关节内注射透明质酸钠对兔膝关节退变软骨的影响
作者：吴海山 李晓华
单位：吴海山(第二军医大学长征医院骨科，上海200003)；李晓华(第二军医大学长征医院骨科，上海200003)
关键词：透明质酸；关节软骨；骨关节炎
第二军医大学学报000725 [摘要] 目的：观察关节内注射透明质酸钠对兔膝关节炎模型中退变软骨的影响。方法： 以24只成年新西兰兔为实验对象，建立 Hulth膝关节骨关节炎模型。实验组(12只)于术后第8周开始，每周关节内注射1%透明质酸钠1 ml，连续注射5次。对照组(12只)不作任何治疗。注射后6周处死动物，在手术显微镜下观察膝关节表面；取股骨内髁软骨标本进行透射电镜观察；取内侧胫骨髁软骨作氨基己糖测定。结果：实验组动物软骨细胞退变程度均较对照组明显减轻；实验组软骨内氨基己糖测定值亦较对照组显著增高(P<0.05)。结论：关节内注射外源性透明质酸能减轻兔膝关节骨关节炎模型的关节软骨退变程度，促进软骨的代谢及自身修复。
, 百拇医药
[中图分类号] R 684 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)07-0680-03
Effect of intra-articular sodium hyaluronate injection for degenerative cartilage of the rabbit′s knee
WU Hai-Shan LI Xiao-Hua
(Department of Orthopaedics, Changzheng Hospital, Second Military Medical University，Shanghai 200003， China)
[ABSTRACT] Objective: To evaluate the effect of intra-articular hyaluronate injection for the degenerative cartilage of osteoarthritis models in rabbit. Methods: Twenty-four adult New Zealand rabbits were used as osteoarthritis models, which were established by Hulth technique. In experimental group (12 rabbits), the model knee joint was injected with 1 ml 1% sodium hyaluronate 8 weeks after the operation, 5 times every week. The control group (12 rabbits) was not treated by any injection. The animals were sacrificed during the sixth week after the first injection. The surface of knee joint was examined by surgical microscope and the articular cartilage of the medial femoral condylar was excised and prepared for transmission electron microscopic study. The articular cartilage of medial tibial condylar was excised for determination of hexosamine. Results: The degenerative changes of articular cartilage in experimental group was significantly lighter than in the control group under surgical microscope and in ultrastructural study. There was a significant increase (P<0.05) of hexosamine in the experimental group compared with control group. Conclusion: Intra-articular injection of exogenous can alleviate degeneration, promote metabolism and self-reparation of articular cartilage.
, 百拇医药
[KEY WORDS] hyaluronate； articular cartilage； osteoarthritis
膝关节骨关节炎(osteoarthritis, OA)是临床最常见的关节病，其病理基础是关节软骨的退变[1]。而OA的治疗目前尚无有效方法。传统的药物治疗仅是以控制症状或减轻疼痛为目的，且常需依赖非固醇类消炎镇痛药物。近年来，以透明质酸(hyaluronate acid, HA)制剂为代表的氨基糖类粘弹性物质补充疗法，用以预防和治疗骨关节炎的研究，为骨关节炎治疗寻找到了新的途径[2,3]。本研究在建立兔膝关节Hulth骨关节炎模型[4]的基础上，用医用级高分子透明质酸钠作关节内注射以观察其对兔OA的退变软骨的影响。
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组 新西兰兔24只，性别不拘，10～12月龄，体质量2.3～2.8 kg。随机分为实验组(HA组)与对照组(C组)，每组12只，均取右侧膝关节施术。
, 百拇医药
1.2 实验药品 1%医用级透明质酸钠凝胶。平均相对分子质量1.0×106， pH 7.0～7.2。
1.3 实验方法
1.3.1 制备Hulth模型 全部动物均在动物实验室无菌条件下按照Hulth法[4]施术。切断右膝关节前、后交叉韧带，切除内侧半月板并切断内侧副韧带。术后不固定伤肢，分笼饲养8周后获得膝关节骨关节炎模型[5]。
1.3.2 给药方法 实验组动物于术后第8周末开始膝关节内注射1%透明质酸钠1 ml, 其后每周重复注射1次，共5次。对照组膝关节不作任何治疗。
1.3.3 氨基己糖测定方法 绘制标准曲线：以氨基己糖盐酸盐配制0，20，40，60，80，100 μg/ml梯度浓度标准液，各取1 ml加3.5%乙酰丙酮1 ml，经94℃水浴45 min后，冷却，加Ehrlich液2 ml，30℃ 水浴45 min，冷却后以721分光光度计在530 nm处读取D值，制成标准曲线。样本测定： 取术侧胫骨内髁非半月板覆盖区软骨50 mg, 粉碎后制成匀浆2 ml,取0.2 ml，以蒸馏水加至1 ml，按标准曲线操作步骤测得D值，根据标准曲线计算样品的氨基己糖含量。
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1.3.4 解剖学观察 注射后6周动物用空气栓塞法处死后立即解剖膝关节。在10×手术显微镜下观察，参照关节镜下对软骨退变的分度方法[6，7]，将其软骨退变程度分为Ⅰ～Ⅳ度。
1.3.5 超微结构观察 以锐利刀片切取股骨内髁软骨使其呈2 mm×1 mm全软骨层标本，并以2.5%戊二醛预固定2 h后置于缓冲液中，再以锇酸后固定，脱水，环氧树脂包埋，纵向超薄切片，铀-铅双重染色后作透射电镜观察。
1.4 统计学处理 氨基己糖数据用
±s表示，统计结果采用两样本均数t检验。
2 结 果
2.1 解剖学观察 实验组关节软骨退变情况：Ⅱ度6膝、Ⅲ度4膝、Ⅳ度2膝；对照组关节软骨退变情况：Ⅲ度5膝、Ⅳ度7膝。结果表明实验组较对照组在膝关节退变程度分级上明显偏轻。
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2.2 透射电镜观察 在实验组中，除可见软骨退变的一般改变，如细胞核变形固缩，胞质内出现较多脂滴，基质内粗胶原纤丝增多及细胞坏死碎裂等现象以外，尚可见较多的非成熟软骨细胞，以及胞质内粗面内质网扩张成池，高尔基体扩张，可见到软骨细胞分泌胶原，而基质内仍以细胶原纤丝为主，且出现较多的蛋白多糖颗粒，胶原的退变程度较对照组减轻(图1A，B)。而对照组则出现大量坏死软骨细胞，基质内大量致密粗胶原及坏死细胞碎屑，尚可见成纤维样细胞出现(图1C，D)。
2.3 氨基己糖测定结果 参照标准曲线计算值分别测得实验组及对照组每份样品(5 mg)的氨基己糖含量，实验组氨基己糖含量为(56±10)μg,对照组为(48±8)μg，经t检验表明实验组软骨样本的氨基已糖含量显著地高于对照组(P<0.05)。
3 讨 论
3.1 关于Hulth模型 骨关节炎模型的建立有多种方法，其机制多为改变关节内环境引起关节软骨的退变。本实验采用Hulth法切断兔膝关节的前后交叉韧带、内侧附韧带，并切除内侧半月板的方法造成关节不稳定，即通过改变膝关节的生物力学状态，以诱导关节软骨退变而建立的骨关节炎模型，是目前获得公认的可靠模型。实验证实术后8周其软骨退变已非常明显。这一模型与临床骨关节炎的病理改变相似[3]。
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3.2 关于软骨退变的评价指标 对骨关节炎软骨退变的评价除了解剖学、组织学和超微结构的观察研究以外，对软骨细胞及基质的代谢研究也是评价软骨退变与修复状态的重要方法。氨基糖类物质的代谢作为软骨的糖胺蛋白代谢的代表可以体现软骨代谢的水平。成人或成年动物的软骨代谢并不活跃，在成年动物的骨关节炎模型中，氨基己糖水平较低。而软骨中氨基己糖含量的增加表明软骨代谢处于活跃状态[8]。
3.3 本研究的意义 透明质酸由滑膜的B细胞分泌，是维持关节滑液粘弹性的主要成分，也是软骨基质内形成糖蛋白的重要组成成分，对滑膜关节的润滑、软骨的保护以及对软骨粘弹特性的维持均起着重要作用。此外，覆盖于关节软骨表面的透明质酸还具有分子筛作用，将可溶性蛋白等作为营养源提供给软骨组织，同时又对蛋白多糖从软骨基质中析出具有抑制作用，避免抗原暴露及免疫复合物的形成。在动物的骨关节炎模型上，关节中透明质酸含量明显降低，而关节内注射外源性透明质酸除了可以直接提高透明质酸含量，还对于滑膜B细胞分泌透明质酸具有正反馈作用[2,8]。我们既往的实验研究已经证实，关节内注射透明质酸能有效地预防兔关节软骨的退变[5]。而本实验则是以相同的实验模型，通过形态学、超微结构观察，以及软骨生化代谢的研究评价其对已经退变的关节软骨的作用。实验结果表明，在兔膝关节骨关节炎模型上以1%透明质酸钠定期作关节内注射不仅能有效地抑制关节软骨的退变进程，而且通过氨基己糖测定及软骨超微结构的观察，证实在实验组退变软骨中氨基己糖含量增高，软骨细胞及基质代谢趋于活跃，并出现较明显的自身修复现象。虽然尚无足够的证据说明其修复结果的生理意义，但由于透明质酸作为粘弹性物质在维持关节内环境中所发挥的模拟滑液的物理作用和参与代谢的生化作用，我们有理由推论，适当地补充外源性透明质酸对骨关节炎具有积极的治疗作用。
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图 1 各组兔膝关节软骨透射电镜观察
Fig 1 TEM of cartilage of rabbit knee in 2 groups
A：Degeneration chondrocyte, normal matrix in experimental group (×8 000)； B：Active chondrocyte in experimental group (×6 000)；
C：Degeneration chondrocyte and matrix in control group (×6 000)； D：Chondrocytie nuclear pycnosis in control group (×5 000)
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770743)。
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作者简介：吴海山(1963-)，男(汉族)，副教授，硕士生导师。
[参 考 文 献]
[1] 柴本甫，汤雪明，腰野富久. 膝关节骨关节炎患者关节软骨的超微结构改变及其与关节镜分类的关系[J].中华外科杂志，1992,30(1):18-20.
[2] Huskisson EC, Donnelly S. Hyaluronic acid in the treatment of osteoarthritis of the knee[J]. Rheumatology,1999,38(7): 602-607.
[3] Altman RD, Moskowitz R. Intraarticular sodium hyaluronate in the treatment of patients with osteoarthritis of the knee: a randomized clinical trial[J]. J Rheumatol, 1998; 25(11): 2203-2212.
, 百拇医药
[4] 吴海山，钱齐荣，顾其胜. 关节内注射透明质酸钠预防兔骨关节炎的实验研究[J]. 中华骨科杂志,1996,16(1):37-39.
[5] 聂 林. 骨关节炎的动物模型[J]. 中华实验外科杂志,1990,7(2):96-97.
[6] 吴海山，周维江，张中南. 老年性退变膝：临床分级、关节镜评价及光电镜观察[J].中华老年医学杂志,1994,13(6):330-332.
[7] Burks RT. Arthroscopy and degenerative arthritis of the knee: a review of the literature[J]. Arthroscopy, 1990,6(1):43-48.
[8] Abtangelo G, Botti P, Del BM, et al. Intraarticular sodium hyaluronate injections in the Pond-Nuki experimental model of osteoarthritis in dogs-biochemical results[J]. Clin Orthop, 1989, 241(4):286-299.
[收稿日期] 2000-02-22
[修回日期] 2000-06-02, http://www.100md.com
单位：吴海山(第二军医大学长征医院骨科，上海200003)；李晓华(第二军医大学长征医院骨科，上海200003)
关键词：透明质酸；关节软骨；骨关节炎
第二军医大学学报000725 [摘要] 目的：观察关节内注射透明质酸钠对兔膝关节炎模型中退变软骨的影响。方法： 以24只成年新西兰兔为实验对象，建立 Hulth膝关节骨关节炎模型。实验组(12只)于术后第8周开始，每周关节内注射1%透明质酸钠1 ml，连续注射5次。对照组(12只)不作任何治疗。注射后6周处死动物，在手术显微镜下观察膝关节表面；取股骨内髁软骨标本进行透射电镜观察；取内侧胫骨髁软骨作氨基己糖测定。结果：实验组动物软骨细胞退变程度均较对照组明显减轻；实验组软骨内氨基己糖测定值亦较对照组显著增高(P<0.05)。结论：关节内注射外源性透明质酸能减轻兔膝关节骨关节炎模型的关节软骨退变程度，促进软骨的代谢及自身修复。
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[中图分类号] R 684 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)07-0680-03
Effect of intra-articular sodium hyaluronate injection for degenerative cartilage of the rabbit′s knee
WU Hai-Shan LI Xiao-Hua
(Department of Orthopaedics, Changzheng Hospital, Second Military Medical University，Shanghai 200003， China)
[ABSTRACT] Objective: To evaluate the effect of intra-articular hyaluronate injection for the degenerative cartilage of osteoarthritis models in rabbit. Methods: Twenty-four adult New Zealand rabbits were used as osteoarthritis models, which were established by Hulth technique. In experimental group (12 rabbits), the model knee joint was injected with 1 ml 1% sodium hyaluronate 8 weeks after the operation, 5 times every week. The control group (12 rabbits) was not treated by any injection. The animals were sacrificed during the sixth week after the first injection. The surface of knee joint was examined by surgical microscope and the articular cartilage of the medial femoral condylar was excised and prepared for transmission electron microscopic study. The articular cartilage of medial tibial condylar was excised for determination of hexosamine. Results: The degenerative changes of articular cartilage in experimental group was significantly lighter than in the control group under surgical microscope and in ultrastructural study. There was a significant increase (P<0.05) of hexosamine in the experimental group compared with control group. Conclusion: Intra-articular injection of exogenous can alleviate degeneration, promote metabolism and self-reparation of articular cartilage.
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[KEY WORDS] hyaluronate； articular cartilage； osteoarthritis
膝关节骨关节炎(osteoarthritis, OA)是临床最常见的关节病，其病理基础是关节软骨的退变[1]。而OA的治疗目前尚无有效方法。传统的药物治疗仅是以控制症状或减轻疼痛为目的，且常需依赖非固醇类消炎镇痛药物。近年来，以透明质酸(hyaluronate acid, HA)制剂为代表的氨基糖类粘弹性物质补充疗法，用以预防和治疗骨关节炎的研究，为骨关节炎治疗寻找到了新的途径[2,3]。本研究在建立兔膝关节Hulth骨关节炎模型[4]的基础上，用医用级高分子透明质酸钠作关节内注射以观察其对兔OA的退变软骨的影响。
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组 新西兰兔24只，性别不拘，10～12月龄，体质量2.3～2.8 kg。随机分为实验组(HA组)与对照组(C组)，每组12只，均取右侧膝关节施术。
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1.2 实验药品 1%医用级透明质酸钠凝胶。平均相对分子质量1.0×106， pH 7.0～7.2。
1.3 实验方法
1.3.1 制备Hulth模型 全部动物均在动物实验室无菌条件下按照Hulth法[4]施术。切断右膝关节前、后交叉韧带，切除内侧半月板并切断内侧副韧带。术后不固定伤肢，分笼饲养8周后获得膝关节骨关节炎模型[5]。
1.3.2 给药方法 实验组动物于术后第8周末开始膝关节内注射1%透明质酸钠1 ml, 其后每周重复注射1次，共5次。对照组膝关节不作任何治疗。
1.3.3 氨基己糖测定方法 绘制标准曲线：以氨基己糖盐酸盐配制0，20，40，60，80，100 μg/ml梯度浓度标准液，各取1 ml加3.5%乙酰丙酮1 ml，经94℃水浴45 min后，冷却，加Ehrlich液2 ml，30℃ 水浴45 min，冷却后以721分光光度计在530 nm处读取D值，制成标准曲线。样本测定： 取术侧胫骨内髁非半月板覆盖区软骨50 mg, 粉碎后制成匀浆2 ml,取0.2 ml，以蒸馏水加至1 ml，按标准曲线操作步骤测得D值，根据标准曲线计算样品的氨基己糖含量。
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1.3.4 解剖学观察 注射后6周动物用空气栓塞法处死后立即解剖膝关节。在10×手术显微镜下观察，参照关节镜下对软骨退变的分度方法[6，7]，将其软骨退变程度分为Ⅰ～Ⅳ度。
1.3.5 超微结构观察 以锐利刀片切取股骨内髁软骨使其呈2 mm×1 mm全软骨层标本，并以2.5%戊二醛预固定2 h后置于缓冲液中，再以锇酸后固定，脱水，环氧树脂包埋，纵向超薄切片，铀-铅双重染色后作透射电镜观察。
1.4 统计学处理 氨基己糖数据用
±s表示，统计结果采用两样本均数t检验。2 结 果
2.1 解剖学观察 实验组关节软骨退变情况：Ⅱ度6膝、Ⅲ度4膝、Ⅳ度2膝；对照组关节软骨退变情况：Ⅲ度5膝、Ⅳ度7膝。结果表明实验组较对照组在膝关节退变程度分级上明显偏轻。
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2.2 透射电镜观察 在实验组中，除可见软骨退变的一般改变，如细胞核变形固缩，胞质内出现较多脂滴，基质内粗胶原纤丝增多及细胞坏死碎裂等现象以外，尚可见较多的非成熟软骨细胞，以及胞质内粗面内质网扩张成池，高尔基体扩张，可见到软骨细胞分泌胶原，而基质内仍以细胶原纤丝为主，且出现较多的蛋白多糖颗粒，胶原的退变程度较对照组减轻(图1A，B)。而对照组则出现大量坏死软骨细胞，基质内大量致密粗胶原及坏死细胞碎屑，尚可见成纤维样细胞出现(图1C，D)。
2.3 氨基己糖测定结果 参照标准曲线计算值分别测得实验组及对照组每份样品(5 mg)的氨基己糖含量，实验组氨基己糖含量为(56±10)μg,对照组为(48±8)μg，经t检验表明实验组软骨样本的氨基已糖含量显著地高于对照组(P<0.05)。
3 讨 论
3.1 关于Hulth模型 骨关节炎模型的建立有多种方法，其机制多为改变关节内环境引起关节软骨的退变。本实验采用Hulth法切断兔膝关节的前后交叉韧带、内侧附韧带，并切除内侧半月板的方法造成关节不稳定，即通过改变膝关节的生物力学状态，以诱导关节软骨退变而建立的骨关节炎模型，是目前获得公认的可靠模型。实验证实术后8周其软骨退变已非常明显。这一模型与临床骨关节炎的病理改变相似[3]。
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3.2 关于软骨退变的评价指标 对骨关节炎软骨退变的评价除了解剖学、组织学和超微结构的观察研究以外，对软骨细胞及基质的代谢研究也是评价软骨退变与修复状态的重要方法。氨基糖类物质的代谢作为软骨的糖胺蛋白代谢的代表可以体现软骨代谢的水平。成人或成年动物的软骨代谢并不活跃，在成年动物的骨关节炎模型中，氨基己糖水平较低。而软骨中氨基己糖含量的增加表明软骨代谢处于活跃状态[8]。
3.3 本研究的意义 透明质酸由滑膜的B细胞分泌，是维持关节滑液粘弹性的主要成分，也是软骨基质内形成糖蛋白的重要组成成分，对滑膜关节的润滑、软骨的保护以及对软骨粘弹特性的维持均起着重要作用。此外，覆盖于关节软骨表面的透明质酸还具有分子筛作用，将可溶性蛋白等作为营养源提供给软骨组织，同时又对蛋白多糖从软骨基质中析出具有抑制作用，避免抗原暴露及免疫复合物的形成。在动物的骨关节炎模型上，关节中透明质酸含量明显降低，而关节内注射外源性透明质酸除了可以直接提高透明质酸含量，还对于滑膜B细胞分泌透明质酸具有正反馈作用[2,8]。我们既往的实验研究已经证实，关节内注射透明质酸能有效地预防兔关节软骨的退变[5]。而本实验则是以相同的实验模型，通过形态学、超微结构观察，以及软骨生化代谢的研究评价其对已经退变的关节软骨的作用。实验结果表明，在兔膝关节骨关节炎模型上以1%透明质酸钠定期作关节内注射不仅能有效地抑制关节软骨的退变进程，而且通过氨基己糖测定及软骨超微结构的观察，证实在实验组退变软骨中氨基己糖含量增高，软骨细胞及基质代谢趋于活跃，并出现较明显的自身修复现象。虽然尚无足够的证据说明其修复结果的生理意义，但由于透明质酸作为粘弹性物质在维持关节内环境中所发挥的模拟滑液的物理作用和参与代谢的生化作用，我们有理由推论，适当地补充外源性透明质酸对骨关节炎具有积极的治疗作用。
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图 1 各组兔膝关节软骨透射电镜观察
Fig 1 TEM of cartilage of rabbit knee in 2 groups
A：Degeneration chondrocyte, normal matrix in experimental group (×8 000)； B：Active chondrocyte in experimental group (×6 000)；
C：Degeneration chondrocyte and matrix in control group (×6 000)； D：Chondrocytie nuclear pycnosis in control group (×5 000)
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770743)。
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作者简介：吴海山(1963-)，男(汉族)，副教授，硕士生导师。
[参 考 文 献]
[1] 柴本甫，汤雪明，腰野富久. 膝关节骨关节炎患者关节软骨的超微结构改变及其与关节镜分类的关系[J].中华外科杂志，1992,30(1):18-20.
[2] Huskisson EC, Donnelly S. Hyaluronic acid in the treatment of osteoarthritis of the knee[J]. Rheumatology,1999,38(7): 602-607.
[3] Altman RD, Moskowitz R. Intraarticular sodium hyaluronate in the treatment of patients with osteoarthritis of the knee: a randomized clinical trial[J]. J Rheumatol, 1998; 25(11): 2203-2212.
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[4] 吴海山，钱齐荣，顾其胜. 关节内注射透明质酸钠预防兔骨关节炎的实验研究[J]. 中华骨科杂志,1996,16(1):37-39.
[5] 聂 林. 骨关节炎的动物模型[J]. 中华实验外科杂志,1990,7(2):96-97.
[6] 吴海山，周维江，张中南. 老年性退变膝：临床分级、关节镜评价及光电镜观察[J].中华老年医学杂志,1994,13(6):330-332.
[7] Burks RT. Arthroscopy and degenerative arthritis of the knee: a review of the literature[J]. Arthroscopy, 1990,6(1):43-48.
[8] Abtangelo G, Botti P, Del BM, et al. Intraarticular sodium hyaluronate injections in the Pond-Nuki experimental model of osteoarthritis in dogs-biochemical results[J]. Clin Orthop, 1989, 241(4):286-299.
[收稿日期] 2000-02-22
[修回日期] 2000-06-02, http://www.100md.com