噬菌体抗体库的构建及抗AFP人单抗的筛选
作者：肖天利 刘为纹 房殿春
单位：肖天利(第三军医大学附属西南医院消化内科，重庆 400038)；刘为纹(第三军医大学附属西南医院消化内科，重庆 400038)；房殿春(第三军医大学附属西南医院消化内科，重庆 400038)
关键词：噬菌体抗体库；人单克隆抗体；AFP
第三军医大学学报000721
提 要： 目的 运用噬菌体抗体库技术，制备人源性抗AFP Fab段，为进一步的研究和临床运用打下基础。方法 用RT-PCR方法扩增人免疫球蛋白重链Fd及κ链基因，构建噬菌体抗体库，筛选出人抗AFP Fab片断，用ELISA检测其特异性。结果 初步克隆出人抗AFP Fab，该Fab具有结合AFP的活性。结论 噬菌体抗体库技术绕过了细胞杂交这一步骤，较好的解决了人体杂交瘤低效的难题，为人源性单抗的制备开辟了广阔的前景。
, 百拇医药
中图法分类号： Q939.48；R373.9 文献标识码： A
文章编号：1000-5404(2000)07-0682-03
Construction of phage antibody library and screening of human anti-ATP monoclonal antibody
XIAO Tian-li, LIU Wei-wen, FANG Dian-chun
(Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
Abstract： Objective To isolate human anti-ATP Fab fragment from phage antibody library. Methods Human immunoglobulin heavy chain Fd genes and κ chain genes were amplified by RT-PCR and phage antibody library was constructed. Human anti-AFP Fab was obtained and its binding activity to AFP was tested by ELISA. Results The objective fragment was obtained and its specificity was identified by ELISA. Conclusion The successful isolation of human anti-ATP Fab proves the feasibility of phage display system in human McAb preparation and founds a basis for the further characterization and clinical application of the Fab.
, 百拇医药
Key words: phage antibody library; human monoclonal antibody; α-fetoprotein
抗体在现代医学中起着重要的作用，被广泛地运用于实验室研究、疾病的诊断与治疗。鼠源性单抗易产生抗鼠抗体，限制其反复使用[1] 。常规人单抗制备方法效率低下、不稳定[2] ，而鼠源性单抗人源化仅取得有限的成功[3,4] 。90年代初发展起来的噬菌体抗体库技术为人单抗的制备开创了一个全新的技术领域[5] 。本研究用噬菌体抗体库技术初步克隆出抗AFP人单抗，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 质粒、菌株、主要溶液及试剂 表达载体pComb3H为美国Scripps研究所Barbas教授惠赠。大肠杆菌菌株XL1-blue和辅助噬菌体VCSM13购自Stratagene公司。 SB培养液：3%蛋白胨， 2%酵母提取物， 1% MOPS，pH 7.0。SOC培养液：2%蛋白胨，0.5%酵母提取物，0.05% NaCl，2.5 mmol/L KCl,pH 7.4，高压灭菌，使用前加入MgCl2至10 mmol/L，葡萄糖至20 mmol/L。人源性AFP购自上海生物制品研究所。
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1.2 引物
引物设计参照文献[6]，由上海细胞所合成。重链Fd段5'端引物VH1a：5'-CAGGTGCAGCTCGAGCAGTCGGGG-3'；VH3a:5'-GAGGTGCAGCTCGAGGAGTCTGGG-3';3'端引物CG1z:5'-GCATGAACTAGTTTTGTCACAAGATTTGGG-3'。它们分别含有限制性内切酶XhoⅠ和SpeⅠ(下划线部位)识别序列。轻链κ链5'端引物Vk1a:5'-GACATCGAGCTCACCCACTCTCCA-3'和Vk3a:5'-GAAATTGAGCTCACCCAGTCTCCA-3';3'端引物Ck1d:5'-GCGCCGTCTAGAATTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGAACTCAG-3'。它们分别含有限制性内切酶SacⅠ和XbaⅠ(下划线部分)的识别序列。
1.3 淋巴细胞总RNA的提取、逆转录PCR法克隆Fd段基因及κ链基因
, 百拇医药
用硫氰酸胍-酚-氯仿一步法[7]提取AFP(+)原发性肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)患者外周血淋巴细胞总RNA。取约20μg总RNA，加入1μgOligodT，250mmol/LdNTP及200UM-MLV逆转录酶(GIBCOLBRL)，按产品说明书进行cDNA合成。PCR扩增Fd段基因及κ链基因，条件为94℃变性20min、52℃退火50s、72℃延伸1.5min、最后72℃延伸10min、共进行35轮循环。
1.4 大肠杆菌的电穿孔转化 2.5ml过夜培养的XL1-Blue菌液接种到500mlSB中，37℃培养至A600=0.7～0.8，冰浴15min，4℃离心，弃上清，用10%冷甘油将细菌洗涤2次后，悬浮于2ml10%甘油中，-70℃冻存备用。电穿孔时将细菌取出融化，使用Bio-Rad公司的Genepulsertransfection系统，按说明书进行穿孔。
1.5 噬菌体抗体库的构建 将PCR扩增的κ链DNA经SacI+XbaI消化，电泳纯化后插入载体pComb3H中，电穿孔转化XL1-Blue细胞，扩增转化后的细菌，提取质粒得到轻链库DNA。同样，将PCR扩增的FdDNA经XhoI+SpeI消化，插入轻链库质粒，电穿孔转化XL1-Blue,纯化的细菌加3mlSOC培养液，30℃培养1h后加入含氨苄青霉素50μg/ml及四环素10μg/mlSB20ml，37℃振荡培养2h，加入约1012空斑形成单位(PFU)的辅助噬菌体VCSM13，接种到100ml含相同抗生素的SB中，37℃振荡培养2h，加入卡那霉素至终浓度70μg/ml，30～37℃振荡培养过夜，离心收集上清，加入PEG-8000到4%，NaCl到3%，冰浴30min后，离心弃上清，以2ml含1%BSA的TBS溶解沉淀，离心收集上清即为噬菌体抗体库。
, 百拇医药
1.6 噬菌体抗体库滴度的测定 将噬菌体抗体库溶液按一定比例稀释于SB中，取10ml加到100mlXL1-Blue(A600=1.0)中,铺氨苄青霉素培养基，37℃培养过夜，次日计数集落，计算集落形成单位(CFU)。
1.7 菌落直接PCR鉴定法 挑取单个细菌集落，悬于200ml水中，煮沸2min，取2ml以适当引物进行PCR反应，琼脂糖凝胶电泳检测相应扩增带。
1.8 噬菌体抗体库的筛选(Panning) 将AFP以0.05%碳酸盐缓冲液稀释至40μg/ml，每孔25μl(1μgAFP)包被ELISA板，吸去包被液，以含3%BSA的PBS加满小孔，37℃封闭1h，吸去封闭液，加入50μl噬菌体抗体库液(约1011～1012个CFU)，37℃培育2h，吸去噬菌体抗体液，以含0.05%吐温的TBS加满小孔，用力吹打。5min后吸弃TBS(第2轮洗5次，第3轮以后洗10次)，加入50μl的洗脱液(0.1mol/LHCl，以甘氨酸调至pH2.2，加BSA至0.1%)，室温静置10min，将洗脱液稍加吹打后吸出，立即加入3μl2mol/LTris中和，加2mlXL1-Blue(A600=1)，室温静置15min感染，接种到10mlSB(含氨苄青霉素20μg/ml，四环素10μg/ml)中，取1.0μl和10μl铺盘测定CFU，其余菌液30℃振荡培养1h，加入氨苄青霉素至终浓度50μg/ml，37℃继续培养1h，加入辅助噬菌体VCSM131012PFU，接种到100mlSB(含氨苄青霉素及四环素)中，37℃培养2h，加入卡那霉素至终浓度70μg/ml，30～37℃振荡培养过夜，离心，上清进行PEG沉淀，所得的次级噬菌体抗库可进行下一轮的筛选。
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1.9 可溶性Fab分子的表达 将第4轮筛选扩增的细菌提取双链质粒DNA，用SpeI/NheI消化，切除噬菌体外壳蛋白Ⅲ的编码基因，经连接酶连接自身环化后转化XL1-Blue细菌，铺氨苄青霉素盘，次日随机挑取单集落，接种到10mlSB(含50μg/ml氨苄青霉素，20mmol/LMgCl2)，37℃振荡培养6h，加入IPTG至1mmol/L，诱导表达可溶性Fab段分子，然后降低培养温度至30℃，振荡培养过夜，离心收集上清用于ELISA检测。
1.10 EL1SA检测抗体特异性 用AFP包被ELISA板，以3%BSA封闭非特异结合部位，加入待检噬菌体抗体溶液，以HRP-羊抗人IgGFab进行结合反应，以底物邻苯二胺显色，测定492nm处的D492值。
1.11 抗AFPFab段轻重链DNA序列测定 按照T7DNA聚合酶测序操作说明书进行。
, 百拇医药 2 结果
2.1 扩增的Fd段和κ链基因 从AFP阳性的HCC患者外周血分离淋巴细胞，提取RNA，逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，用PCR方法用人免疫球蛋白可变区引物扩增Fd和κ链的基因，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，可在680bp处见到扩增带，见图1。
图1 Fd段和κ链的PCR扩增M:λDNAHindⅢ/EcoRⅠ消化
1:κ链PCR产物；2:Fd段PCR产物
Fig1 PCRamplificationofFdgenesandκchaingenes
M:λDNAHindⅢ/EcoRIdigest；1:PCRproductofκchaingens;2:PCRproductofFdgenes
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2.2 轻链库 将PCR扩增的κ链DNA经琼脂糖电泳分离，电洗脱回收后，用SacI+XbaI消化，重组到载体pComb3H相应的酶切部位，电穿孔转化大肠杆菌XL1-Blue，取少量细菌铺盘，测定库容量为4×106，随机挑取10个集落，用直接PCR鉴定法扩增κ链基因，鉴定重组率，重组率为70%。其余的细菌，继续培养，提取质粒，即为轻链库DNA。
2.3 构建的噬菌体抗体库 将PCR扩增的Fd段DNA经XhoI+SpeI消化，重组到轻链库质粒DNA相应的酶切部位，经电穿孔转化大肠杆菌，取少量细菌铺盘，计数集落测定库容约为1×107。从培养盘上随机挑取10个细菌集落，用直接PCR鉴定法扩增Fd段基因，重组率为50%，其余的菌液加入辅助噬菌体VCSM13超感染，经PEG沉淀，分离收集上清，即为噬菌体抗体库(滴度为1.3×1012CFU/ml)。
2.4 筛选噬菌体抗体库 以AFP抗原对噬菌体抗体库进行了4轮吸附→洗脱→扩增的富集性筛选。尽管从第1轮到第4轮的洗涤次数分别由1次增加到5、10次。但从固相洗脱下来的噬菌体滴度却显示出明显的增加趋势，第4轮比第1轮增加了40倍，见表1。
, 百拇医药
表1 亲和吸附筛选对噬菌体抗体的富集效应
Tab 1 Antigen-specific sorting enrichment of phagedisplaying Fab fragment Round of
panning
Input
CFU
Eluted
CFU
Clones containing
Fab genes
0
, 百拇医药
-
-
1/10
1
1.3×1012
2.0×104
2/10
2
2.5×1011
7.0×104
3/10
3
, 百拇医药
1.5×1011
3.1×105
5/10
4
2.5×1011
8.0×105
8/10
2.5 ELISA法检测抗体特异性
将第4轮筛选后得到的细菌集落中，挑取24个克隆制备噬菌体抗体，用间接ELISA法测定其与抗体AFP的结合活性，其中有18个克隆结果为阳性，其中7个标本的D492结果分别为(1.43±0.04)、(1.56±0.01)、(1.27±0.34)、(1.02±0.08)、(1.06±0.28)、(0.55±0.08)、(1.11±0.02)，而含有空载体pComb3H E.coli的培养上清的对照组为(0.02±0.01)。
, 百拇医药
2.6 同源性检索
对筛选出的抗AFP Fab段克隆1的轻重链可变区的序列进行测定后，通过Internet联机终端检索，对获得的基因片段与GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB Ig基因库已知DNA序列进行同源性比较。结果显示克隆1重链可变区基因为人免疫球蛋白重排重链V区基因VHⅢ亚群(同源性为91%～100%)；轻链可变区基因VL属于人免疫球蛋白胚系κ轻链V区基因VκⅠ亚群(同源性为90%左右)。
3 讨论
90年代初发展起来的噬菌体抗体库技术为单抗的制备开辟了全新的技术领域。该技术用PCR方法，把免疫球蛋白全套可变区基因扩增出来，重组到噬菌体表达载体中，并通过与噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白，使抗体片段表达于噬菌体表面。这样噬菌体就模仿了B淋巴细胞。将免疫球蛋白可变区基因克隆入噬菌体载体，建立噬菌体抗体库，与固相化的特异性抗原相结合，将非结合的噬菌体冲掉，将结合的噬菌体洗脱下来而回收，用以感染新的大肠杆菌，产生更多的噬菌体，为下轮筛选做准备。这样通过数轮“吸附→洗脱→扩增”过程，模仿体内的免疫选择可轻而易举地筛选容量为108的噬菌体抗体库。我们运用噬菌体抗体库技术，初步成功制备了抗AFP人单抗Fab片段，证明了这个系统的有效性。噬菌体抗体库技术绕过了细胞杂交这一关，较好地解决了人体杂交瘤低效的难题，为人源性单抗的制备开辟了广阔的前景。
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作者简介： 肖天利(1962-)，男，四川省岳池县人，博士，副教授，主要从事肝癌的治疗方面的研究，发表论文5篇。电话：(023)68754678
参考文献：
[1] Shawler D L,Bartholomew R M,Smith I M,et al.Human immune response to multiple injections of murine monoclonal IgG[J]. J Immunol，1985，135(2):1 530-1 535.
[2] Thompson K M. Human monoclonal antibodies[J]. Immunol Today，1988，6(4):113-117.
[3] Morrison S L, Johson M J, Herzenberg L A, et al. Chimeric human antibody molecules: Mouse antigen-binding domains with human constant region domains[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1984，81(21):6 851-6 855.
, http://www.100md.com
[4] Riechmann L, Clark M, Waldmann H, et al. Reshaping human antibodies for therapy[J]. Nature，1988，332(6 162):323-327.
[5] Marks J D, Hoogenboom H R, Griffiths A D, et al. Molecular evolution of proteins on filamentous phage: Mimicking the strategy of the immune system[J]. J Biol Chem，1992，267(23):16 007-16 010.
[6] Persson M A, Caothien R H, Burton D R. Generation of diverse high affinity human monoclonal antibodies by repertoire cloning[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1991，88(6):2 432-2 436.
[7] Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction[J]. Anal Biochem，1987，162(6 211):156-159.
收稿日期： 1999-09-10；修回日期： 2000-02-19, http://www.100md.com
单位：肖天利(第三军医大学附属西南医院消化内科，重庆 400038)；刘为纹(第三军医大学附属西南医院消化内科，重庆 400038)；房殿春(第三军医大学附属西南医院消化内科，重庆 400038)
关键词：噬菌体抗体库；人单克隆抗体；AFP
第三军医大学学报000721
提 要： 目的 运用噬菌体抗体库技术，制备人源性抗AFP Fab段，为进一步的研究和临床运用打下基础。方法 用RT-PCR方法扩增人免疫球蛋白重链Fd及κ链基因，构建噬菌体抗体库，筛选出人抗AFP Fab片断，用ELISA检测其特异性。结果 初步克隆出人抗AFP Fab，该Fab具有结合AFP的活性。结论 噬菌体抗体库技术绕过了细胞杂交这一步骤，较好的解决了人体杂交瘤低效的难题，为人源性单抗的制备开辟了广阔的前景。
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中图法分类号： Q939.48；R373.9 文献标识码： A
文章编号：1000-5404(2000)07-0682-03
Construction of phage antibody library and screening of human anti-ATP monoclonal antibody
XIAO Tian-li, LIU Wei-wen, FANG Dian-chun
(Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
Abstract： Objective To isolate human anti-ATP Fab fragment from phage antibody library. Methods Human immunoglobulin heavy chain Fd genes and κ chain genes were amplified by RT-PCR and phage antibody library was constructed. Human anti-AFP Fab was obtained and its binding activity to AFP was tested by ELISA. Results The objective fragment was obtained and its specificity was identified by ELISA. Conclusion The successful isolation of human anti-ATP Fab proves the feasibility of phage display system in human McAb preparation and founds a basis for the further characterization and clinical application of the Fab.
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Key words: phage antibody library; human monoclonal antibody; α-fetoprotein
抗体在现代医学中起着重要的作用，被广泛地运用于实验室研究、疾病的诊断与治疗。鼠源性单抗易产生抗鼠抗体，限制其反复使用[1] 。常规人单抗制备方法效率低下、不稳定[2] ，而鼠源性单抗人源化仅取得有限的成功[3,4] 。90年代初发展起来的噬菌体抗体库技术为人单抗的制备开创了一个全新的技术领域[5] 。本研究用噬菌体抗体库技术初步克隆出抗AFP人单抗，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 质粒、菌株、主要溶液及试剂 表达载体pComb3H为美国Scripps研究所Barbas教授惠赠。大肠杆菌菌株XL1-blue和辅助噬菌体VCSM13购自Stratagene公司。 SB培养液：3%蛋白胨， 2%酵母提取物， 1% MOPS，pH 7.0。SOC培养液：2%蛋白胨，0.5%酵母提取物，0.05% NaCl，2.5 mmol/L KCl,pH 7.4，高压灭菌，使用前加入MgCl2至10 mmol/L，葡萄糖至20 mmol/L。人源性AFP购自上海生物制品研究所。
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1.2 引物
引物设计参照文献[6]，由上海细胞所合成。重链Fd段5'端引物VH1a：5'-CAGGTGCAGCTCGAGCAGTCGGGG-3'；VH3a:5'-GAGGTGCAGCTCGAGGAGTCTGGG-3';3'端引物CG1z:5'-GCATGAACTAGTTTTGTCACAAGATTTGGG-3'。它们分别含有限制性内切酶XhoⅠ和SpeⅠ(下划线部位)识别序列。轻链κ链5'端引物Vk1a:5'-GACATCGAGCTCACCCACTCTCCA-3'和Vk3a:5'-GAAATTGAGCTCACCCAGTCTCCA-3';3'端引物Ck1d:5'-GCGCCGTCTAGAATTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGAACTCAG-3'。它们分别含有限制性内切酶SacⅠ和XbaⅠ(下划线部分)的识别序列。
1.3 淋巴细胞总RNA的提取、逆转录PCR法克隆Fd段基因及κ链基因
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用硫氰酸胍-酚-氯仿一步法[7]提取AFP(+)原发性肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)患者外周血淋巴细胞总RNA。取约20μg总RNA，加入1μgOligodT，250mmol/LdNTP及200UM-MLV逆转录酶(GIBCOLBRL)，按产品说明书进行cDNA合成。PCR扩增Fd段基因及κ链基因，条件为94℃变性20min、52℃退火50s、72℃延伸1.5min、最后72℃延伸10min、共进行35轮循环。
1.4 大肠杆菌的电穿孔转化 2.5ml过夜培养的XL1-Blue菌液接种到500mlSB中，37℃培养至A600=0.7～0.8，冰浴15min，4℃离心，弃上清，用10%冷甘油将细菌洗涤2次后，悬浮于2ml10%甘油中，-70℃冻存备用。电穿孔时将细菌取出融化，使用Bio-Rad公司的Genepulsertransfection系统，按说明书进行穿孔。
1.5 噬菌体抗体库的构建 将PCR扩增的κ链DNA经SacI+XbaI消化，电泳纯化后插入载体pComb3H中，电穿孔转化XL1-Blue细胞，扩增转化后的细菌，提取质粒得到轻链库DNA。同样，将PCR扩增的FdDNA经XhoI+SpeI消化，插入轻链库质粒，电穿孔转化XL1-Blue,纯化的细菌加3mlSOC培养液，30℃培养1h后加入含氨苄青霉素50μg/ml及四环素10μg/mlSB20ml，37℃振荡培养2h，加入约1012空斑形成单位(PFU)的辅助噬菌体VCSM13，接种到100ml含相同抗生素的SB中，37℃振荡培养2h，加入卡那霉素至终浓度70μg/ml，30～37℃振荡培养过夜，离心收集上清，加入PEG-8000到4%，NaCl到3%，冰浴30min后，离心弃上清，以2ml含1%BSA的TBS溶解沉淀，离心收集上清即为噬菌体抗体库。
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1.6 噬菌体抗体库滴度的测定 将噬菌体抗体库溶液按一定比例稀释于SB中，取10ml加到100mlXL1-Blue(A600=1.0)中,铺氨苄青霉素培养基，37℃培养过夜，次日计数集落，计算集落形成单位(CFU)。
1.7 菌落直接PCR鉴定法 挑取单个细菌集落，悬于200ml水中，煮沸2min，取2ml以适当引物进行PCR反应，琼脂糖凝胶电泳检测相应扩增带。
1.8 噬菌体抗体库的筛选(Panning) 将AFP以0.05%碳酸盐缓冲液稀释至40μg/ml，每孔25μl(1μgAFP)包被ELISA板，吸去包被液，以含3%BSA的PBS加满小孔，37℃封闭1h，吸去封闭液，加入50μl噬菌体抗体库液(约1011～1012个CFU)，37℃培育2h，吸去噬菌体抗体液，以含0.05%吐温的TBS加满小孔，用力吹打。5min后吸弃TBS(第2轮洗5次，第3轮以后洗10次)，加入50μl的洗脱液(0.1mol/LHCl，以甘氨酸调至pH2.2，加BSA至0.1%)，室温静置10min，将洗脱液稍加吹打后吸出，立即加入3μl2mol/LTris中和，加2mlXL1-Blue(A600=1)，室温静置15min感染，接种到10mlSB(含氨苄青霉素20μg/ml，四环素10μg/ml)中，取1.0μl和10μl铺盘测定CFU，其余菌液30℃振荡培养1h，加入氨苄青霉素至终浓度50μg/ml，37℃继续培养1h，加入辅助噬菌体VCSM131012PFU，接种到100mlSB(含氨苄青霉素及四环素)中，37℃培养2h，加入卡那霉素至终浓度70μg/ml，30～37℃振荡培养过夜，离心，上清进行PEG沉淀，所得的次级噬菌体抗库可进行下一轮的筛选。
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1.9 可溶性Fab分子的表达 将第4轮筛选扩增的细菌提取双链质粒DNA，用SpeI/NheI消化，切除噬菌体外壳蛋白Ⅲ的编码基因，经连接酶连接自身环化后转化XL1-Blue细菌，铺氨苄青霉素盘，次日随机挑取单集落，接种到10mlSB(含50μg/ml氨苄青霉素，20mmol/LMgCl2)，37℃振荡培养6h，加入IPTG至1mmol/L，诱导表达可溶性Fab段分子，然后降低培养温度至30℃，振荡培养过夜，离心收集上清用于ELISA检测。
1.10 EL1SA检测抗体特异性 用AFP包被ELISA板，以3%BSA封闭非特异结合部位，加入待检噬菌体抗体溶液，以HRP-羊抗人IgGFab进行结合反应，以底物邻苯二胺显色，测定492nm处的D492值。
1.11 抗AFPFab段轻重链DNA序列测定 按照T7DNA聚合酶测序操作说明书进行。
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2.1 扩增的Fd段和κ链基因 从AFP阳性的HCC患者外周血分离淋巴细胞，提取RNA，逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，用PCR方法用人免疫球蛋白可变区引物扩增Fd和κ链的基因，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，可在680bp处见到扩增带，见图1。
图1 Fd段和κ链的PCR扩增M:λDNAHindⅢ/EcoRⅠ消化
1:κ链PCR产物；2:Fd段PCR产物
Fig1 PCRamplificationofFdgenesandκchaingenes
M:λDNAHindⅢ/EcoRIdigest；1:PCRproductofκchaingens;2:PCRproductofFdgenes
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2.2 轻链库 将PCR扩增的κ链DNA经琼脂糖电泳分离，电洗脱回收后，用SacI+XbaI消化，重组到载体pComb3H相应的酶切部位，电穿孔转化大肠杆菌XL1-Blue，取少量细菌铺盘，测定库容量为4×106，随机挑取10个集落，用直接PCR鉴定法扩增κ链基因，鉴定重组率，重组率为70%。其余的细菌，继续培养，提取质粒，即为轻链库DNA。
2.3 构建的噬菌体抗体库 将PCR扩增的Fd段DNA经XhoI+SpeI消化，重组到轻链库质粒DNA相应的酶切部位，经电穿孔转化大肠杆菌，取少量细菌铺盘，计数集落测定库容约为1×107。从培养盘上随机挑取10个细菌集落，用直接PCR鉴定法扩增Fd段基因，重组率为50%，其余的菌液加入辅助噬菌体VCSM13超感染，经PEG沉淀，分离收集上清，即为噬菌体抗体库(滴度为1.3×1012CFU/ml)。
2.4 筛选噬菌体抗体库 以AFP抗原对噬菌体抗体库进行了4轮吸附→洗脱→扩增的富集性筛选。尽管从第1轮到第4轮的洗涤次数分别由1次增加到5、10次。但从固相洗脱下来的噬菌体滴度却显示出明显的增加趋势，第4轮比第1轮增加了40倍，见表1。
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表1 亲和吸附筛选对噬菌体抗体的富集效应
Tab 1 Antigen-specific sorting enrichment of phagedisplaying Fab fragment Round of
panning
Input
CFU
Eluted
CFU
Clones containing
Fab genes
0
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1
1.3×1012
2.0×104
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7.0×104
3/10
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3.1×105
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2.5 ELISA法检测抗体特异性
将第4轮筛选后得到的细菌集落中，挑取24个克隆制备噬菌体抗体，用间接ELISA法测定其与抗体AFP的结合活性，其中有18个克隆结果为阳性，其中7个标本的D492结果分别为(1.43±0.04)、(1.56±0.01)、(1.27±0.34)、(1.02±0.08)、(1.06±0.28)、(0.55±0.08)、(1.11±0.02)，而含有空载体pComb3H E.coli的培养上清的对照组为(0.02±0.01)。
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2.6 同源性检索
对筛选出的抗AFP Fab段克隆1的轻重链可变区的序列进行测定后，通过Internet联机终端检索，对获得的基因片段与GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB Ig基因库已知DNA序列进行同源性比较。结果显示克隆1重链可变区基因为人免疫球蛋白重排重链V区基因VHⅢ亚群(同源性为91%～100%)；轻链可变区基因VL属于人免疫球蛋白胚系κ轻链V区基因VκⅠ亚群(同源性为90%左右)。
3 讨论
90年代初发展起来的噬菌体抗体库技术为单抗的制备开辟了全新的技术领域。该技术用PCR方法，把免疫球蛋白全套可变区基因扩增出来，重组到噬菌体表达载体中，并通过与噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白，使抗体片段表达于噬菌体表面。这样噬菌体就模仿了B淋巴细胞。将免疫球蛋白可变区基因克隆入噬菌体载体，建立噬菌体抗体库，与固相化的特异性抗原相结合，将非结合的噬菌体冲掉，将结合的噬菌体洗脱下来而回收，用以感染新的大肠杆菌，产生更多的噬菌体，为下轮筛选做准备。这样通过数轮“吸附→洗脱→扩增”过程，模仿体内的免疫选择可轻而易举地筛选容量为108的噬菌体抗体库。我们运用噬菌体抗体库技术，初步成功制备了抗AFP人单抗Fab片段，证明了这个系统的有效性。噬菌体抗体库技术绕过了细胞杂交这一关，较好地解决了人体杂交瘤低效的难题，为人源性单抗的制备开辟了广阔的前景。
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作者简介： 肖天利(1962-)，男，四川省岳池县人，博士，副教授，主要从事肝癌的治疗方面的研究，发表论文5篇。电话：(023)68754678
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收稿日期： 1999-09-10；修回日期： 2000-02-19, http://www.100md.com