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编号:10206025
细菌对抗生素耐药的分子生物学基础
http://www.100md.com 国外医学内科学分册 2000年2月第27卷第2期
     李以琳1(综述) 蔡映云2(审校)

    (1.上海市第八人民医院,上海200233;

    2.上海医科大学中山医院,上海200032)

     摘 要 随着细菌对抗生素耐药的日趋严重,细菌的耐药机制已成为目前研究的重要课题。本文总结近年的有关文献,从分子生物学角度探讨了细菌的耐药机制以及相应的对策。

     关键词:抗生素 耐药 分子生物学

    随着抗生素在临床上的广泛应用,细菌耐药性的问题也日益突出。对细菌耐药的研究一般从药物作用靶位、酶学、抗生素的渗透障碍、泵出机制等方面展开,并由此提出了相应的措施来减少甚至防止耐药的产生。细菌的耐药是一个复杂的过程,人们越来越着眼于分子水平上的研究。
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    1 细菌的耐药机制

    1.1 药物作用靶位的改变

    作用靶位是抗菌药物与细菌结合并发挥抗菌效果的作用点。主要分二类:一类为核糖体,如氨基糖苷类抗生素通过与细菌的30s核糖体亚单位结合而抑制细菌蛋白质合成。另一类称为靶位酶,如β-内酰胺类抗生素的作用靶位青霉素结合蛋白(PBP)是与细菌膜结合的转肽酶、羧肽酶和内肽酶等,抗生素通过与这些酶的共价结合使之失去活性,从而阻断了细菌细胞壁的合成。靶位结构的改变,使抗菌药物失效或活性减弱是引致细菌耐药的一个重要因素。

    在80年代,人们就注意到一些耐青霉素的细菌可产生新的靶位。如在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中,细菌在细胞壁产生了一种新的低亲和力的PBP即PBP2a,它和β-内酰胺类抗生素亲和力低,从面减弱该抗生素的作用,使细菌对抗生素产生耐药。Jacoby等[1]在1991年证明上述改变由基因mecA所编码,携带着编码PDP2a基因的葡萄球菌的扩散或基因自身的转化导致了MRSA的广泛传播。
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    1994年~1996年,对那些不产生β-内酰胺类抗生素耐药的葡萄球菌进行了一系列的基因检测,Hiramatsu[2]和Archer[3]进一步证实这些细菌耐药的主要原因是细菌染色体上获得了外来的mec片段,mec是大约30~50kb(千碱基对)的外来染色体DNA,mec片段中包含PBP2a的结构基因mecA、控制mecA基因转录的调节基因mecI和mecR 1以及20~45kb的mec相关DNA。

    另一方面,核糖体的研究也取得了进展。人们认识到编码核糖体的基因突变导致了核糖体的结构改变,从而无法与抗生素结合。1990年Fisher等[4]报道耐药性金黄色葡萄球菌gyrA基因(编码核糖体蛋白)出现84位点突变(丝氨酸→亮氨酸),改变了核糖体结构,结果使细菌DNA解旋酶上的亚基发生改变,造成喹诺酮类抗生素的作用靶位变化,从而引起细菌对喹诺酮类抗生素的耐药。

    Yu[5]发现耐克拉霉素的幽门螺杆菌其23sr RNA上的腺嘌呤被rRNA甲基转移酶甲基化。Ossenkopp等[6]对耐药菌随机进行了DNA扩增和限制性片段分析,显示在抗生素使用中,突变耐药菌比外源性耐药菌有更大的生长优势。核苷酸序列分析发现这些耐药菌在23sr RNA上均有单个碱基突变。Hsieh等[7]证明这类耐药菌在23sr RNA的2515点上发生腺嘌呤被鸟嘌呤替代。但引起突变的原因尚不清楚。
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    1.2 细菌产生破坏抗菌药物结构的酶

    抗生素的抗菌作用与其结构密切相关,发β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺环决定了药物稳定性和抗菌活性。细菌通过产生破坏抗生素结构的酶(如β-内酰胺酶、氨基糖苷类钝化酶等),使抗菌药物失去活性或减低活性。

    80年代末发现N-乙酰转移酶和O-核苷转移酶能将氨基糖苷类抗生素的游离氨基乙酰化,将游离羧基磷酸化或核苷化,使之失去抑制蛋白质合成的作用。这些酶是由质粒或染色体编码的。已证实耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)对氨基糖苷类抗生素耐药的主要原因是细菌产生AAC(6′)APH(2′)钝化酶,编码此酶的耐药基因由Tn4001转座子转入并整合到染色体中。Shanahan等[8]发现了对甲氧苄啶和阿莫西林耐药的沙门氏菌能产生二氢叶酸合成酶和TEM-1β-内酰胺酶等。对酶基因组限制性片段凝胶对流分析显示均有一个相同的18 DNA片段,控制相应酶的产生,造成细菌对抗生素的耐药。关于18DNA片段的产生以及影响和调控因素,还需要进一步的深入研究。
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    1.3 影响抗生素渗入细菌

    细菌细胞壁障碍或细胞膜通透性改变可影响抗生素进入细胞而导致细菌耐药。Yoneyama等[9]指出绿脓杆菌的外膜由微孔蛋白孔道组成,仅允许分子量小于350~400U的糖类扩散,所以外膜通透性较低。主要微孔蛋白有OprC,OprD2和OprE等。其中OprD2蛋白具有调控通道功能。将含编码OprD2基因的质粒转入对亚胺培南耐药的细菌中,细菌对亚胺培南的敏感性就恢复了。编码OprD2的基因的缺失造成了细菌外膜对药物的低通透性,因而引起细菌对抗生素的耐药。虽然编码OprD2的基因已被克隆,但此基因表达的调控因子及造成此基因丢失或缺少的原因尚不清楚。

    1.4 细菌主动泵出抗生素

    某些革兰阳性菌还可依靠主动泵出机制来减少细菌内药物浓度。Hooper等已[10]证实某些金黄色葡萄球菌有norA基因,可编码含388个氨基酸的蛋白质分子。这种蛋白质分子具有依赖能量逆浓度梯度主动泵出喹诺酮类药物的功能。其耐药的机制是norA基因启动子区域发生单个核苷酸改变,在转录水平提高了norA mRNA的量,导致norA的过度表达所致。
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    Bums[11]测定了一种假单胞菌外膜脂蛋白的一段编码基因的核苷酸顺序,发现有二个或三个控制抗生素泵出的操纵子(mexA、mexB\oprM)。

    1.5 细菌对抗生素杀菌效应的耐受性

    已经发现金黄色葡萄球菌对抗生素的耐药性可通过过度分泌自溶素抑制因子,降低细菌的自溶活性引起。这类细菌能与抗生素正常结合,亦不破坏抗生素的结构,但不能被杀灭。McGowan[12]研究发现细菌是否过量分泌自溶素抑制因子与car基因有关。

    耐药菌的广泛传播给治疗带来了很大的困难。耐药性可通过质粒介导,在不同细菌间传播。Hall[13]发现耐药基因的水平转移是在一个或多个基因整合过程中混入各种宿主质粒,从而引起不同细菌对某种药物的耐药。

    2 针对细菌耐药的措施
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    针对细菌的耐药已经采取了不少措施。如遵循用药原则、重新评估老药和未开发利用的化合物,寻找不同作用靶位的新药等。随着耐药机制中分子生物学的研究,基因治疗亦成为研究的课题。

    2.1 酶抑制剂

    Hackbarth[14]和Niemeyer[15]分析了MRSA中编码β-内酰胺酶的DNA片段和编码PBP2a的mecA的调控因子,认为调控mecA的mecI和mecR1是不同的转入调节基因。而位于mecA启动子上游的mec调节基因有抑制产生PBP2a的功能。blaI和blaR1是葡萄球菌的β-内酰胺酶调节因子,对引起细菌耐药的编码基因和调节基因的进一步研究有望造出更高效的酶抑制剂。

    2.2 基因重组

    在实验室中,已经能利用DNA重组技术将外源正常基因导入靶细胞,使外源基因编码的产物纠正或补偿基因缺陷所引起的异常。Maneewannakul[16]发现对喹诺酮耐药的大肠杆菌存在对多种抗生素耐药的基因marRAB操纵子的突变。在试验中,通过灭活已知的三种marR突变链的mar基因,并和卡那霉素耐药株进行重组,能够使这些细菌对喹诺酮和其他抗生素的耐药性减低。
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    2.3 其它

    Werckenthin等[17]认为细菌转移耐药基因的质粒时,质粒整合到新宿主的能力主要取决于种类屏障,如限制和修改系统。同时质粒的不相容性可限制耐药基因的转移。Huang等[18]发现一种M182T替代物,可作为TEM-1β-内酰胺酶的抑制基因,如能将其与药物有机地结合,便可提高药物的稳定性,减少细菌耐药。

    对细菌耐药的基因治疗尚在实验研究中,离临床应用尚有很大距离,但分子生物学研究毕竟为人们认识和防止细菌耐药带来了新的希望。

    作者简介:李以琳(1970-),女,上海人,内科主治医师

    蔡映云(1946-),男,淅江慈谿人,教授,博士导师,上海医科大学呼吸病研究所副所长,上海肺科学会副主任委员
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    参考文献

    [1] Jacoby GA,Archer GL.[J].N Engl J Med,1991,324(9):601-612.

    [2] Hiramatsu K,Aria KK,Kondo N,et al.[J].Antimicrob Agents Chemother,1996,40(12):2680-2685.

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    [4] Fisher LM.Screedharan S,Oram M,et al.[J].J Bacteriol,1990,172:7260.

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    [7] Hsieh PF,Yang JC,Lin JT,et al.[J].J Formos Med Assoc,1998,97(7):445-452.

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