雌激素对实验性骨质疏松症骨折愈合的影响
黄遂柱 赵永强 陈风苞 李甲振
摘要 目的：研究不同剂量的雌激素对卵巢摘除后发生骨质疏松小鼠股骨骨折愈合的影响。方法：成年balb/c小鼠卵巢摘除后3个月开始制作右股骨中段闭合骨折模型，同一天开始皮下注射高低两种剂量雌激素，小鼠于折骨后5、10、15、20、30天分批处死，采用X射线、骨痂称重、骨痂中钙盐沉积率测定、组织学检查、血清生化检测等方法研究雌激素对骨折愈合的影响，并和卵巢摘除组、假手术对照组进行比较。结果：卵巢摘除组骨痂较小，但软骨痂钙化(骨痂成熟)时间未受到明显影响。高剂量雌激素可使软骨痂钙化时间推迟，干扰了骨痂成熟过程；生理剂量的雌激素对骨痂成熟影响较小。结论：雌激素缺乏和补充超生理剂量雌激素均对去势小鼠骨折早期愈合不利，补充生理剂量雌激素对小鼠骨折愈合影响较小。
关键词：雌二醇 卵巢摘除 骨折愈合 骨质疏松
绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMO)是老年妇女的多发病，雌激素替代疗法(estrogen replacement therapy,ERT)是防治PMO、减少骨折发生的有效措施[1]，但雌激素对骨折愈合的影响，有关研究和报道较少，目前尚未有肯定的结论。钙盐沉积是骨折愈合中的重要过程，是骨折愈合的关键性步骤，采用45Ca标记的方法，可以精确测得不同时期的骨痂中的钙盐沉积值。本研究以balb/c纯种小鼠作为去势动物模型，采用拍片、骨痂中钙盐沉积率测定、组织学分析等手段，研究补充不同剂量雌激素对卵巢摘除后已出现明显骨丢失小鼠骨折愈合的影响，为完善ERT疗法提供实验依据。
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1 材料与方法
1.1 动物分组与手术：实验采用balb/c系小鼠160只(河南省实验动物中心提供)，月龄4～5个月。随机均分为4组：假手术组(SO组)40只，仅做开关腹手术，不摘除卵巢；卵巢摘除组(OVX组)40只，低剂量雌激素组(E1组)40只和高剂量雌激素组(E2组)40只，均摘除双侧卵巢。手术方法是：乙醚麻醉下，行无菌操作，采用经腹切口，依次摘除双侧卵巢，术后不用抗生素，动物每周称一次体重。
1.2 给药与折骨：各组动物术后3个月开始制作右股骨中段闭合骨折模型(每组各取6只动物，留作测定血清雌二醇水平)。方法是：在乙醚麻醉下，用特制的骨折器在小鼠右大腿中部折断股骨，动物折骨后任其自由活动。同一天开始背部皮下注射雌激素，E1组给予10μg/ml浓度的苯甲酸雌二醇，E2组给予50μg/ml浓度的苯甲酸雌二醇，SO组和OVX组皮下注射同等剂量的精制茶油，每三天给药一次，每次每公斤体重4ml(苯甲酸雌二醇和精制茶油为上海第九制药厂生产)。
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1.3 骨折处X射线摄片(条件：36kV、6.4mAs，投照距离100cm)，在骨折后不同时期动物麻醉后摄片，观察骨折愈合情况。
1.4 钙盐沉积率测定：动物在折骨后的第5天、10天、15天、20天和30天处死，在处死前24小时腹腔内注射同位素45CaCl2溶液，每只给药量1.85×107Bq/kg(同位素45Ca由中国原子能科学院同位素所提供)。动物处死后立即取出右股骨，置10% Formalin溶液中固定24小时，取出后仔细剔除附着的软组织，然后在小转子下方1mm及髌股关节面上方1mm之间截取右股骨中段带骨痂的标本，吸水纸吸干表面水份后称标本湿重，然后放入容量20毫升的闪烁杯中，每只标本加入60% HClO4 0.1ml，30% H2O2 0.2ml，置80℃水溶锅中恒温1.5小时消化完全后，再加入bu-PBD闪烁液(500毫升二甲苯中加入bu-PBD5克)6ml，乙二醇乙醚5ml，摇匀后，在Beckman LS5801型液闪计数仪上测定标本中45Ca的放射性(用cpm值表示)。
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1.5 组织学检查：每组每批取2个骨痂标本，5%甲酸甲醛脱钙后，常规石蜡包埋、切片，HE染色后进行光镜观察，了解骨痂成熟的过程。
1.6 血清雌二醇水平测定：动物在处理前采眼眶血，分离出血清，用天津德普公司提供的雌激素放免测定药盒，测定血清雌二醇水平。
1.7 统计学处理：数据均以均数±标准差表示，差异性判断通过组间t检验进行统计学分析。
2 结果
2.1 一般资料：160只小鼠在实验过程中有2例死亡(SO组和E2组各1只)，6只因骨折处错位明显而剔除，骨折部位均位于股骨中1/3处，各组除处理因素外，可比条件相同。
2.2 放射学检查结果：骨折后5天均未见骨痂显像，10天时OVX组可见少量骨痂显影，E2组几乎无骨痂显像，SO组和E1组骨痂量也较少。15天时各组均可见明显骨痂，但E2组骨痂密度较低。20天和30天时各组骨痂均可见较高密度影，但E2组骨痂最大，OVX组骨痂最小，SO组和E1组骨痂量比较接近。
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2.3 骨痂重量的变化(见表1)：E2组骨痂重量在骨折后20天达到最大值，其余各组骨痂重量15天达最大值然后逐渐下降。除骨折后15天SO组骨痂重量大于E2组外，余各组不同时期骨痂重量无显著性差异(P>0.05)。
2.4 骨痂中钙盐沉积量的测量(见表2)：以骨痂同位素45Ca的放射活性高低(cpm值)作为评价骨折局部钙盐沉积量(24小时内)多少的指标，并以骨痂重量纠正后得出单位重量骨痂中的钙盐沉积量进行统计分析。
表1 骨折后不同时期各组小鼠的骨痂重量(mg,x±s)
动物组别
折骨后的天数
5
10
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15
20
30
SO
20.1±1.0
71.6±7.0
81.2±7.2
75.6±11.6
68.8±8.4
OVX
20.5±1.5
66.3±7.3
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72.6±6.9
64.5±8.1
E1
20.3±1.2
69.2±4.7
69.2±4.7
75.1±7.0
69.7±6.7
E2
20.9±0.7
67.1±10.3
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69.4±7.2
77.7±8.3
70.44±7.7
注：与SO组比较 *P<0.05表2 各组小鼠折骨后不同时期骨折局部的钙盐沉积量(x±s)
动物分组
折骨后的天数
5
10
15
20
30
SO组
, http://www.100md.com
589.48±67.46
1204.24±173.09
2591.12±296.02
2344.13±255.94
1895.42±191.10
OVX组
629.06±78.63
1020.22±151.92
2229.14±275.27*
1961.05±237.48*
, 百拇医药
1445.78±108.82*
E1组
560.1±74.20
1144.03±140.85
2642.94±217.46
2308.97±155.11
1923.85±147.91
E2组
537.07±69.68
896.44±193.09*
, http://www.100md.com
2039.78±155.38**
2752.10±276.14*
1955.52±305.18
注：与SO组比较*P<0.05，**P<0.01
2.5 组织学检查结果：骨折后第5天骨折处以血肿为主，两端有纤维成分和岛状软骨，细胞增生活跃。10天时软骨成分及破骨细胞数量增多，OVX组软骨及软骨内骨化较SO组、E2组稍多。15天时，OVX组可见软骨内骨化明显增多，而E2组仍以软骨为主。20天时，E2组也见大量软骨内骨化，其它组骨痂进一步成熟。30天时，各组骨痂均较成熟，但OVX组骨小梁较细，间隙较大，可见小梁中断破坏，呈疏松化表现。
2.6 血清雌二醇水平测定：OVX组小鼠血清雌二醇水平显著低于SO组(P<0.05)，E1组小鼠血清雌二醇水平接近SO组，E2组小鼠雌二醇水平显著高于SO组(P<0.01)。
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表3 小鼠卵巢摘除后及补充雌激素后血清雌二醇水平的变化(x±s)
动物分组
样本数
血清雌二醇水平(μg/ml)
SO
6
52.93±28.97
OVX
6
7.93±3.15*
E1
, 百拇医药 6
91.34±21.69
E2
6
532.54±256.60**
注：与SO组比较 *P<0.05，P<0.013 讨论
实验结果表明，正常小鼠股骨骨折后第5天局部主要是血肿和机化组织，10～15天以纤维和软骨为主，20～30天则为软骨和骨性连结。骨痂重量在骨折后15天(E2组为20天)达到最大值，同骨痂中钙盐沉积量的峰值同期出现，可能和钙盐大量沉积前骨痂中的软骨细胞大量增殖有关[2]。OVX组的钙盐沉积量峰值显著低于SO组(P<0.05)；E1组钙盐沉积量的变化同SO组，钙盐沉积量峰值两组间无显著差异(P>0.05)；E2组钙盐沉积量峰值推迟至骨折后20天才出现。
, 百拇医药
Bruce和Boden发现兔骨折愈合早期骨痂中雌激素受体浓度呈现有意义的增加，他认为雌激素对骨折愈合中的钙盐沉积有促进作用[3]。但本研究却发现高剂量雌激素使小鼠骨折愈合中的钙盐沉积量峰值推迟出现，组织学检查发现骨痂成熟推迟，从而对早期骨折愈合不利。有资料表明，骨折早期局部血肿及无菌性炎症反应对骨折有利[4]。临床上有刺激局部炎症反应而加速骨折愈合的例子，也有减轻局部炎症反应导致骨折愈合延迟的报道[5]。超生理剂量雌激素对机体的细胞和体液免疫均有抑制作用[6]。雌激素能降低骨组织中PGE2浓度[7]。因此，高剂量的雌激素很可能通过减轻局部炎症反应而妨碍骨折的愈合。值得注意的是，虽然E2组钙盐沉积量峰值推迟出现，但其量却大于SO组(P<0.05)。因此，雌激素促进骨折愈合中的钙盐沉积，主要表现在量上，而不是表现在时间上。
对于卵巢摘除组，虽然钙盐沉积的峰值和SO组相一致，但骨折后各期(骨折后5天除外)钙盐沉积量均低于SO组，而且骨折后30天也可见骨痂骨小梁疏松，并且可见小梁中断、游离，说明低雌激素状态对骨折愈合不利，其原因除了雌激素水平降低外，也和卵巢摘除后的钙磷代谢紊乱有关。另外说明在骨折愈合过程中，骨痂的形成和重建与生理状态下的骨重建过程相似，卵巢摘除后骨转换加快，成骨活动和破骨活动均加强，但破骨活动超过成骨活动，从而造成了骨质丢失[8]。在补充接近生理剂量雌激素的E1组，钙盐沉积的峰值和SO组相一致，而且各期的钙盐沉积值和SO组相比无显著性差异。说明补充生理剂量的雌激素，能够使其骨折愈合中钙盐沉积过程恢复正常。因此，绝经后骨质疏松患者骨折愈合变慢除受老龄的影响外，还可能和低雌激素状态引起的钙磷代谢紊乱有关。
, 百拇医药
从本实验的结果看，补充高剂量雌激素和卵巢摘除后的低雌激素状态均妨碍骨折愈合，这种影响主要表现在骨折愈合的早期，至于它们对晚期骨痂塑形的影响还有待于进一步研究。尤其是在分子水平上进一步探索雌激素在骨折愈合中的作用机制，将成为今后研究的重要课题，而这一工作的开展必将带动雌激素和骨代谢关系研究的深入，为绝经后骨质疏松症骨折预防和治疗提供理论依据。
作者单位：黄遂柱(河南省人民医院骨科，450003)
赵永强(河南省人民医院骨科，450003)
陈风苞(河南医科大学一附院骨科)
李甲振(河南医科大学一附院骨科)
参考文献
1 Lindsay RB.Hormone replacement therapy for prevention and treatment of osteoporosis. Am J Med,1993,95:375.
, 百拇医药
2 陈其昕、袁中兴、刘清等.骨折愈合中修复性细胞增殖与骨形成的关系.中华骨科杂志，1992，12(4)：290.
3 Bruce AM,Fredetick SK,Michael DF,et al.Estrogen receptors in fracture healing.Clin Orthop,1992,280:277.
4 Gramdnes O,Keikeras O.The importance of the hematoma for fracture healing in rats.Acta Orthop Scand,1993,64:350.
5 谢旭明，沈伯祥，王江.骨折愈合刺激素的临床疗效与观察.中华外科杂志，1993，21：585.
6 刘村兰，匡彦德，何球藻.雌二醇对大鼠细胞免疫功能的影响.中国免疫学杂志，1992，8：95.
7 Feyen JHM and Raise LG.Prostaglandin production by calvaria from sham operated and oophorectomized rats:effect of 17β-estradiol in vivo.Endocrinology.1987,121:819.
8 Kalu DN.The ovariectomized rat model of postmenopausal bone loss.Bone Miner 1991，15:175., http://www.100md.com
摘要 目的：研究不同剂量的雌激素对卵巢摘除后发生骨质疏松小鼠股骨骨折愈合的影响。方法：成年balb/c小鼠卵巢摘除后3个月开始制作右股骨中段闭合骨折模型，同一天开始皮下注射高低两种剂量雌激素，小鼠于折骨后5、10、15、20、30天分批处死，采用X射线、骨痂称重、骨痂中钙盐沉积率测定、组织学检查、血清生化检测等方法研究雌激素对骨折愈合的影响，并和卵巢摘除组、假手术对照组进行比较。结果：卵巢摘除组骨痂较小，但软骨痂钙化(骨痂成熟)时间未受到明显影响。高剂量雌激素可使软骨痂钙化时间推迟，干扰了骨痂成熟过程；生理剂量的雌激素对骨痂成熟影响较小。结论：雌激素缺乏和补充超生理剂量雌激素均对去势小鼠骨折早期愈合不利，补充生理剂量雌激素对小鼠骨折愈合影响较小。
关键词：雌二醇 卵巢摘除 骨折愈合 骨质疏松
绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMO)是老年妇女的多发病，雌激素替代疗法(estrogen replacement therapy,ERT)是防治PMO、减少骨折发生的有效措施[1]，但雌激素对骨折愈合的影响，有关研究和报道较少，目前尚未有肯定的结论。钙盐沉积是骨折愈合中的重要过程，是骨折愈合的关键性步骤，采用45Ca标记的方法，可以精确测得不同时期的骨痂中的钙盐沉积值。本研究以balb/c纯种小鼠作为去势动物模型，采用拍片、骨痂中钙盐沉积率测定、组织学分析等手段，研究补充不同剂量雌激素对卵巢摘除后已出现明显骨丢失小鼠骨折愈合的影响，为完善ERT疗法提供实验依据。
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1 材料与方法
1.1 动物分组与手术：实验采用balb/c系小鼠160只(河南省实验动物中心提供)，月龄4～5个月。随机均分为4组：假手术组(SO组)40只，仅做开关腹手术，不摘除卵巢；卵巢摘除组(OVX组)40只，低剂量雌激素组(E1组)40只和高剂量雌激素组(E2组)40只，均摘除双侧卵巢。手术方法是：乙醚麻醉下，行无菌操作，采用经腹切口，依次摘除双侧卵巢，术后不用抗生素，动物每周称一次体重。
1.2 给药与折骨：各组动物术后3个月开始制作右股骨中段闭合骨折模型(每组各取6只动物，留作测定血清雌二醇水平)。方法是：在乙醚麻醉下，用特制的骨折器在小鼠右大腿中部折断股骨，动物折骨后任其自由活动。同一天开始背部皮下注射雌激素，E1组给予10μg/ml浓度的苯甲酸雌二醇，E2组给予50μg/ml浓度的苯甲酸雌二醇，SO组和OVX组皮下注射同等剂量的精制茶油，每三天给药一次，每次每公斤体重4ml(苯甲酸雌二醇和精制茶油为上海第九制药厂生产)。
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1.3 骨折处X射线摄片(条件：36kV、6.4mAs，投照距离100cm)，在骨折后不同时期动物麻醉后摄片，观察骨折愈合情况。
1.4 钙盐沉积率测定：动物在折骨后的第5天、10天、15天、20天和30天处死，在处死前24小时腹腔内注射同位素45CaCl2溶液，每只给药量1.85×107Bq/kg(同位素45Ca由中国原子能科学院同位素所提供)。动物处死后立即取出右股骨，置10% Formalin溶液中固定24小时，取出后仔细剔除附着的软组织，然后在小转子下方1mm及髌股关节面上方1mm之间截取右股骨中段带骨痂的标本，吸水纸吸干表面水份后称标本湿重，然后放入容量20毫升的闪烁杯中，每只标本加入60% HClO4 0.1ml，30% H2O2 0.2ml，置80℃水溶锅中恒温1.5小时消化完全后，再加入bu-PBD闪烁液(500毫升二甲苯中加入bu-PBD5克)6ml，乙二醇乙醚5ml，摇匀后，在Beckman LS5801型液闪计数仪上测定标本中45Ca的放射性(用cpm值表示)。
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1.5 组织学检查：每组每批取2个骨痂标本，5%甲酸甲醛脱钙后，常规石蜡包埋、切片，HE染色后进行光镜观察，了解骨痂成熟的过程。
1.6 血清雌二醇水平测定：动物在处理前采眼眶血，分离出血清，用天津德普公司提供的雌激素放免测定药盒，测定血清雌二醇水平。
1.7 统计学处理：数据均以均数±标准差表示，差异性判断通过组间t检验进行统计学分析。
2 结果
2.1 一般资料：160只小鼠在实验过程中有2例死亡(SO组和E2组各1只)，6只因骨折处错位明显而剔除，骨折部位均位于股骨中1/3处，各组除处理因素外，可比条件相同。
2.2 放射学检查结果：骨折后5天均未见骨痂显像，10天时OVX组可见少量骨痂显影，E2组几乎无骨痂显像，SO组和E1组骨痂量也较少。15天时各组均可见明显骨痂，但E2组骨痂密度较低。20天和30天时各组骨痂均可见较高密度影，但E2组骨痂最大，OVX组骨痂最小，SO组和E1组骨痂量比较接近。
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2.3 骨痂重量的变化(见表1)：E2组骨痂重量在骨折后20天达到最大值，其余各组骨痂重量15天达最大值然后逐渐下降。除骨折后15天SO组骨痂重量大于E2组外，余各组不同时期骨痂重量无显著性差异(P>0.05)。
2.4 骨痂中钙盐沉积量的测量(见表2)：以骨痂同位素45Ca的放射活性高低(cpm值)作为评价骨折局部钙盐沉积量(24小时内)多少的指标，并以骨痂重量纠正后得出单位重量骨痂中的钙盐沉积量进行统计分析。
表1 骨折后不同时期各组小鼠的骨痂重量(mg,x±s)
动物组别
折骨后的天数
5
10
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15
20
30
SO
20.1±1.0
71.6±7.0
81.2±7.2
75.6±11.6
68.8±8.4
OVX
20.5±1.5
66.3±7.3
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72.6±6.9
64.5±8.1
E1
20.3±1.2
69.2±4.7
69.2±4.7
75.1±7.0
69.7±6.7
E2
20.9±0.7
67.1±10.3
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69.4±7.2
77.7±8.3
70.44±7.7
注：与SO组比较 *P<0.05表2 各组小鼠折骨后不同时期骨折局部的钙盐沉积量(x±s)
动物分组
折骨后的天数
5
10
15
20
30
SO组
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589.48±67.46
1204.24±173.09
2591.12±296.02
2344.13±255.94
1895.42±191.10
OVX组
629.06±78.63
1020.22±151.92
2229.14±275.27*
1961.05±237.48*
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1445.78±108.82*
E1组
560.1±74.20
1144.03±140.85
2642.94±217.46
2308.97±155.11
1923.85±147.91
E2组
537.07±69.68
896.44±193.09*
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2039.78±155.38**
2752.10±276.14*
1955.52±305.18
注：与SO组比较*P<0.05，**P<0.01
2.5 组织学检查结果：骨折后第5天骨折处以血肿为主，两端有纤维成分和岛状软骨，细胞增生活跃。10天时软骨成分及破骨细胞数量增多，OVX组软骨及软骨内骨化较SO组、E2组稍多。15天时，OVX组可见软骨内骨化明显增多，而E2组仍以软骨为主。20天时，E2组也见大量软骨内骨化，其它组骨痂进一步成熟。30天时，各组骨痂均较成熟，但OVX组骨小梁较细，间隙较大，可见小梁中断破坏，呈疏松化表现。
2.6 血清雌二醇水平测定：OVX组小鼠血清雌二醇水平显著低于SO组(P<0.05)，E1组小鼠血清雌二醇水平接近SO组，E2组小鼠雌二醇水平显著高于SO组(P<0.01)。
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表3 小鼠卵巢摘除后及补充雌激素后血清雌二醇水平的变化(x±s)
动物分组
样本数
血清雌二醇水平(μg/ml)
SO
6
52.93±28.97
OVX
6
7.93±3.15*
E1
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91.34±21.69
E2
6
532.54±256.60**
注：与SO组比较 *P<0.05，P<0.013 讨论
实验结果表明，正常小鼠股骨骨折后第5天局部主要是血肿和机化组织，10～15天以纤维和软骨为主，20～30天则为软骨和骨性连结。骨痂重量在骨折后15天(E2组为20天)达到最大值，同骨痂中钙盐沉积量的峰值同期出现，可能和钙盐大量沉积前骨痂中的软骨细胞大量增殖有关[2]。OVX组的钙盐沉积量峰值显著低于SO组(P<0.05)；E1组钙盐沉积量的变化同SO组，钙盐沉积量峰值两组间无显著差异(P>0.05)；E2组钙盐沉积量峰值推迟至骨折后20天才出现。
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Bruce和Boden发现兔骨折愈合早期骨痂中雌激素受体浓度呈现有意义的增加，他认为雌激素对骨折愈合中的钙盐沉积有促进作用[3]。但本研究却发现高剂量雌激素使小鼠骨折愈合中的钙盐沉积量峰值推迟出现，组织学检查发现骨痂成熟推迟，从而对早期骨折愈合不利。有资料表明，骨折早期局部血肿及无菌性炎症反应对骨折有利[4]。临床上有刺激局部炎症反应而加速骨折愈合的例子，也有减轻局部炎症反应导致骨折愈合延迟的报道[5]。超生理剂量雌激素对机体的细胞和体液免疫均有抑制作用[6]。雌激素能降低骨组织中PGE2浓度[7]。因此，高剂量的雌激素很可能通过减轻局部炎症反应而妨碍骨折的愈合。值得注意的是，虽然E2组钙盐沉积量峰值推迟出现，但其量却大于SO组(P<0.05)。因此，雌激素促进骨折愈合中的钙盐沉积，主要表现在量上，而不是表现在时间上。
对于卵巢摘除组，虽然钙盐沉积的峰值和SO组相一致，但骨折后各期(骨折后5天除外)钙盐沉积量均低于SO组，而且骨折后30天也可见骨痂骨小梁疏松，并且可见小梁中断、游离，说明低雌激素状态对骨折愈合不利，其原因除了雌激素水平降低外，也和卵巢摘除后的钙磷代谢紊乱有关。另外说明在骨折愈合过程中，骨痂的形成和重建与生理状态下的骨重建过程相似，卵巢摘除后骨转换加快，成骨活动和破骨活动均加强，但破骨活动超过成骨活动，从而造成了骨质丢失[8]。在补充接近生理剂量雌激素的E1组，钙盐沉积的峰值和SO组相一致，而且各期的钙盐沉积值和SO组相比无显著性差异。说明补充生理剂量的雌激素，能够使其骨折愈合中钙盐沉积过程恢复正常。因此，绝经后骨质疏松患者骨折愈合变慢除受老龄的影响外，还可能和低雌激素状态引起的钙磷代谢紊乱有关。
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从本实验的结果看，补充高剂量雌激素和卵巢摘除后的低雌激素状态均妨碍骨折愈合，这种影响主要表现在骨折愈合的早期，至于它们对晚期骨痂塑形的影响还有待于进一步研究。尤其是在分子水平上进一步探索雌激素在骨折愈合中的作用机制，将成为今后研究的重要课题，而这一工作的开展必将带动雌激素和骨代谢关系研究的深入，为绝经后骨质疏松症骨折预防和治疗提供理论依据。
作者单位：黄遂柱(河南省人民医院骨科，450003)
赵永强(河南省人民医院骨科，450003)
陈风苞(河南医科大学一附院骨科)
李甲振(河南医科大学一附院骨科)
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