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编号:10205913
肝硬变门静脉高压症动物模型的制作
http://www.100md.com 《中国普通外科杂志》 2000年第1期
     吕振祺 杨慧武 金洪泳 刘建华

    摘 要:目的 介绍几种常用的肝硬变门静脉高压症动物模型的制作方法。方法 复习相关文献,进行综述性报告。结果 常用方法有:①四氯化碳制作模型法;②硫代乙酰胺制作模型法;③缩窄门静脉主干制作模型法;④门腔静脉吻合制作模型法;⑤缩窄胆总管制作模型法;⑥门静脉内注射血管阻塞物制作模型法;⑦门静脉内注射大肠杆菌制作模型法。结论 理想的门静脉高压症动物模型应与人类常见门静脉高压症病理生理改变相似,且具有简单、易复制,动物存活率和成模率高,适用于基础及临床研究的特点。

    关键词:高血压,门脉 疾病模型,动物 肝硬变 综述文献

    为更好地研究肝硬变,门静脉高压症的发病机制、病理生理变化 以及评价各种治疗方法的效果,60多 年来,国内外学者探讨了多种制备肝硬化动物模型的方法。总体来说,每种方法都有其特点和局限性,现综述如下。
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    1 四氯化碳制作模型

    1936年,Cameron和Karunaratn-e[1]首次报道应用四氯化碳(CCl4)制作肝硬变动物模型。CCl4具有较强选择性肝细胞毒性,可使肝细胞生物膜脆性增加,造成脂质氧化和溶酶体损伤,导致肝细胞脂变、坏死及纤维细胞增生。增生的纤维组织破坏了肝小叶正常结构,并将其分割成大小不一、圆形或类圆形的肝细胞团,形成假小叶和小结节性肝硬变,但肝细胞再生不明显。

    CCl4可经消化道、皮下注射或腹腔内注射等途径给药。为加快成模速度,可配合应用酶诱导剂,如乙醇、苯巴比妥等。乙醇能增强CCl4毒性作用,且能直接损伤肝细胞线粒体。苯巴比妥可使细胞色素P-450活性增强,滑面内质网增生。细胞色素P-450是肝微粒体最重要的药物代谢酶,故合用苯巴比妥可增加肝细胞对CCl4的敏感性。
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    由于大白鼠肝脏对CCl4的反应存在着明显个体差异,同等剂量的CCl4对1只大白鼠可能致死,而对另1只却不足以引起肝脏损伤。对此,刘建华[2]通过参照鼠体重改变来调整给药剂量,使成模率有所改善。其方法主要是将再次给药时鼠体重控制在对照组平均体重的60%~70%,尤应注意首次用药后鼠体重变化。其结果是生存率达58%,存活鼠的成模率达94.9%。具体方法是将鼠分成实验与对照两组,对照组鼠始终予以常规饲养。在实验组中,当鼠体重达150g时,以35mg%苯巴比妥溶液为其唯一可获的饮用水;当鼠体重达230g左右时,开始在清醒状态下用CCl4 灌胃。CCl4每周给药1次,共8~9次, 首剂为0.04ml(简为x), 其余各次参考剂量为第2次1.5x,第3剂2x, 第4剂3x,第5剂4x……,极量为0.3ml。用药后,每日定时称量各鼠体重,与对照组当时平均体重变化相比较。根据每只鼠对CCl4的反应,即体重变化来调节再次用药剂量。如果用药后第7d,鼠体重明显低于对照组,表明该鼠对CCl4耐受力较小,再次用药剂量要相应减少;若体重接近于对照组,则增加CCl4的用量。在最后1次用药后15~20d即可成模。
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    2 硫代乙酰胺制作模型

    硫代乙酰胺(thioacetamide, TAA)是一种肝细胞毒性物质。1948年Fitzhugh与Nilsson[3]首先确立TAA是产生肝硬变的有效物质,TAA能减少肝细胞核P-450的含量,在肝细胞核内抑制呼吸代谢和酶活动,增加肝细胞DNA合成与有丝分裂,而形成肝硬变。

    TAA给药途径与CCl4给药途径基本相同。给药2周后可见中央静脉周围之肝细胞伊红染色加深,肝细胞核增大,核内有一大核仁,同时枯否氏细胞增加;4周后小叶中央可见一些肝细胞坏死,其周围可见淋巴细胞、嗜中性白细胞集聚,整个小叶肝细胞及核仁增大,随后于中央静脉周围可见由吞嗜坏死肝细胞形成的有黄褐素沉着的巨嗜细胞;8周后可见纤维条索,有时与中央静脉或门静脉相通,此时不正常圆型结节形成;10周末出现典型肝硬变,并可见不同程度肝细胞异型增生。经消化道给药,TAA制作动物肝硬变模型可无死亡;经腹腔内注射死亡率较高,约5%~28%,成模率为75%~100%。
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    以上2种方法制作的肝硬变模型,组织学改变与人类肝硬变相似,门静脉压力显著增高并产生一定程度的门体交通支分流。采用TAA制作大鼠肝硬变模型较CCl4为优。

    3 缩窄门静脉主干制作模型

    1980年Van Thiel[4]首次报道此种方法。剖腹后将门静脉游离,把1个20号钝头直针纵向置于门静脉主干旁,用0-3号丝线把门静脉与直针一并结扎2道,第1道位于门静脉主干近左、右分支处,第2道位于与脾静脉交接处下方,结扎后抽出直针,关腹。术后10~15d可全部成模,且无死亡。门静脉、脾静脉压力明显增加,91%~99%实验鼠可见门体侧支分流,胃血流量增加87%,肠血流量及脾血流量均增加56%,门静脉血流量可增加50%。但门静脉主干缩窄,向肝血流阻力增大,向肝门静脉血流量减少,继发引起肝动脉血流量代偿性增加。总体上,全肝血流量明显减少,门体交通支开放,心脏指数及心输出量明显增加。本模型的肝组织学几乎正常,主要适于门静脉系统高动力循环状态的研究,适于门静脉高压症前向性学说的探讨。
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    4 门-腔静脉吻合制作模型

    1976年Saku等[5]提出用血流量较大的腔静脉与门静脉吻合制作狗门静脉高压症模型,但效果不理想。Dennis[6]在此基础上又同时缩窄门静脉主干,使模型制作效果有很大提高。其方法是,开腹行下腔静脉和门静脉主干的侧侧吻合,吻合口长度约2.5~3.0cm,于吻合口上方的门静脉内置入1个内含琼脂环的钢圈起固定作用。琼脂吸水后不断膨胀,而逐渐阻塞门静脉;在吻合口上方双重结扎腔静脉,使其下方的血液完全注入门静脉系统。此法3~6周后全部成模,无死亡。门静脉压力明显增高,食管胃底静脉丛呈不同程度曲张,肝脏组织学改变不明显。本模型为食管胃底静脉曲张及内窥镜注射硬化剂治疗出血的研究提供了便利条件。

    5 缩窄胆总管制作模型

    通过结扎缩窄胆总管,使胆汁排出受阻,肝内胆汁淤集,从而形成胆汁性肝硬变。 Kountouras等[7]以大鼠为实验对象,剖腹后,把1根内径为0.28mm, 外径为0.61mm的聚乙烯插管,向肝端插入胆总管,并用丝线结扎固定。观察10s胆汁流动情况,确保插管通畅后,结扎插管远端,由切口引出,并固定于皮下。也可不插管,双重结扎胆总管,于二者之间离断胆总管。此种方法除手术所致外,动物一般无死亡。胆总管结扎后,血清胆红素明显增高。5d后肝内出现水肿,炎症及纤维组织轻度增生;10d后,肝内胆管明显扩张,增生的纤维组织形成网状结构,并可见呈同心圆样的纤维组织、马洛里小体及胆汁性梗死灶;15d后,增生的纤维组织形成中隔,并在汇管区形成桥状联系,甚至扩展到小叶中央,小叶结构紊乱,但假小叶并不多见;28d后,可见典型肝硬变。这种模型适于胆汁性肝硬化的研究,大多数动物在数周内存活良好。插管法还有在动物肝硬变形成过程中可随时研究胆汁状况的优点。
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    6 门静脉内注射血管阻塞物制作模型

    大白鼠门静脉内注射直径15±3μm 的聚合树酯微粒,98%以上阻塞于肝窦;而门静脉内注射胰腺匀浆时,则其压力显著增高。1994年Jaffe等[8]在前人的基础上制作出一种新的门静脉高压症动物模型。方法是在门静脉内插入套管,注入10等份(每份0.15~0.2ml)直径分别为15,25,50或90μm的微粒。总注入时间要超过20min,但每次注射要在10~15s内完成。注射2~5次后,门静脉压达到一个峰值,但在30~60s内又逐渐降到一个稳定状态,经6~8次注射,门静脉压力达到最大峰值,此后即使再注入更多的微粒体,门静脉压力也不能进一步增高。每种直径的微粒所致的门静脉压增高值无统计学差别;病理检查示肝内大量微粒体,以直径为15μm的居多,而直径为90μm的微粒体则堵塞在较大的门静脉分支;脾内无微粒;肺内有各种微粒。用此方法制备模型,门静脉压增高迅速,而肝脏结构保持完好,适于肝内门体分流的研究。

, 百拇医药     1982年Buergener[9]用聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol, PVA)以狗为象制作门静脉高压症模型。PVA是一种永久性血管阻塞因子,与血吸虫卵相似,阻塞于门静脉分支末梢,引起汇管区炎症,逐渐产生肝硬化。其方法是经皮肤穿刺,将套管置入门静脉主干,注入PVA,每次0.1~0.9g,每隔1~2周1次,每次由0.1g开始,逐渐加量至门静脉压达到或超过20cmH2O,并稳定于此。3个月后成模,随着肝内门静脉较大分支被阻塞,狗存活率下降。成模后门静脉压力显著增高;3~4周后,出现门体侧支循环;8个月后,肝脏呈不同程度增生。该模型适于窦前型肝硬变与肝硬变血流动力学改变及门体分流的研究。

    7 门静脉内注射大肠杆菌制作模型

    1985年大西久仁彦等[10]用大肠杆菌成功地制作出狗门静脉高压症模型。其方法是以1%福尔马林杀死非致病性大肠杆菌,再将其煮 沸2.5h,使其只具有0抗原;将2mg 此种蛋白与1ml Freund佐剂行肌肉注射,2周后制得效价为1∶512~1∶1024的0抗体血清,将该血清和被杀死的大肠杆菌1.5mg/ml以2∶3的比例混后置于50℃培养箱内孵育2h, 再把此种混合液由肠系膜上静脉插管注入到门静脉,剂量为4ml/kg, 2周内注入7~10次,1个月后再注入1次,2.5个月后即可成模。成模后门静脉压力显著增高,血流量增大,阻力增高;脾脏重量增加,血流量增大,阻力下降;空、回肠、结肠及网膜血流量增大,同时阻力下降。病理检查示门静脉末梢纤维化,萎缩及狭窄;门静脉区血管紊乱。该模型适用于特发性门静脉高压症的研究。■
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    作者简介:吕振祺(1960-),男,吉林长春人,解放军第二O

    八医院主治医师,硕士,从事门脉高压症方面研究。

    作者单位:吕振祺(解放军第二O八医院外一科, 吉林长春130062)

    杨慧武(解放军第二O八医院外一科, 吉林长春130062)

    金洪泳(解放军第二O八医院外一科, 吉林长春130062)

    刘建华(解放军第二O八医院外一科, 吉林长春130062)

    参考文献:

    [1]Cameron CR, Karunaratne WAE. Carbon tetrachloride cirrhosis in relation to liver regeneration[J]. J Path Bact, 1936,42(1):1~21
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    [2]刘建华,张德恒,孟宪民.应用四氯化碳复制大白鼠肝硬化动物模型[J].白求恩医科大学学报,1991,(增刊):3~4

    [3]Fitzhugh OG, Nilsson A. Liver tumours in rats fed thiourea or thioacetamide[J]. Science, 1948,108(5):626~628

    [4]Van Thiel DH, Gavaler JS, Slone FL, et al. Is feminization in alcoholic men due in part to portal hypertension: a rat model[J]. Gastroenterology, 1980,78(1):81~91

    [5]Saku M, Borgesson B, Olin T, et al. An attempt to induce portal hypertension and esophageal varices in the rat[J]. Eur Surg Res, 1976,8(2):166~171
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    [6]Dennis ML, Gustavo AM, Jorge IT, et al. A reproducible canine model of esophageal varices[J]. Gastroenterology, 1983,894(2):573~579

    [7]Kountouras J, Billing BH, Scheur PJ. Prolonged bile duct obstruction: A new experimental model for cirrhosis in the rat[J]. Br J Exp Pathol, 1984,65(3):305~311

    [8]Jaffe V, Alexander B, Mathie RT. Intrahepatic portal occlusion by microspheres: a new model of portal hypertension in the rat[J]. Gut, 1994,35(6):815~818
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    [9]Buergener FA, Gutierrez OH, Logsdon GA. Angiographic, hemodynamic and hitologic evaluation of portal hypertension and periportal fibrosis induced in the dog by intraportal polyvinyl alcohol injections[J]. Radiology, 1982,143(3):379~385

    [10]Sugita S, Ohnishi K, Saito M, et al. Experimental portal fibrosis induced by intraportal injection of bacteria[J]. Acta Hepatol Jpn, 1985,26(6):1372~1379, 百拇医药