成人成骨细胞体外培养
成人成骨细胞体外培养
张兴凯 杨庆铭 邓廉夫 朱雅萍
摘 要：目的：改良成人成骨细胞消化培养方法，以满足在细胞学水平进行骨代谢性疾病研究的需要。方法：取无菌骨碎片，先用胰蛋白酶消化多次，以去除血细胞和成纤维细胞；骨片经短期培养后，再次使用胰蛋白酶消化，得到大量纯净成骨细胞。细胞长至汇合后生成黑色结节。分别采用NPP底物法、125I标记放射免疫(RIA)法和Ⅰ、Ⅲ型胶原顺序沉淀抽提、SDS-PAGE还原电泳法测定细胞上清中成骨细胞主要特征性分泌物：大量碱性磷酸酶(AKP)、骨钙素(OCN)和Ⅰ型胶原。 结果：黑色结节经四环素染色，荧光显微镜下观察为骨结节特征性的金黄色。成骨细胞上清中AKP分泌量为(2.76±0.56) IU/ml、OCN分泌量为(1.875±0.549) ng/ml，明显高于成纤维细胞(P<0.01)。可检测到Ⅰ型胶原而无Ⅲ型胶原。结论：此改良方法可以在短期内得到大量性状稳定成骨细胞，同时避免成纤维细胞混入。
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关键词：成骨细胞 碱性磷酸酶 骨钙素 胶原
成骨细胞特征性表型为分泌骨钙素(OCN)、大量碱性磷酸酶(AKP)和Ⅰ型胶原,而无Ⅲ型胶原分泌[1]。我们采用改良骨组织消化培养方法，将骨片经短期培养后,再用胰蛋白酶消化,加快骨细胞的释放。经形态学观察及特征性分泌物检测证实,获得成骨细胞数量多，并与纤维细胞有明显区别。
材料与方法
一、液体的配制
0.25%胰蛋白酶用trypsin(1:250 DIFCO,Detroit,Michigan)溶解于d-Hank's液，抽滤灭菌。培养液使用DMEM+HAM F12 1∶1混合液(GibcoBRL,Grand Island,NY),加20%灭活新生牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml。低血清培养液为5%灭活新生牛血清，其余同培养液。使用25 cm2培养瓶(NUNCLON,Denmark)。
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二、骨组织片消化
取骨科手术中获得的无菌骨碎片,彻底去除骨膜及软组织；用无菌Hank′s液冲洗3次,剪碎至体积小于1mm3；Hank′s液多次冲洗至骨片发白,放入锥形瓶内,加入0.25%胰蛋白酶(骨碎片10倍体积),37℃水浴中消化(30 min×5),去掉上清。剩余骨片浸泡于培养液中,置37℃ CO2培养箱内2～3 d后,吸出培液,加入0.25%胰蛋白酶,37℃水浴中消化30 min,上清液经尼龙网过滤后,离心10 min(1000 r/min),去掉上清液,沉淀物用培养液打匀,接种于25 cm2培养瓶内,重复3次,直至离心后无沉淀物为止。
将消化后的骨片浸泡于培养液中,2～3 d后,重复上述胰蛋白酶消化步骤,仍有细胞释放,根据所需细胞量,可重复数次。接种后培养瓶内培养液较浑浊,10 h后即有贴壁细胞,72 h后,细胞完全贴壁,可冲洗、换液。此后隔日换液。取第二、三代细胞，消化后，以1×105/ml浓度接种于培养瓶中，每瓶4 ml,5 d后换低血清培养液6 ml，24 h后收集上清液，分装于5个离心管内，-18℃保存,用于检测。
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三、成骨细胞特征性鉴定
以皮肤成纤维细胞作为对照，鉴定实验所得成骨细胞。
1.形态学观察:除常规形态学观察外，采用趋骨性荧光素标记细胞培养生成结节。细胞培养瓶内加入四环素,使终浓度为50 μg/ml,培养箱内培养1 h,换新鲜培养液培养1 h，经Hank′s液冲洗3次,乙醇梯度脱水,固定,Olympus-Vanox-T显微镜落射荧光观察。
2.成骨细胞上清液AKP检测:采用磷酸对硝基苯酯二钠盐(p-Nitrophenyl phosphate disodium salt,NPP,上海丽珠东风公司)比色法[2],无色p-NPP与AKP在37℃水浴中反应生成黄色对硝基苯p-Nitrophenol,经405 nm波长比色,测得OD值,换算成国际单位。
3.成骨细胞上清液中骨钙素检测:采用BGP放免试剂盒(北京东亚免疫技术研究所)检测[3]。根据放射免疫竞争结合原理，125I标记OCN和样品所含OCN与OCN抗体竞争结合，使用分离剂使结合抗体沉淀，4℃离心后，γ计数器测定沉淀物cpm数，根据标准品曲线得到样品OCN含量。
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4.成骨细胞上清液中胶原抽提及检测:采用中性、酸性Nacl溶液顺序沉淀抽提[4]，SDS-PAGE垂直板还原电泳法[2]。配制7.5%-0.2%bis聚丙烯酰胺凝胶板固定于垂直板电泳槽[5]。电泳液为0.05M Tris、0.38M甘氨酸、0.01%SDS(pH=8.8)；样品液为0.125 M Tris、15%甘油、2 M尿素、2%SDS、0.001%溴酚兰；染色液为0.25%考马斯亮蓝R250、25%异丙醇和10% HAC；脱色液为5%异丙醇和8%HAC。样品解冻后,放55℃水浴中变性1 h,加入样品缓冲液50 μl,每个样品点2孔,每孔加样20 μl,另加Ⅰ、Ⅲ型胶原标准品,50 mA恒定电流电泳1 h后,每个样品第1孔内加入100 μl 20%β巯基乙醇(β-mercaptoethanol，Sigma)样品缓冲液,静置1 h后,13 mA恒定电流电泳12 h,染色液染色1 h,脱色液脱色24 h,拍照片。
四、统计方法
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使用Statpal软件包,对所得数据进行t检验。
结 果
1.形态学观察：骨组织消化后所得细胞接种于培养瓶，10 h后,开始有梭形贴壁细胞；72 h后,细胞全部贴壁,并伸出生长突，可见细胞呈梭形或鳞片状生长,细胞表面分泌物较多(图1)；1周后,细胞开始呈现成骨细胞形态,多数呈鳞片形,体积较大,多伪足,胞浆丰富,胞核较大,偏于一侧,有2～3个核仁[6，7],一般2～4周至汇合(图2)；继续培养,可见局部多层生长,并有黑色结节生成(图3)。经四环素标记,荧光显微镜观察,为金黄色亮区,证实为骨结节(图4)。透射电镜下观察,培养细胞体积较大,长方形或方形，约40 μm,胞浆丰富,内含大量粗面内质网，呈旺盛分泌相。
图1 胰蛋白酶消化后72h贴壁成骨细胞 相差显微镜×100
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图2 培养3周后长至汇合成骨细胞 相差显微镜×100
图3 成骨细胞多层生长后形成黑色结节 相差显微镜×100
图4 结节经四环素染色后，荧光显微镜下呈现金黄色×100
2.成骨细胞上清中AKP检测：24 h成骨细胞上清中，AKP分泌量为(2.76±0.56) U/ml，高于成纤维细胞分泌量(1.96±0.23) U/ml。两者相比，差异有显著性意义(P<0.01)。
3.成骨细胞上清中骨钙素检测：24 h成骨细胞上清中，OCN分泌量为(1.875±0.549)ng/ml，亦高于成纤维细胞分泌量(1.190±0.591)ng/ml，差异有显著性意义(P<0.01)。
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4.胶原检测：成骨细胞有大量Ⅰ型胶原分泌,无Ⅲ型胶原分泌；成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原均有分泌。
讨 论
一、成骨细胞体外培养方法的建立
早在20世纪60年代,Peck和Birge[8]开始用胶原酶消化骨片,体外培养成骨细胞获得成功；1975年,Wong等[9]采用多次胶原酶消化,使培养的成骨细胞得到纯化。1985年,Robey和Termin等[10]采用低Ca2+培养液培养骨片获得成骨细胞,经过鉴定,比酶消化法得到的细胞更加纯化。本实验改良上述方法,先使用比胶原酶更便宜的胰蛋白酶进行多次消化,胰蛋白酶仅能消化骨小梁表面细胞周围的基质，而对于埋藏于骨基质中的大量静止骨细胞无作用。前5次胰蛋白酶消化液中含有骨组织中残留的血细胞、成纤维细胞、骨髓细胞及部分成骨细胞和骨细胞，因此弃之不用。剩余的骨片再用胰蛋白酶消化，无细胞释放，证实骨片中仅含有埋藏于基质中的骨细胞，而无其它细胞。骨片在培养液中浸泡后，静止骨细胞通过骨小管内细胞缝隙连接[11],感知外界溶液浓度变化,特别是钙离子浓度变化[10],开始活跃起来,通过骨细胞性溶骨作用[12]释放出来,在骨片周围形成贴壁细胞,但一般要经过2周以上时间,且贴壁细胞仅出现于骨片周围[10],数量有限。在骨细胞释放出来以前,再次使用胰蛋白酶可大大加速其释放速度和数量,既代替了胶原酶的作用,又可避免成纤维细胞的混入。消化细胞接种后，经2～3周培养可达汇合,取第2、3代细胞检测，可避免长期培养，反复传代后引起细胞分化和表型的改变。本实验结果显示，此方法简单、实用，并可获得足够数量的成骨细胞。
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二、成骨细胞与成纤维细胞的鉴别
骨组织消化后的上清液中，除成骨细胞外，不可避免的混有骨髓中的血细胞及成纤维细胞。血细胞为悬浮细胞，换液后即可去除。成纤维细胞与成骨细胞来源相同，同为贴壁细胞，且生长极迅速，很快取代成骨细胞。Wong和Cohn[9]的研究证实，用胶原酶消化6次后，可基本消除成纤维细胞；Robey和Termine[10]的研究表明，胶原酶消化所得细胞均含有成纤维细胞，骨片培养所得成骨细胞可消除成纤维细胞。因此，消化后的成骨细胞主要与成纤维细胞鉴别。
成骨细胞为间质来源细胞，具有强大分泌功能,骨基质成分几乎都由成骨细胞分泌。因此，在生长旺盛期，骨细胞在相差显微镜下表现为细胞体积较大，呈鳞片状，胞浆丰富，多伪足[7]。透射电镜下，其胞核较幼稚，胞浆内几乎都被粗面内质网占据，表现出旺盛分泌功能，这是电镜下区别于其它细胞的形态特征[13]。成纤维细胞分泌能力较差，细胞一般呈梭形，两端具有细长突起，胞体无伪足。四环素与沉积的钙盐有特殊的亲合力，常用来标记体内形成的新骨，在荧光显微镜下，成骨细胞形成的新骨经标记后呈现特征性的金黄色。
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除以上形态学观察外，还可通过检测骨细胞特征性分泌物鉴别成骨细胞和成纤维细胞。OCN为成骨细胞特征性分泌物，除牙本质外，至今未在其它组织中发现该物质。OCN是一类维生素K依赖性、含有羧基谷氨酸的非胶原蛋白，如同在凝血酶结构中的作用一样，羧基谷氨酸与钙离子有较强结合力,因此被认为与钙盐沉积和羟基磷灰石形成有关。成骨细胞分泌Ⅰ型胶原,而无Ⅲ型胶原分泌，成纤维细胞同时分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原。大量AKP的分泌是成骨细胞另一特征，AKP有不同组织分泌的多种同工酶，检测其骨特异性同工酶，并结合上述两项特征性指标，可作为鉴定成骨细胞的标准；而成纤维细胞仅有少量AKP分泌。
三、Ⅰ、Ⅲ型胶原的鉴别
Ⅰ、Ⅲ型胶原均属于纤维状胶原。胶原分子由3股多肽链组成，多肽链之间由共价键相连，Ⅰ型胶原由两条α1链和一条α2链组成，用[α1(Ⅰ)]2α2(Ⅰ)表示；Ⅲ型胶原由三条α1链组成，用[α1(Ⅲ)]3表示。Webster和Harvey[4]根据胶原在不同浓度Nacl溶液中溶解度不同的性质，建立了细胞培养液中抽提胶原的方法；Laemmli[14]建立了胶原SDS-PAGE还原电泳方法。胶原经55℃水浴变性后，胶原纤维分解为分子，再经β巯基乙醇还原，多肽链之间共价键被打开，样品缓冲液中的SDS是强阴离子集团，与胶原分子单链形成带负电荷的复合物，这种复合物使蛋白质丧失了原有电荷状态和构象差异，各链在电场中移动速率仅与分子量有关，在(15～200)×103道尔顿之间，迁移率与分子量的对数呈线性关系，电泳胶经染色后，各链表现不同的条带。采用3H标记羟脯氨酸掺入，放射自显影显示电泳条带，可清晰地看到Ⅰ型胶原的α1和α2链相邻，α1浓度应为α2的2倍，α1(Ⅲ)更靠近点样孔。本实验中Ⅰ型胶原处仅有1条较粗条带，并与Ⅰ型胶原标准品条带相符，可能与染色方法分辨率不高有关。未加还原剂的样品中,Ⅰ、Ⅲ型胶原泳动速率相差不大,无法区分。
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本实验方法所得成骨细胞经形态学观察和特征性表型的检测证实与成纤维细胞有明显区别，可做为细胞学水平研究骨科疾病的可靠方法。
基金项目：上海市科委科技攻关项目(964119024)
作者单位：张兴凯 上海瑞金医院骨科、上海市伤骨科研究所 200025
杨庆铭 上海瑞金医院骨科、上海市伤骨科研究所 200025
邓廉夫 上海瑞金医院骨科、上海市伤骨科研究所 200025
朱雅萍 上海瑞金医院骨科、上海市伤骨科研究所 200025
参考文献
[1]Rodan GA. Introduction to bone biology. Bone, 1992,13 Suppl:3-6.
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[2]Beresford JN, Gallagher JA, Russell RG. 1,25-Dihydroxyvitamine D3 and human bone derived cells in vitro: effects on alkaline phosphatase, type Ⅰ collagen and proliferation. Endocrinology, 1986,119:1776-1785.
[3]杨梅芳, 李振甲, 朱守荣. 骨钙素RIA试剂盒研制及其临床应用. 中华核医学杂志,1994, 14: 109.
[4]Webster DF, Harvey W. A quantitative assay for collagen synthesis in microwell fibroblast cultures. Anal Biochem, 1979, 96: 220.
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[5]永井裕,编著.刘平,译.胶原蛋白实验方法.第1版.上海:上海中医学院出版社,1989.62-76.
[6]Wlodarski KH. Properties and origin of osteoblasts. Clin Orthop,1990,(252):276-293.
[7]Elisabeth MA, Elisabeth HB, Peter JN. Function of osteocytes in bone. J Cell Biochem, 1994,55:287-299.
[8]Peck WA, Birge ST. Bone cells: biochemical and biological studies after enzymatic isolation. Science，1964, 146:1476.
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[9]Wong GL, Cohn DV. Target cells in bone for parathormone and calcitonin are different: enrichment for each cell type by sequential digestion of mouse calvaria and selective adhesion to polymeric surfaces. Proc Natl Acad Sci USA, 1975,72: 3167-3171.
[10]Robey PG, Termine JD. Human bone cells in vitro. Calcif Tissue Int, 1985,37:453-460.
[11]Palumbo C,Palazzini S,Marotti G.Morphological study of intercellular junctions during osteocyte differentiation. Bone, 1990,11:401-406.
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[12]Boivin G,Mesguich P.Ultrastructural immunocyto-chemical localization of endogenous 1,25-dihydroxy-vitamin D3 and its receptors in osteoblasts and osteocytes from neonatal mouse and rat calvaria. Bone Miner,1987,3:125-136.
[13]Rodan GA, Rodan SB. The cell of bone. In: Riggs BL, Melton LJ, eds.Osteoporosis: etiology, diagnosis, and management. 2nd ed. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1995.205.
[14]Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature, 1970, 277:680-685., http://www.100md.com
张兴凯 杨庆铭 邓廉夫 朱雅萍
摘 要：目的：改良成人成骨细胞消化培养方法，以满足在细胞学水平进行骨代谢性疾病研究的需要。方法：取无菌骨碎片，先用胰蛋白酶消化多次，以去除血细胞和成纤维细胞；骨片经短期培养后，再次使用胰蛋白酶消化，得到大量纯净成骨细胞。细胞长至汇合后生成黑色结节。分别采用NPP底物法、125I标记放射免疫(RIA)法和Ⅰ、Ⅲ型胶原顺序沉淀抽提、SDS-PAGE还原电泳法测定细胞上清中成骨细胞主要特征性分泌物：大量碱性磷酸酶(AKP)、骨钙素(OCN)和Ⅰ型胶原。 结果：黑色结节经四环素染色，荧光显微镜下观察为骨结节特征性的金黄色。成骨细胞上清中AKP分泌量为(2.76±0.56) IU/ml、OCN分泌量为(1.875±0.549) ng/ml，明显高于成纤维细胞(P<0.01)。可检测到Ⅰ型胶原而无Ⅲ型胶原。结论：此改良方法可以在短期内得到大量性状稳定成骨细胞，同时避免成纤维细胞混入。
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关键词：成骨细胞 碱性磷酸酶 骨钙素 胶原
成骨细胞特征性表型为分泌骨钙素(OCN)、大量碱性磷酸酶(AKP)和Ⅰ型胶原,而无Ⅲ型胶原分泌[1]。我们采用改良骨组织消化培养方法，将骨片经短期培养后,再用胰蛋白酶消化,加快骨细胞的释放。经形态学观察及特征性分泌物检测证实,获得成骨细胞数量多，并与纤维细胞有明显区别。
材料与方法
一、液体的配制
0.25%胰蛋白酶用trypsin(1:250 DIFCO,Detroit,Michigan)溶解于d-Hank's液，抽滤灭菌。培养液使用DMEM+HAM F12 1∶1混合液(GibcoBRL,Grand Island,NY),加20%灭活新生牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml。低血清培养液为5%灭活新生牛血清，其余同培养液。使用25 cm2培养瓶(NUNCLON,Denmark)。
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二、骨组织片消化
取骨科手术中获得的无菌骨碎片,彻底去除骨膜及软组织；用无菌Hank′s液冲洗3次,剪碎至体积小于1mm3；Hank′s液多次冲洗至骨片发白,放入锥形瓶内,加入0.25%胰蛋白酶(骨碎片10倍体积),37℃水浴中消化(30 min×5),去掉上清。剩余骨片浸泡于培养液中,置37℃ CO2培养箱内2～3 d后,吸出培液,加入0.25%胰蛋白酶,37℃水浴中消化30 min,上清液经尼龙网过滤后,离心10 min(1000 r/min),去掉上清液,沉淀物用培养液打匀,接种于25 cm2培养瓶内,重复3次,直至离心后无沉淀物为止。
将消化后的骨片浸泡于培养液中,2～3 d后,重复上述胰蛋白酶消化步骤,仍有细胞释放,根据所需细胞量,可重复数次。接种后培养瓶内培养液较浑浊,10 h后即有贴壁细胞,72 h后,细胞完全贴壁,可冲洗、换液。此后隔日换液。取第二、三代细胞，消化后，以1×105/ml浓度接种于培养瓶中，每瓶4 ml,5 d后换低血清培养液6 ml，24 h后收集上清液，分装于5个离心管内，-18℃保存,用于检测。
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三、成骨细胞特征性鉴定
以皮肤成纤维细胞作为对照，鉴定实验所得成骨细胞。
1.形态学观察:除常规形态学观察外，采用趋骨性荧光素标记细胞培养生成结节。细胞培养瓶内加入四环素,使终浓度为50 μg/ml,培养箱内培养1 h,换新鲜培养液培养1 h，经Hank′s液冲洗3次,乙醇梯度脱水,固定,Olympus-Vanox-T显微镜落射荧光观察。
2.成骨细胞上清液AKP检测:采用磷酸对硝基苯酯二钠盐(p-Nitrophenyl phosphate disodium salt,NPP,上海丽珠东风公司)比色法[2],无色p-NPP与AKP在37℃水浴中反应生成黄色对硝基苯p-Nitrophenol,经405 nm波长比色,测得OD值,换算成国际单位。
3.成骨细胞上清液中骨钙素检测:采用BGP放免试剂盒(北京东亚免疫技术研究所)检测[3]。根据放射免疫竞争结合原理，125I标记OCN和样品所含OCN与OCN抗体竞争结合，使用分离剂使结合抗体沉淀，4℃离心后，γ计数器测定沉淀物cpm数，根据标准品曲线得到样品OCN含量。
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4.成骨细胞上清液中胶原抽提及检测:采用中性、酸性Nacl溶液顺序沉淀抽提[4]，SDS-PAGE垂直板还原电泳法[2]。配制7.5%-0.2%bis聚丙烯酰胺凝胶板固定于垂直板电泳槽[5]。电泳液为0.05M Tris、0.38M甘氨酸、0.01%SDS(pH=8.8)；样品液为0.125 M Tris、15%甘油、2 M尿素、2%SDS、0.001%溴酚兰；染色液为0.25%考马斯亮蓝R250、25%异丙醇和10% HAC；脱色液为5%异丙醇和8%HAC。样品解冻后,放55℃水浴中变性1 h,加入样品缓冲液50 μl,每个样品点2孔,每孔加样20 μl,另加Ⅰ、Ⅲ型胶原标准品,50 mA恒定电流电泳1 h后,每个样品第1孔内加入100 μl 20%β巯基乙醇(β-mercaptoethanol，Sigma)样品缓冲液,静置1 h后,13 mA恒定电流电泳12 h,染色液染色1 h,脱色液脱色24 h,拍照片。
四、统计方法
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使用Statpal软件包,对所得数据进行t检验。
结 果
1.形态学观察：骨组织消化后所得细胞接种于培养瓶，10 h后,开始有梭形贴壁细胞；72 h后,细胞全部贴壁,并伸出生长突，可见细胞呈梭形或鳞片状生长,细胞表面分泌物较多(图1)；1周后,细胞开始呈现成骨细胞形态,多数呈鳞片形,体积较大,多伪足,胞浆丰富,胞核较大,偏于一侧,有2～3个核仁[6，7],一般2～4周至汇合(图2)；继续培养,可见局部多层生长,并有黑色结节生成(图3)。经四环素标记,荧光显微镜观察,为金黄色亮区,证实为骨结节(图4)。透射电镜下观察,培养细胞体积较大,长方形或方形，约40 μm,胞浆丰富,内含大量粗面内质网，呈旺盛分泌相。
图1 胰蛋白酶消化后72h贴壁成骨细胞 相差显微镜×100
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图2 培养3周后长至汇合成骨细胞 相差显微镜×100
图3 成骨细胞多层生长后形成黑色结节 相差显微镜×100
图4 结节经四环素染色后，荧光显微镜下呈现金黄色×100
2.成骨细胞上清中AKP检测：24 h成骨细胞上清中，AKP分泌量为(2.76±0.56) U/ml，高于成纤维细胞分泌量(1.96±0.23) U/ml。两者相比，差异有显著性意义(P<0.01)。
3.成骨细胞上清中骨钙素检测：24 h成骨细胞上清中，OCN分泌量为(1.875±0.549)ng/ml，亦高于成纤维细胞分泌量(1.190±0.591)ng/ml，差异有显著性意义(P<0.01)。
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4.胶原检测：成骨细胞有大量Ⅰ型胶原分泌,无Ⅲ型胶原分泌；成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原均有分泌。
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一、成骨细胞体外培养方法的建立
早在20世纪60年代,Peck和Birge[8]开始用胶原酶消化骨片,体外培养成骨细胞获得成功；1975年,Wong等[9]采用多次胶原酶消化,使培养的成骨细胞得到纯化。1985年,Robey和Termin等[10]采用低Ca2+培养液培养骨片获得成骨细胞,经过鉴定,比酶消化法得到的细胞更加纯化。本实验改良上述方法,先使用比胶原酶更便宜的胰蛋白酶进行多次消化,胰蛋白酶仅能消化骨小梁表面细胞周围的基质，而对于埋藏于骨基质中的大量静止骨细胞无作用。前5次胰蛋白酶消化液中含有骨组织中残留的血细胞、成纤维细胞、骨髓细胞及部分成骨细胞和骨细胞，因此弃之不用。剩余的骨片再用胰蛋白酶消化，无细胞释放，证实骨片中仅含有埋藏于基质中的骨细胞，而无其它细胞。骨片在培养液中浸泡后，静止骨细胞通过骨小管内细胞缝隙连接[11],感知外界溶液浓度变化,特别是钙离子浓度变化[10],开始活跃起来,通过骨细胞性溶骨作用[12]释放出来,在骨片周围形成贴壁细胞,但一般要经过2周以上时间,且贴壁细胞仅出现于骨片周围[10],数量有限。在骨细胞释放出来以前,再次使用胰蛋白酶可大大加速其释放速度和数量,既代替了胶原酶的作用,又可避免成纤维细胞的混入。消化细胞接种后，经2～3周培养可达汇合,取第2、3代细胞检测，可避免长期培养，反复传代后引起细胞分化和表型的改变。本实验结果显示，此方法简单、实用，并可获得足够数量的成骨细胞。
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二、成骨细胞与成纤维细胞的鉴别
骨组织消化后的上清液中，除成骨细胞外，不可避免的混有骨髓中的血细胞及成纤维细胞。血细胞为悬浮细胞，换液后即可去除。成纤维细胞与成骨细胞来源相同，同为贴壁细胞，且生长极迅速，很快取代成骨细胞。Wong和Cohn[9]的研究证实，用胶原酶消化6次后，可基本消除成纤维细胞；Robey和Termine[10]的研究表明，胶原酶消化所得细胞均含有成纤维细胞，骨片培养所得成骨细胞可消除成纤维细胞。因此，消化后的成骨细胞主要与成纤维细胞鉴别。
成骨细胞为间质来源细胞，具有强大分泌功能,骨基质成分几乎都由成骨细胞分泌。因此，在生长旺盛期，骨细胞在相差显微镜下表现为细胞体积较大，呈鳞片状，胞浆丰富，多伪足[7]。透射电镜下，其胞核较幼稚，胞浆内几乎都被粗面内质网占据，表现出旺盛分泌功能，这是电镜下区别于其它细胞的形态特征[13]。成纤维细胞分泌能力较差，细胞一般呈梭形，两端具有细长突起，胞体无伪足。四环素与沉积的钙盐有特殊的亲合力，常用来标记体内形成的新骨，在荧光显微镜下，成骨细胞形成的新骨经标记后呈现特征性的金黄色。
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除以上形态学观察外，还可通过检测骨细胞特征性分泌物鉴别成骨细胞和成纤维细胞。OCN为成骨细胞特征性分泌物，除牙本质外，至今未在其它组织中发现该物质。OCN是一类维生素K依赖性、含有羧基谷氨酸的非胶原蛋白，如同在凝血酶结构中的作用一样，羧基谷氨酸与钙离子有较强结合力,因此被认为与钙盐沉积和羟基磷灰石形成有关。成骨细胞分泌Ⅰ型胶原,而无Ⅲ型胶原分泌，成纤维细胞同时分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原。大量AKP的分泌是成骨细胞另一特征，AKP有不同组织分泌的多种同工酶，检测其骨特异性同工酶，并结合上述两项特征性指标，可作为鉴定成骨细胞的标准；而成纤维细胞仅有少量AKP分泌。
三、Ⅰ、Ⅲ型胶原的鉴别
Ⅰ、Ⅲ型胶原均属于纤维状胶原。胶原分子由3股多肽链组成，多肽链之间由共价键相连，Ⅰ型胶原由两条α1链和一条α2链组成，用[α1(Ⅰ)]2α2(Ⅰ)表示；Ⅲ型胶原由三条α1链组成，用[α1(Ⅲ)]3表示。Webster和Harvey[4]根据胶原在不同浓度Nacl溶液中溶解度不同的性质，建立了细胞培养液中抽提胶原的方法；Laemmli[14]建立了胶原SDS-PAGE还原电泳方法。胶原经55℃水浴变性后，胶原纤维分解为分子，再经β巯基乙醇还原，多肽链之间共价键被打开，样品缓冲液中的SDS是强阴离子集团，与胶原分子单链形成带负电荷的复合物，这种复合物使蛋白质丧失了原有电荷状态和构象差异，各链在电场中移动速率仅与分子量有关，在(15～200)×103道尔顿之间，迁移率与分子量的对数呈线性关系，电泳胶经染色后，各链表现不同的条带。采用3H标记羟脯氨酸掺入，放射自显影显示电泳条带，可清晰地看到Ⅰ型胶原的α1和α2链相邻，α1浓度应为α2的2倍，α1(Ⅲ)更靠近点样孔。本实验中Ⅰ型胶原处仅有1条较粗条带，并与Ⅰ型胶原标准品条带相符，可能与染色方法分辨率不高有关。未加还原剂的样品中,Ⅰ、Ⅲ型胶原泳动速率相差不大,无法区分。
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本实验方法所得成骨细胞经形态学观察和特征性表型的检测证实与成纤维细胞有明显区别，可做为细胞学水平研究骨科疾病的可靠方法。
基金项目：上海市科委科技攻关项目(964119024)
作者单位：张兴凯 上海瑞金医院骨科、上海市伤骨科研究所 200025
杨庆铭 上海瑞金医院骨科、上海市伤骨科研究所 200025
邓廉夫 上海瑞金医院骨科、上海市伤骨科研究所 200025
朱雅萍 上海瑞金医院骨科、上海市伤骨科研究所 200025
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