌注能量代谢，防止再灌注时氧自由基损伤；(4)去掉UW液中多种添加成分，尤其是羟乙基淀粉，降低保存液粘稠度。改良的目的是：降低成本，增加保存效果，简化配制，方便储存、运输及使用。
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组织中能量物质与保存器官生存能力密切相关。Bowers首次证实保存肝脏ATP、TAN含量及AEC与术后生存率成正比[3-4]。本实验观察到肝组织ATP、TAN含量及AEC随保存时间延长而逐渐降低，LR组尤为明显，HYD组在各保存时间中能量物质含量均略高于UW组，且保存36h差异有显著性(P<0.05)。因此，我们认为改善肝脏低温保存及再灌注时能量代谢是HYD液有效保存肝脏的重要因素之一。线粒体H+-ATP酶是能量转换单位，它在线粒体膜的氧化磷酸化能量偶联反应中、在需能的离子转运和DNA复制的能量偶联反应中起着中心作用。本实验线粒体H+-ATP酶水解活性在各组的变化情况再次证明HYD液对保护肝细胞线粒性氧化磷酸化功能完整性起着重要作用。
保持溶液的缓冲能力、预防细胞内酸中毒也十分重要。HYD液含有磷酸二氢钾-组氨酸极强的缓冲体系，缓冲能力明显优于LR液、UW液。
肝脏分泌胆汁量是反映肝脏保存质量的一项敏感指标，因为肝细胞分泌胆汁是一个耗能过程，分泌胆汁量与肝细胞ATP浓度呈Michaelis-Menten曲线关系[5]。大鼠胆汁分泌为胆盐依赖性，故本实验Krebs-Henseleit液内加入牛磺胆酸钠。从分泌胆汁量来看，HYD组明显多于LR组(12h)，而略多于UW组，这与能量物质含量变化基本一致，但HYD组与UW组差异无显著性。流出液酶学指标不仅可以反映肝细胞损伤程度，而且可以间接反映肝脏再灌注后微循环状况。本实验Krebs-Henseleit液ALT、LDH含量提示，HYD液与UW液同样对鼠肝细胞损伤轻，对肝微循环打击小。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39470682)
作者单位：孙 备(150001 哈尔滨医科大学第一临床医学院普通外科)
姜洪池(150001 哈尔滨医科大学第一临床医学院普通外科)
赵金鹏(150001 哈尔滨医科大学第一临床医学院普通外科)
参考文献
[1]马丽英， 张乃忠， 刑红. 快速等浓度洗脱高效液相色谱法测定心肌组织的能量物质. 中国病理生理杂志， 1992， 8：140-143.
[2]常英姿， 梁殿权， 王孝铭. 丹参素对氧自由基所致大鼠心肌线粒体H+-ATP酶损伤的保护作用. 中国病理生理杂志， 1991， 7：449-452.
[3]李幼生. 低温保存器官的能量代谢与生存能力的关系. 中华器官移植杂志， 1994， 16：185-187.
[4]孙备， 姜洪池. 肝移植体保存-再灌注损伤. 国外医学外科学分册， 1997， 2：88-91.
[5]Kamiike W. Correlation between cellular ATP level and bile excretion in rat liver. Transplantation, 1985, 39:50-57., 百拇医药
孙备 姜洪池 赵金鹏
摘要 目的：研究自制HYD液对大鼠肝脏低温保存后生化功能的影响。方法：采用大鼠肝脏非循环离体灌注模型，比较HYD液、UW液和乳酸林格液(LR液)对大鼠肝脏6、12、24、30、36h保存后生化功能的影响。结果：保存12h的肝脏，其各项生化功能HYD组明显优于LR组(P<0.05)。三磷酸腺苷(ATP)、磷酸腺苷(TAN)含量及Atkinson能荷(AEC)，HYD组略高于UW组，且保存36h差异有显著性(P<0.05)。线粒体H+-ATP酶水解活性及肝脏分泌胆汁量，HYD组略高于UW组，但差异无显著性(P>0.05)。保存30、36h后保存液pH值，HYD组明显高于UW组(P<0.05)。流出液酶学含量，HYD组与UW组差异无显著性(P>0.05)。结论：HYD液保存鼠肝12h效果明显优于LR液，保存36h与UW液相当，在改善低温保存及再灌注肝脏能量代谢、预防细胞内酸中毒、分泌胆汁量及肝脏原位灌洗等方面，HYD液略优于UW液。
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关键词：肝脏 灌洗 保存液
我们研制出一种以蔗糖为主要非渗透性因子、具有极强缓冲能力、含有三种中药的等渗保存液-HYD液。观察该液对大鼠肝脏冷保存后生化功能的影响，并与乳酸林格液(LR液)、UW液进行了比较。
材料和方法
一、实验动物及分组
Wister纯种大鼠96只，由哈尔滨医科大学附一医院实验动物中心提供，体重(250±20)g，雌雄不限。根据使用灌洗保存液的种类将大鼠随机分为HYD组(n=40)、UW组(n=40)和LR组(n=16)。再根据不同保存时间分别将HYD组、UW组分为保存6、12、24、30、36h5个亚组，将LR组分为保存6、12h2个亚组，每个亚组8只大鼠。
二、灌洗保存液
, 百拇医药
UW液购于美国DupontCriticalCare公司，LR液购于中国大冢制药公司，成分均为标准配方。HYD液成分见表1。
表1 HYD保存液的组成
成分
含量
蔗糖
120(mmol/L)
棉子糖
30(mmol/L)
组氨酸
90(mmol/L)
磷酸二氢钾
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40(mmol/L)
硫酸镁
5(mmol/L)
药物H
400(mg/L)
药物Y
400(mg/L)
药物D
600(mg/L)
注：pH值7.40±0.02；渗透压：(320±5)mOsm/L
三、动物模型
以大鼠离体肝脏灌注(IPRL)为肝脏保存再灌注模型：腹部“+”切口入腹，经下腔静脉注入2.5万U/L肝素生理盐水2ml，分离胆管、门静脉，插入导管后立即开始灌注0℃灌洗液20ml，切取肝脏后置于0℃该灌洗液中保存。按各组不同时间保存后，将肝脏经门静脉恒温37℃行再灌注30min。实验采取非循环灌注，再灌注液为Kreb-Henseleit，其中另加入20μmol/L牛磺胆酸钠。
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四、检测指标
1.肝组织能量物质测定：利用快速等浓度高效液相色谱技术[1]，检测肝脏不同保存时间再灌注30min后三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、腺苷酸(AMP)，计算磷酸腺苷(TAN)总量和Atkinson能荷(AEC)。TAN=ATP+ADP+AMP，ACE=(ATP+0.5ADP)/TAN。
2.肝脏线粒体H+-ATP酶水解活性测定：采用定磷法检测肝脏低温保存再灌注30min后线粒体H+-ATP酶水解活性[2]。
3.保存液pH值测定：检测肝脏低温保存后各保存液pH值。
4.分泌胆汁量测定：收集离体灌注30min内大鼠肝脏分泌胆汁总量。
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6.统计：实验结果以x±s表示，采用t检验，以P<0.05为差异有显著性。
结 果
一、肝细胞能量物质含量见表2。随着保存时间的延长，肝组织ATP、TAN含量及AEC逐渐降低，LR组尤为明显。LR组保存12h肝组织ATP、TAN含量及AEC明显低于UW组和HYD组(P<0.05)。HYD组ATP、TAN含量及AEC较UW组下降略为缓慢，且保存36h明显高于UW组(P<0.05)。
表2 肝组织保存不同时间的能量物质含量(x±s)
组别
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保存
时间(h)
肝组织能量物质含量(μmol/g)
ATP
ADP
AMP
TAN
AEC
LR组
6
7.05±0.95
5.20±0.84
3.90±0.62
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16.15±2.41
0.60±0.08
12
2.52±0.31*
3.90±0.68
5.75±0.92
12.47±1.91*
0.24±0.03*
UW组
6
7.45±0.85
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5.24±0.70
3.85±0.61
16.54±2.16
0.61±0.07
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6.58±0.81
4.85±0.60
4.25±0.48
15.68±1.89
0.57±0.05
24
4.80±0.52
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4.05±0.57
6.08±0.91
14.93±2.00
0.46±0.05
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3.52±0.41
3.80±0.39
5.86±0.74
13.18±1.54
0.42±0.04
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3.08±0.31#
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2.98±0.32
5.66±0.64
11.72±1.27#
0.39±0.03#
HYD组
6
7.58±0.84
5.30±0.78
3.88±0.62
16.76±2.24
0.61±0.08
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6.80±0.81
4.85±0.61
4.12±0.39
15.87±1.81
0.58±0.05
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4.95±0.71
4.20±0.63
6.16±0.81
15.31±2.15
0.47±0.04
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4.05±0.39
4.12±0.52
5.44±0.49
13.61±1.40
0.45±0.04
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3.94±0.31
3.92±0.28
5.73±0.59
13.59±1.18
0.44±0.04
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注：*与UW组和HYD组相比，P<0.05；#与HYD组相比，P<0.05
二、肝脏线粒体H+-ATP酶水解活性：该酶活性随着保存时间延长而降低，LR组为著。保存12h，LR组(0.24μmol.mg-1.min-1)明显低于UW组(0.52μmol.mg-1.min-1，P<0.05)和HYD组(0.54μmol.mg-1.min-1，P<0.05)，其他各保存时间HYD组较UW组略高，但差异无显著性。
三、保存液pH值：肝组织保存6、12h后，保存液pH值LR组(7.20，6.95)明显低于UW组(7.38，7.32，P<0.05)和HYD组(7.38，7.36，P<0.05)；保存30、36h后，UW组pH值(7.20、7.18)显著低于HYD组(7.33，7.32，P<0.05)。
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四、分泌胆汁量见表3。肝组织保存12h，检测胆汁分泌量LR组显著低于UW组和HYD组(P<0.05)。UW组胆汁分泌量略低于HYD组，但差异无显著性。
五、流出液酶学结果见表3。随着保存时间延长，流出液中ALT、LDH逐渐升高，LR组升高明显。UW组与HYD组同步升高，差异无显著性。
表3 肝组织保存不同时间的流出液中酶学变化及分泌胆汁量(x±s)
组别
保存时
间(h)
流出液中酶含量(U/L)
胆汁量
(μl/30min)
, 百拇医药
ALT
LDH
LR组
6
71.2±8.5
188.4±21.5
77.2±6.4
12
134.0±12.3*
432.7±41.6*
28.7±4.1*
UW组
, 百拇医药
6
65.4±7.9
168.5±19.4
84.6±8.1
12
74.8±7.6
189.4±20.2
78.1±6.2
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84.5±8.4
207.8±23.4
60.4±5.8
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30
96.8±9.2
212.4±21.5
48.1±5.1
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98.4±10.1
225.7±23.4
34.0±4.1
HTD组
6
68.7±6.4
160.5±12.5
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88.4±7.9
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72.6±6.3
192.7±18.4
82.4±6.8
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87.4±7.1
214.8±22.5
62.8±5.2
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221.3±24.2
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51.4±4.9
36
102.7±9.5
229.4±25.6
38.5±4.2
*与UW组和HYD组相比，P<0.05
讨 论
我们研制的HYD多器官保存液是在全面细致分析UW液、HTK液配方的基础上，加以改良，并应用三种中药成分，即集中UW液、HTK液及祖国医学的优点，主要特点为：(1)以蔗糖替代UW液中乳果糖为主要非渗透性因子；(2)应用HTK液中组氨酸成分(90mmol/L)，并提高UW液中磷酸二氢钾浓度至40mmol/L，使该溶液具有极强的缓冲能力；(3)应用H、Y、D三种中药改善低温保存及再灌注能量代谢，防止再灌注时氧自由基损伤；(4)去掉UW液中多种添加成分，尤其是羟乙基淀粉，降低保存液粘稠度。改良的目的是：降低成本，增加保存效果，简化配制，方便储存、运输及使用。
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组织中能量物质与保存器官生存能力密切相关。Bowers首次证实保存肝脏ATP、TAN含量及AEC与术后生存率成正比[3-4]。本实验观察到肝组织ATP、TAN含量及AEC随保存时间延长而逐渐降低，LR组尤为明显，HYD组在各保存时间中能量物质含量均略高于UW组，且保存36h差异有显著性(P<0.05)。因此，我们认为改善肝脏低温保存及再灌注时能量代谢是HYD液有效保存肝脏的重要因素之一。线粒体H+-ATP酶是能量转换单位，它在线粒体膜的氧化磷酸化能量偶联反应中、在需能的离子转运和DNA复制的能量偶联反应中起着中心作用。本实验线粒体H+-ATP酶水解活性在各组的变化情况再次证明HYD液对保护肝细胞线粒性氧化磷酸化功能完整性起着重要作用。
保持溶液的缓冲能力、预防细胞内酸中毒也十分重要。HYD液含有磷酸二氢钾-组氨酸极强的缓冲体系，缓冲能力明显优于LR液、UW液。
肝脏分泌胆汁量是反映肝脏保存质量的一项敏感指标，因为肝细胞分泌胆汁是一个耗能过程，分泌胆汁量与肝细胞ATP浓度呈Michaelis-Menten曲线关系[5]。大鼠胆汁分泌为胆盐依赖性，故本实验Krebs-Henseleit液内加入牛磺胆酸钠。从分泌胆汁量来看，HYD组明显多于LR组(12h)，而略多于UW组，这与能量物质含量变化基本一致，但HYD组与UW组差异无显著性。流出液酶学指标不仅可以反映肝细胞损伤程度，而且可以间接反映肝脏再灌注后微循环状况。本实验Krebs-Henseleit液ALT、LDH含量提示，HYD液与UW液同样对鼠肝细胞损伤轻，对肝微循环打击小。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39470682)
作者单位：孙 备(150001 哈尔滨医科大学第一临床医学院普通外科)
姜洪池(150001 哈尔滨医科大学第一临床医学院普通外科)
赵金鹏(150001 哈尔滨医科大学第一临床医学院普通外科)
参考文献
[1]马丽英， 张乃忠， 刑红. 快速等浓度洗脱高效液相色谱法测定心肌组织的能量物质. 中国病理生理杂志， 1992， 8：140-143.
[2]常英姿， 梁殿权， 王孝铭. 丹参素对氧自由基所致大鼠心肌线粒体H+-ATP酶损伤的保护作用. 中国病理生理杂志， 1991， 7：449-452.
[3]李幼生. 低温保存器官的能量代谢与生存能力的关系. 中华器官移植杂志， 1994， 16：185-187.
[4]孙备， 姜洪池. 肝移植体保存-再灌注损伤. 国外医学外科学分册， 1997， 2：88-91.
[5]Kamiike W. Correlation between cellular ATP level and bile excretion in rat liver. Transplantation, 1985, 39:50-57., 百拇医药