脑膜瘤血管内皮细胞生长因子与瘤周脑水肿关系的研究
脑膜瘤血管内皮细胞生长因子与瘤周脑水肿关系的研究
张志强 赵洪洋 朱贤立
摘 要 目的：了解血管内皮细胞生长因子(VEGF)在脑膜瘤中的表达，探讨VEGF与瘤周脑水肿和微血管形成的关系。 方法：应用免疫组化和免疫印迹技术，检测33例脑膜瘤组织中VEGF蛋白表达与瘤周脑水肿和微血管形成的关系。 结果：脑膜瘤VEGF表达率75%(25/33)，4例可疑表达。VEGF蛋白表达与PVBE(r=0.7352,P<0.01)和微血管形成(r=0.6611,P<0.01)存在肯定的相关关系。 结论：VEGF存在于脑膜瘤组织中，在瘤周脑水肿和微血管形成方面发挥重要作用。
关键词：脑膜瘤 内皮生长因子 脑水肿
, 百拇医药
脑膜瘤周围脑水肿由许多因素引起，脑膜瘤细胞诱导分泌的化学介质作用引起微血管通透性增加和病理性微血管生长是重要因素之一。在这些化学介质中，血管内皮生长因子(VEGF)被认为是作用最强、特异性最高的调控因子。脑膜瘤引起的脑和脑膜血供增加，必须有大量微血管生成，可能引起VEGF上调，增加微血管通透性，引起血浆渗漏加重瘤周脑水肿。我们检测脑膜瘤组织中VEGF免疫活性与瘤周脑水肿及微血管形成的关系。
材料和方法
1.病例和组织标本：随机选取1997年6月～1998年8月同济医科大学附属协和医院脑外科33例手术切除的脑膜瘤标本，男12例；年龄34～68岁，平均49.8岁。女21例；年龄14～67岁，平均45.9岁。脑膜瘤病理类型：合体细胞型8例，过渡细胞型7例，纤维母细胞型9例，血管母细胞型4例，乳头状2例，恶性3例。所有标本都具有最终的病理学诊断和可利用的颅脑MRI或CT。
2.水肿的估计：根据患者的头颅MRI或CT估计水肿程度，参考Goldman等[1]测量脑水肿方法。认真测量包括脑水肿在内的肿瘤大小及肿瘤本身大小，并比较二者之比，比值为1者无脑水肿；再结合有无脑室受压和中线移位确定水肿系数。分5级：0级为无水肿，1级为可疑水肿，2级为轻度水肿，3级为中度水肿，4级为高度水肿。
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3.免疫组化染色及结果判断：常规LSAB技术，设置阳性和阴性对照。鼠抗VEGF单克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品，鼠抗VⅢ因子抗体为武汉博士德公司生产。结果判断：光镜下观察VEGF染色阳性细胞数，表达强弱用系数0～4表示，0为阳性，1为可疑阳性，2为弱阳性，3为中度阳性，4为强阳性。VⅢ因子染色，内皮细胞被染成棕色或棕褐色，成纤维细胞偶有着色，其它细胞不着色，先在低倍镜下全面观察切片确定血管最高密度区域，连续观察5个200倍视野微血管数(一个内皮细胞或一组内皮细胞即为一个微血管)，求其平均数。
4.免疫印迹染色：肿瘤细胞提取液制备参考Jackson等[2]所用方法。缓冲液10 mM Tris,1.5 mM EDTA,1mM MDTT,10%甘油，pH7.4，匀浆后分别
4 ℃ 2000 rPm离心15 min,4 ℃ 18000 rPm离心30 min。将定量的细胞提取液在5%浓缩胶和12%分离胶行SDS-PAGE电泳，中分子量标准蛋白作标准对照，考马斯亮蓝染色，其余部分将蛋白转印至硝酸纤维素滤膜行免疫染色，对VEGF蛋白带观察比较。
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结 果
1.VEGF蛋白表达：33例脑膜瘤标本进行VEGF免疫组化检测，25例明显着色,2例无染色,4例可疑染色,x±s为2.03±0.96。肿瘤细胞间均一染色，细胞巢内强染色，但细胞巢之间有轻微着色或无着色。一部分肿瘤细胞染色较浅，类似于对应标本的瘤周脑组织。一部分内皮细胞轻微着色。3例恶性脑膜瘤(P<0.05)及肿瘤浸润边缘强染色，乳头状脑膜瘤、血管母细胞型及部分合体细胞型脑膜瘤染色较强(P>0.05)。
2.微血管计数：脑膜瘤组织中小动脉、小静脉、毛细血管及内皮细胞均为VⅢ因子染色。不同类型肿瘤，同一肿瘤不同部位微血管密度不均。x±s为60.0±39.7,其中血管母细胞型(x±s为77.6±13.4，P<0.05)和恶性脑膜瘤(P<0.05)微血管计数稍高。
3.PVBE：33例脑膜瘤中29例有不同程度的脑水肿,17例患者有脑室受压和/或中线移位,水肿系数x±s为2.4±1.3。
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4.免疫印迹染色：鼠抗VEGF单克隆抗体染色9例脑膜瘤标本7例表现分子量相当于23 KD VEGF特异蛋白带，余2例23 KD蛋白带较弱，23 KD蛋白带粗大染色较强的2例中1例表现着色较深的46 KD VEGF特异蛋白带，另有4例标本(例3、6、7、8)表现较弱的46KD蛋白带。兔抗VEGF多克隆抗体染色2例标本皆出现14 KD、23 KD、27 KD、46 KD VEGF蛋白带，以23 KD VEGF蛋白带着色较深。
5.VEGF表达与脑水肿及临床指标的关系：VEGF蛋白表达系数与脑水肿系数有显著的相关关系(r=0.7352，P<0.01，图1上)。血管母细胞型有较强的VEGF免疫活性(P<0.05)，恶性脑膜瘤VEGF免疫活性最强(P<0.01)。男女患者有同样程度PVBE，其免疫活性无统计学意义(P>0.05)。
6.VEGF蛋白表达和微血管计数的关系：VEGF蛋白系数与微血管计数进行相关性分析，r=0.6611，P<0.01，存在肯定的相关关系(图1下)。
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图1 VEGF免疫组化染色与脑水肿及微血管计数的关系
讨 论
VEGF是一种高度特异性结合血管内皮细胞的糖蛋白，有4种分子异构体，分别含有121、165、189和206个氨基酸。在胶质瘤组织和细胞中VEGF结构形式为165>121>189>206[3]，在乳腺癌细胞株中121>165>189[4]。作为血管通透因子和增殖因子在肿瘤血管和水肿中提供分子连接物，导致血管通透性增高，血浆蛋白外渗，促进脑水肿并为微血管形成提供前提。VEGF通过其特异性受体flt和flk/KDR直接作用于血管内皮细胞刺激其增殖[5，6]，还通过增强血浆酶原活化因子的特性，提高血浆酶原活化因子mRNA水平和血浆酶原活化因子-1的mRNA水平参与血管形成。
脑膜瘤血供丰富，较易发生脑水肿。在脑膜瘤细胞株中VEGF蛋白存在已被证明，其水平与血管分布有关。我们这组资料经免疫组化染色证明了VEGF在脑膜瘤组织中的存在，其免疫活性和瘤周脑水肿直接相关，支持脑膜瘤是PVBE病理生理的直接作用者，并通过VⅢ因子染色，发现VEGF蛋白免疫活性与微血管生成存在相关关系，肯定VEGF是微血管形成的主要原因之一，这与Goldman等[1]研究结果相似。
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在Western blotting染色中，脑膜瘤细胞提取液中VEGF蛋白异构体形式被观察分析，分子量相当于23 KD及部分标本46 KD免疫反应蛋白带可能为VEGF 165形成，23 KD蛋白带是VEGF 165转化而成的单体。VEGF 121可能转化为分子量为14KD、18KD的单体，VEGF 189转化为27KD的单体[2]。经单克隆抗体和多克隆抗体染色发现在脑膜瘤组织中VEGF 121、189、206存在较少，以VEGF 165为主要形式发挥作用。7例标本中分子量相当于58 KD模糊蛋白带可能来源于鼠单克隆抗体的非特异性反应。例2、8蛋白带较粗大，着色深提示在恶性脑膜瘤和血管母细胞型脑膜瘤中VEGF蛋白表达较高。肿瘤侵袭性高，大量生成的功能和结构异常血管通透性增加，导致渗出增高，进一步加剧微血管生成和PVBE。恶性脑膜瘤临床上有严重的PVBE，而无PVBE的脑膜瘤则表现为一个良性过程，且与脑膜瘤有关的PVBE越严重，较早出现临床症状早期发现的可能性越大。早期手术切除PVBE较严重的侵袭性脑膜瘤，可能进一步加重脑水肿，与手术创伤造成VEGF过高表达有关。
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PVBE还受到其它机制的影响，例如静脉窦的栓塞和内分泌作用。从细胞水平看，VEGF蛋白与黄体酮受体，前列腺素水平存在有意义的关系[7]，溃疡的子宫内膜治疗过程中、妊娠期和月经期脑膜瘤症状的变化皆跟雌激素分泌有关，支持雌激素的刺激作用增强VEGF表达。糖皮质激素能够减轻PVBE[8]，氟美松在活体中能够抑制内皮细胞钙通道开放，通过内皮细胞抑制VEGF产生的信号，降低肿瘤细胞VEGF的表达，从而抑制血管通透性。遗憾的是本研究未能对氟美松治疗过程中脑水肿的变化进行详细的观察。
VEGF在脑膜瘤组织中表达并与瘤周脑水肿存在肯定的相关关系，在PVBE和微血管生成方面发挥重要作用。VEGF 165是VEGF蛋白在脑膜瘤组织中的主要存在形式。
作者单位：张志强 430022 武汉，同济医科大学附属协和医院神经外科
张志强 现在山东省济宁市第一人民医院神经外科，272111
, 百拇医药
赵洪洋 430022 武汉，同济医科大学附属协和医院神经外科
朱贤立 430022 武汉，同济医科大学附属协和医院神经外科
参考文献
[1]Goldman K, Suman B, Palmer A, et al.Brain edema in meningomas is associated with increased vascular endothelial growth factor expression. Neurosurgery, 1997，40:1269-1277.
[2]Jackson W, Bentel M, Tilley D. Vascular endothelial growth factor expression in prostate cancer and benign prostatic hyperplasia. J Urol, 1997,157:2323-2328.
, http://www.100md.com
[3]BeFrkmen RA, Merrill MJ, Reinhold C, et al. Expression of the vascular permeability factor /VEGF gene in the central nervous system neoplasms, J Clin Invest，1993,91:153-159.
[4]Scott AE, Gleadle M, Bicknell R, et al. Role of the hypoxia sensing system, acidity and reproductive hormones in the varibility of vascular endothelial growth factor induction in human breast carcinoma cell lines. Int J Cancer, 1998,61:706-712.
[5]Takahashi Y, Kiladai Y, Bucana CD, et al. Expression of vascular endothelial growth factor and its receptor, KDR, correlates vascularity, metastasis, and proliferation. Cancer Res, 1995，55:3964-3968.
, 百拇医药
[6]Yang SP, Morita I, Murota SI. Eicosapentaenoie acid attenuates vaseular endothelial growth factor-induced proliferotios via inhibiting Flk-1 recepor expression in bovine caroted artery endothelial cells. J Cell Physiol, 1998，176:342-349.
[7]Cullinan-Bove K, Koos RD. Vascular endothelial growth factor expression in rat uterus: rapid stimulation by estrogen correlates with estrogen-induced increases in uterine capillary permeability and growth. Endocrinology, 1993，133:229-837.
[8]Heiss JD, Papavassilion E, Merrill MJ, et al. Mechanism of dexamethasone suppression of brain tumour-associated vascular permeability in rats. J Clin Invest, 1996，98:1400-1408., 百拇医药
张志强 赵洪洋 朱贤立
摘 要 目的：了解血管内皮细胞生长因子(VEGF)在脑膜瘤中的表达，探讨VEGF与瘤周脑水肿和微血管形成的关系。 方法：应用免疫组化和免疫印迹技术，检测33例脑膜瘤组织中VEGF蛋白表达与瘤周脑水肿和微血管形成的关系。 结果：脑膜瘤VEGF表达率75%(25/33)，4例可疑表达。VEGF蛋白表达与PVBE(r=0.7352,P<0.01)和微血管形成(r=0.6611,P<0.01)存在肯定的相关关系。 结论：VEGF存在于脑膜瘤组织中，在瘤周脑水肿和微血管形成方面发挥重要作用。
关键词：脑膜瘤 内皮生长因子 脑水肿
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脑膜瘤周围脑水肿由许多因素引起，脑膜瘤细胞诱导分泌的化学介质作用引起微血管通透性增加和病理性微血管生长是重要因素之一。在这些化学介质中，血管内皮生长因子(VEGF)被认为是作用最强、特异性最高的调控因子。脑膜瘤引起的脑和脑膜血供增加，必须有大量微血管生成，可能引起VEGF上调，增加微血管通透性，引起血浆渗漏加重瘤周脑水肿。我们检测脑膜瘤组织中VEGF免疫活性与瘤周脑水肿及微血管形成的关系。
材料和方法
1.病例和组织标本：随机选取1997年6月～1998年8月同济医科大学附属协和医院脑外科33例手术切除的脑膜瘤标本，男12例；年龄34～68岁，平均49.8岁。女21例；年龄14～67岁，平均45.9岁。脑膜瘤病理类型：合体细胞型8例，过渡细胞型7例，纤维母细胞型9例，血管母细胞型4例，乳头状2例，恶性3例。所有标本都具有最终的病理学诊断和可利用的颅脑MRI或CT。
2.水肿的估计：根据患者的头颅MRI或CT估计水肿程度，参考Goldman等[1]测量脑水肿方法。认真测量包括脑水肿在内的肿瘤大小及肿瘤本身大小，并比较二者之比，比值为1者无脑水肿；再结合有无脑室受压和中线移位确定水肿系数。分5级：0级为无水肿，1级为可疑水肿，2级为轻度水肿，3级为中度水肿，4级为高度水肿。
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3.免疫组化染色及结果判断：常规LSAB技术，设置阳性和阴性对照。鼠抗VEGF单克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品，鼠抗VⅢ因子抗体为武汉博士德公司生产。结果判断：光镜下观察VEGF染色阳性细胞数，表达强弱用系数0～4表示，0为阳性，1为可疑阳性，2为弱阳性，3为中度阳性，4为强阳性。VⅢ因子染色，内皮细胞被染成棕色或棕褐色，成纤维细胞偶有着色，其它细胞不着色，先在低倍镜下全面观察切片确定血管最高密度区域，连续观察5个200倍视野微血管数(一个内皮细胞或一组内皮细胞即为一个微血管)，求其平均数。
4.免疫印迹染色：肿瘤细胞提取液制备参考Jackson等[2]所用方法。缓冲液10 mM Tris,1.5 mM EDTA,1mM MDTT,10%甘油，pH7.4，匀浆后分别
4 ℃ 2000 rPm离心15 min,4 ℃ 18000 rPm离心30 min。将定量的细胞提取液在5%浓缩胶和12%分离胶行SDS-PAGE电泳，中分子量标准蛋白作标准对照，考马斯亮蓝染色，其余部分将蛋白转印至硝酸纤维素滤膜行免疫染色，对VEGF蛋白带观察比较。
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结 果
1.VEGF蛋白表达：33例脑膜瘤标本进行VEGF免疫组化检测，25例明显着色,2例无染色,4例可疑染色,x±s为2.03±0.96。肿瘤细胞间均一染色，细胞巢内强染色，但细胞巢之间有轻微着色或无着色。一部分肿瘤细胞染色较浅，类似于对应标本的瘤周脑组织。一部分内皮细胞轻微着色。3例恶性脑膜瘤(P<0.05)及肿瘤浸润边缘强染色，乳头状脑膜瘤、血管母细胞型及部分合体细胞型脑膜瘤染色较强(P>0.05)。
2.微血管计数：脑膜瘤组织中小动脉、小静脉、毛细血管及内皮细胞均为VⅢ因子染色。不同类型肿瘤，同一肿瘤不同部位微血管密度不均。x±s为60.0±39.7,其中血管母细胞型(x±s为77.6±13.4，P<0.05)和恶性脑膜瘤(P<0.05)微血管计数稍高。
3.PVBE：33例脑膜瘤中29例有不同程度的脑水肿,17例患者有脑室受压和/或中线移位,水肿系数x±s为2.4±1.3。
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4.免疫印迹染色：鼠抗VEGF单克隆抗体染色9例脑膜瘤标本7例表现分子量相当于23 KD VEGF特异蛋白带，余2例23 KD蛋白带较弱，23 KD蛋白带粗大染色较强的2例中1例表现着色较深的46 KD VEGF特异蛋白带，另有4例标本(例3、6、7、8)表现较弱的46KD蛋白带。兔抗VEGF多克隆抗体染色2例标本皆出现14 KD、23 KD、27 KD、46 KD VEGF蛋白带，以23 KD VEGF蛋白带着色较深。
5.VEGF表达与脑水肿及临床指标的关系：VEGF蛋白表达系数与脑水肿系数有显著的相关关系(r=0.7352，P<0.01，图1上)。血管母细胞型有较强的VEGF免疫活性(P<0.05)，恶性脑膜瘤VEGF免疫活性最强(P<0.01)。男女患者有同样程度PVBE，其免疫活性无统计学意义(P>0.05)。
6.VEGF蛋白表达和微血管计数的关系：VEGF蛋白系数与微血管计数进行相关性分析，r=0.6611，P<0.01，存在肯定的相关关系(图1下)。
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图1 VEGF免疫组化染色与脑水肿及微血管计数的关系
讨 论
VEGF是一种高度特异性结合血管内皮细胞的糖蛋白，有4种分子异构体，分别含有121、165、189和206个氨基酸。在胶质瘤组织和细胞中VEGF结构形式为165>121>189>206[3]，在乳腺癌细胞株中121>165>189[4]。作为血管通透因子和增殖因子在肿瘤血管和水肿中提供分子连接物，导致血管通透性增高，血浆蛋白外渗，促进脑水肿并为微血管形成提供前提。VEGF通过其特异性受体flt和flk/KDR直接作用于血管内皮细胞刺激其增殖[5，6]，还通过增强血浆酶原活化因子的特性，提高血浆酶原活化因子mRNA水平和血浆酶原活化因子-1的mRNA水平参与血管形成。
脑膜瘤血供丰富，较易发生脑水肿。在脑膜瘤细胞株中VEGF蛋白存在已被证明，其水平与血管分布有关。我们这组资料经免疫组化染色证明了VEGF在脑膜瘤组织中的存在，其免疫活性和瘤周脑水肿直接相关，支持脑膜瘤是PVBE病理生理的直接作用者，并通过VⅢ因子染色，发现VEGF蛋白免疫活性与微血管生成存在相关关系，肯定VEGF是微血管形成的主要原因之一，这与Goldman等[1]研究结果相似。
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在Western blotting染色中，脑膜瘤细胞提取液中VEGF蛋白异构体形式被观察分析，分子量相当于23 KD及部分标本46 KD免疫反应蛋白带可能为VEGF 165形成，23 KD蛋白带是VEGF 165转化而成的单体。VEGF 121可能转化为分子量为14KD、18KD的单体，VEGF 189转化为27KD的单体[2]。经单克隆抗体和多克隆抗体染色发现在脑膜瘤组织中VEGF 121、189、206存在较少，以VEGF 165为主要形式发挥作用。7例标本中分子量相当于58 KD模糊蛋白带可能来源于鼠单克隆抗体的非特异性反应。例2、8蛋白带较粗大，着色深提示在恶性脑膜瘤和血管母细胞型脑膜瘤中VEGF蛋白表达较高。肿瘤侵袭性高，大量生成的功能和结构异常血管通透性增加，导致渗出增高，进一步加剧微血管生成和PVBE。恶性脑膜瘤临床上有严重的PVBE，而无PVBE的脑膜瘤则表现为一个良性过程，且与脑膜瘤有关的PVBE越严重，较早出现临床症状早期发现的可能性越大。早期手术切除PVBE较严重的侵袭性脑膜瘤，可能进一步加重脑水肿，与手术创伤造成VEGF过高表达有关。
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PVBE还受到其它机制的影响，例如静脉窦的栓塞和内分泌作用。从细胞水平看，VEGF蛋白与黄体酮受体，前列腺素水平存在有意义的关系[7]，溃疡的子宫内膜治疗过程中、妊娠期和月经期脑膜瘤症状的变化皆跟雌激素分泌有关，支持雌激素的刺激作用增强VEGF表达。糖皮质激素能够减轻PVBE[8]，氟美松在活体中能够抑制内皮细胞钙通道开放，通过内皮细胞抑制VEGF产生的信号，降低肿瘤细胞VEGF的表达，从而抑制血管通透性。遗憾的是本研究未能对氟美松治疗过程中脑水肿的变化进行详细的观察。
VEGF在脑膜瘤组织中表达并与瘤周脑水肿存在肯定的相关关系，在PVBE和微血管生成方面发挥重要作用。VEGF 165是VEGF蛋白在脑膜瘤组织中的主要存在形式。
作者单位：张志强 430022 武汉，同济医科大学附属协和医院神经外科
张志强 现在山东省济宁市第一人民医院神经外科，272111
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赵洪洋 430022 武汉，同济医科大学附属协和医院神经外科
朱贤立 430022 武汉，同济医科大学附属协和医院神经外科
参考文献
[1]Goldman K, Suman B, Palmer A, et al.Brain edema in meningomas is associated with increased vascular endothelial growth factor expression. Neurosurgery, 1997，40:1269-1277.
[2]Jackson W, Bentel M, Tilley D. Vascular endothelial growth factor expression in prostate cancer and benign prostatic hyperplasia. J Urol, 1997,157:2323-2328.
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[3]BeFrkmen RA, Merrill MJ, Reinhold C, et al. Expression of the vascular permeability factor /VEGF gene in the central nervous system neoplasms, J Clin Invest，1993,91:153-159.
[4]Scott AE, Gleadle M, Bicknell R, et al. Role of the hypoxia sensing system, acidity and reproductive hormones in the varibility of vascular endothelial growth factor induction in human breast carcinoma cell lines. Int J Cancer, 1998,61:706-712.
[5]Takahashi Y, Kiladai Y, Bucana CD, et al. Expression of vascular endothelial growth factor and its receptor, KDR, correlates vascularity, metastasis, and proliferation. Cancer Res, 1995，55:3964-3968.
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[6]Yang SP, Morita I, Murota SI. Eicosapentaenoie acid attenuates vaseular endothelial growth factor-induced proliferotios via inhibiting Flk-1 recepor expression in bovine caroted artery endothelial cells. J Cell Physiol, 1998，176:342-349.
[7]Cullinan-Bove K, Koos RD. Vascular endothelial growth factor expression in rat uterus: rapid stimulation by estrogen correlates with estrogen-induced increases in uterine capillary permeability and growth. Endocrinology, 1993，133:229-837.
[8]Heiss JD, Papavassilion E, Merrill MJ, et al. Mechanism of dexamethasone suppression of brain tumour-associated vascular permeability in rats. J Clin Invest, 1996，98:1400-1408., 百拇医药