IL-1对肾小球系膜细胞增殖和周期素依赖激酶2表达的影响
作者：赵景宏 王军平 曾毅 杨惠标
单位：赵景宏(第三军医大学附属新桥医院肾内科，重庆 400037)；王军平(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所，重庆 400038)；曾毅(第三军医大学附属新桥医院肾内科，重庆 400037)；杨惠标(第三军医大学附属新桥医院肾内科，重庆 400037)
关键词：白细胞介素-1；系膜细胞；CDK2
第三军医大学学报000719 提 要： 目的 探讨白细胞介素-1(IL-1)对肾小球系膜细胞增殖及周期素依赖激酶2(CDK2)表达的影响。方法 利用体外培养的大鼠肾小球系膜细胞，分别采用噻唑蓝掺入法、流式细胞仪检测、免疫细胞化学等方法观察IL-1作用前后系膜细胞增殖情况以及CDK2的表达变化。结果 IL-1可以明显促进系膜细胞增殖，同时伴有CDK2的表达增高。结论 IL-1对系膜细胞有明显的促增殖作用，其机制可能与影响CDK2的表达有关。
, 百拇医药
中图法分类号： R392.12 文献标识码： A
文章编号：1000-5404(2000)07-0676-03
Effects of interleukin-1 on proliferation and CDK2 expression of glumerular mesangial cells of rats
ZHAO Jing-hong, WANG Jun-ping， ZENG Yi, YANG Hui-biao
(Department of Nephrology, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037,China)
, 百拇医药 Abstract： Objective To study the effects of interleukin-1 (IL-1) on the proliferation of the glomerular mesangial cells of rats in culture and cyclin-dependent kinase-2 (CDK2) expression in the cells.Methods MTT, flow cytometry and immunocytochemistry were employed.Results The expression of CDK2 was increased in the proliferative phase of glomerular mesangial cells induced with IL-2.Conclusion CDK2 can be used as a marker to show the conversion of glomerular mesangial cells from the quiescent phase to proliferative phase.
, 百拇医药
Key words： interleukin-1;mesangial cell;glomerulus; cyclin-dependent kinase-2;rat
肾小球系膜细胞增生在肾小球肾炎及肾小球硬化过程中起着非常关键的作用[1]。然而，肾小球系膜细胞增生的内部机制尚不清楚。近年来研究表明，细胞的增殖状态与细胞周期调控蛋白的表达变化密切相关。周期素依赖激酶2(Cyclin dependent kinase 2, CDK2)是细胞周期正调控蛋白的一种，它通过与周期素(cyclin)结合而形成活性复合物,发挥促进细胞增殖的作用[2]。本研究探讨了炎性介质IL-1对肾小球系膜细胞周期素依赖激酶CDK2表达的影响及其与系膜细胞增生的关系，旨在细胞周期水平阐明IL-1等炎性因子刺激系膜细胞增生的作用机制，从而进一步解释某些疾病的发生、发展过程。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 肾小球系膜细胞培养与鉴定 6～8周龄Wistar大鼠，体重在80～120 g，无菌条件下取大鼠肾脏，用无菌D-Hanks液冲洗,剥离肾包膜，分离肾皮质，用剪刀将其剪成碎块，置于100目筛网上研磨，收集过筛悬液，倒在150目筛网上反复冲洗，最后将冲洗下来的悬液倒在200目筛网上，尽量只冲洗不研磨。吸出少许组织倒置显微镜下观察肾小球纯度达98%，即收集网上肾小球，用0.7%的Ⅳ型胶原酶消化，边消化边观察，以肾小球囊从肾小球剥脱为适度，然后1 000 r/min离心5 min，弃上清，以20%小牛血清RPMI 1640悬浮肾小球，置培养瓶中在37 ℃、5% CO2孵箱中孵育。倒置显微镜下观察培养的细胞形态。分别用抗结蛋白、抗细胞角蛋白、抗Ⅷ因子相关抗原抗体进行免疫组化染色。染色结果显示抗结蛋白为阳性，抗细胞角蛋白和Ⅷ因子相关抗原为阴性，表明培养的细胞为系膜细胞[3]。
1.2 肾小球系膜细胞增殖情况的观察
, 百拇医药 取2～4代生长良好的系膜细胞接种于96孔细胞培养板，约3×103细胞/孔，用20%FCS1640培养液培养48h后，换无血清1640培养液同步24h，然后分2组，每组8个样本进行以下实验。第1组为对照组加入无血清1640培养液，第2组为无血清1640培养液中加入10ng/ml的IL-1(北京中山公司)。分组培养8、16、24、32h后用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖，用酶标仪读取各个样本D490值。
1.3 流式细胞仪检测细胞周期各阶段细胞数的百分比
肾小球系膜细胞6×105培养于25cm2培养瓶中，24h后更换无血清培养液使细胞同步24h，然后进行同上的分组培养。根据以上MTT检测结果，选择IL-1作用最明显的时相点用流式细胞仪检测细胞周期各阶段细胞数的百分比，以观察IL-1对细胞周期的影响。流式细胞仪为美国BIO-RADModel3550。
, 百拇医药
1.4 免疫细胞化学染色 参照S-P试剂盒操作方法：细胞培养情况同上，8、16、24、32h后分别进行细胞滴片，4%的多聚甲醛固定，0.3%H2O2,0.3%TritonX-100及10%山羊血清进行封闭，加入1∶100稀释一抗37℃孵育1h(CDK2一抗购自武汉博士德公司)，再与生物素标记二抗及链霉素亲生物蛋白-过氧化物酶复合物反应，DAB显色。阴性对照用0.01mol/LPBS代替一抗进行免疫细胞化学染色。
1.5 统计学处理 采用t检验。
2 结果
2.1 IL-1对系膜细胞增殖的影响 MTT法检测证明IL-1对系膜细胞有明显的促增殖作用，在24h系膜细胞增殖达到高峰，见表1。
表1 MTT法检测IL-1对系膜细胞增殖的影响(
±s)
, 百拇医药
Tab 1 Effect of IL-1 on the proliferation of
mesangial cells(±s) Group
8 h
16 h
24 h
32 h
Control
0.194±0.006
0.205±0.011
0.215±0.018
, 百拇医药
0.211±0.009
IL-1
0.239±0.003*
0.287±0.004*
0.325±0.017*
0.309±0.008*
*：P<0.01 vs control
2.2 流式细胞仪检测细胞周期各阶段细胞数百分比的结果
根据MTT检测结果，我们分析了系膜细胞增殖达高峰时(IL-1作用后24 h)细胞周期各阶段细胞数百分比。结果与正常对照组比较，IL-1作用24 h时培养系膜细胞S期的细胞数增加显著(P<0.05)，见表2。
, http://www.100md.com
表2 IL-1对系膜细胞细胞周期各阶段的影响(%)
Tab 2 Effect of IL-1 on the stages of cellcycle of mesangial cells(%) Group
G1
S
G2/M
Control
92.6
7.1
0.3
IL-1
, 百拇医药
88.9
10.9*
0.2
*：P<0.05 vs control
2.3 免疫细胞化学染色结果
与正常系膜细胞免疫化学染色相比，IL-1作用后各时相点CDK2免疫化学染色均明显增强，其中24 h时最为显著，见图1、2。
图1 体外培养正常系膜细胞CDK2低表达 (S-P×200)
Fig 1 Low expression of CDK2 in normal mesangial
, 百拇医药
cells cultured in vitro (S-P×200)
图2 IL-1作用24 h后CDK2表达明显增高 (S-P×200)
Fig 2 The expression of CDK2 increased significantly inmesangial cells treated with interleukin-1 for 24 h(S-P×200)
3 讨论
肾小球系膜细胞增生是导致肾小球硬化乃至肾功能衰竭的主要原因之一。而细胞增殖实质上是促进与抑制增生的失衡。近年来研究表明，细胞增殖的调节最终发生在细胞周期水平上，整个细胞周期的完成有赖于正性和负性周期调节蛋白之间的平衡[4]。周期蛋白依赖激酶(CDK)是一类正性细胞周期调节蛋白, 它们通过与周期素结合而形成活性复合物，这些复合物中有些是G0/G1时相转换与G1早期所需[5,6], 有些是G1/S期DNA合成与M期有丝分裂所需。在非肾系细胞的研究中发现, 细胞增殖时CDK2表达明显增高，细胞静止时CDK2水平则较低。所以我们推测CDK2有可能在肾小球系膜细胞的增生中占有重要的地位，各种细胞因子刺激系膜细胞增殖或许与CDK2表达变化密切相关。
, 百拇医药
已知IL-1是引起肾小球病变的主要炎症介质之一， 但到目前为止IL-1对肾小球系膜细胞的影响尤其是其影响机制尚未清楚。本实验的MTT和流式细胞仪结果表明IL-1可以显著刺激系膜细胞增生，使由G0/G1期进入S期的细胞增加，也就是DNA合成增加。我们进一步采用免疫细胞化学染色证实IL-1诱导培养系膜细胞增殖的同时CDK2表达增高。CDK2的表达增高将引起cyclin-CDK活性增强, 表明IL-1对系膜细胞的促增殖作用与CDK2的表达上调有关, 从而揭示了IL-1影响系膜细胞增生的内部机制。 并由此提示我们在治疗以肾小球系膜细胞增生为特征的肾脏疾病时,可以将CDK2作为作用目标。
随着细胞周期成为近年来的研究热点，在肾脏领域的研究也将日益受到关注，细胞因子与细胞周期正、负调控蛋白的关系已倍受重视，通过这方面的研究可以从根本上揭示各种细胞因子的作用机制，并从一个全新的角度揭示肾脏疾病的发生机制，为肾脏疾病提供新的治疗途径。
, 百拇医药
作者简介： 赵景宏(1973-), 女，河北省保定市人，硕士研究生，医师，主要从事增殖性肾病方面的研究。电话：(023)65426995
参考文献：
[1] Floege J, Johnson R J, Gorder K, et al. Increased synthesis of extracellular matrix in mesangial proliferative nephritis[J]. Kidney Int,1991,40(3):477-488.
[2] Lees E M, Harlow E. Sequences within the conserved cyclin box of human cyclin A are sufficient for binding to and activation of cdc2 kinase[J]. Mol Cell Biol, 1993, 13(2)：1 194-1 201.
, 百拇医药
[3] 于力方，陈香美，黎磊石.正常人肾小球系膜细胞培养的研究[J].中华肾脏病杂志，1990，6(2)：70-72.
[4] Morgan D O. Principles of CDK regulation[J]. Nature,1995,374(6 518)：131-134.
[5] Ohtsubo M, Theodoras A M, Schumacher J, et al. Human cyclin E, a nuclear protein essential for the G1 to S phase transition[J]. Mol Cell Biol, 1995,15(5):2 612-2 624.
[6] Girard F, Strausfeld U, Fernandez A, et al. Cyclin A is required for the onset of DNA replication in mammalian fibroblasts[J]. Cell,1991，67(6):1 169-1 179.
收稿日期： 1999-11-07；修回日期： 2000-04-11, http://www.100md.com
单位：赵景宏(第三军医大学附属新桥医院肾内科，重庆 400037)；王军平(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所，重庆 400038)；曾毅(第三军医大学附属新桥医院肾内科，重庆 400037)；杨惠标(第三军医大学附属新桥医院肾内科，重庆 400037)
关键词：白细胞介素-1；系膜细胞；CDK2
第三军医大学学报000719 提 要： 目的 探讨白细胞介素-1(IL-1)对肾小球系膜细胞增殖及周期素依赖激酶2(CDK2)表达的影响。方法 利用体外培养的大鼠肾小球系膜细胞，分别采用噻唑蓝掺入法、流式细胞仪检测、免疫细胞化学等方法观察IL-1作用前后系膜细胞增殖情况以及CDK2的表达变化。结果 IL-1可以明显促进系膜细胞增殖，同时伴有CDK2的表达增高。结论 IL-1对系膜细胞有明显的促增殖作用，其机制可能与影响CDK2的表达有关。
, 百拇医药
中图法分类号： R392.12 文献标识码： A
文章编号：1000-5404(2000)07-0676-03
Effects of interleukin-1 on proliferation and CDK2 expression of glumerular mesangial cells of rats
ZHAO Jing-hong, WANG Jun-ping， ZENG Yi, YANG Hui-biao
(Department of Nephrology, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037,China)
, 百拇医药 Abstract： Objective To study the effects of interleukin-1 (IL-1) on the proliferation of the glomerular mesangial cells of rats in culture and cyclin-dependent kinase-2 (CDK2) expression in the cells.Methods MTT, flow cytometry and immunocytochemistry were employed.Results The expression of CDK2 was increased in the proliferative phase of glomerular mesangial cells induced with IL-2.Conclusion CDK2 can be used as a marker to show the conversion of glomerular mesangial cells from the quiescent phase to proliferative phase.
, 百拇医药
Key words： interleukin-1;mesangial cell;glomerulus; cyclin-dependent kinase-2;rat
肾小球系膜细胞增生在肾小球肾炎及肾小球硬化过程中起着非常关键的作用[1]。然而，肾小球系膜细胞增生的内部机制尚不清楚。近年来研究表明，细胞的增殖状态与细胞周期调控蛋白的表达变化密切相关。周期素依赖激酶2(Cyclin dependent kinase 2, CDK2)是细胞周期正调控蛋白的一种，它通过与周期素(cyclin)结合而形成活性复合物,发挥促进细胞增殖的作用[2]。本研究探讨了炎性介质IL-1对肾小球系膜细胞周期素依赖激酶CDK2表达的影响及其与系膜细胞增生的关系，旨在细胞周期水平阐明IL-1等炎性因子刺激系膜细胞增生的作用机制，从而进一步解释某些疾病的发生、发展过程。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 肾小球系膜细胞培养与鉴定 6～8周龄Wistar大鼠，体重在80～120 g，无菌条件下取大鼠肾脏，用无菌D-Hanks液冲洗,剥离肾包膜，分离肾皮质，用剪刀将其剪成碎块，置于100目筛网上研磨，收集过筛悬液，倒在150目筛网上反复冲洗，最后将冲洗下来的悬液倒在200目筛网上，尽量只冲洗不研磨。吸出少许组织倒置显微镜下观察肾小球纯度达98%，即收集网上肾小球，用0.7%的Ⅳ型胶原酶消化，边消化边观察，以肾小球囊从肾小球剥脱为适度，然后1 000 r/min离心5 min，弃上清，以20%小牛血清RPMI 1640悬浮肾小球，置培养瓶中在37 ℃、5% CO2孵箱中孵育。倒置显微镜下观察培养的细胞形态。分别用抗结蛋白、抗细胞角蛋白、抗Ⅷ因子相关抗原抗体进行免疫组化染色。染色结果显示抗结蛋白为阳性，抗细胞角蛋白和Ⅷ因子相关抗原为阴性，表明培养的细胞为系膜细胞[3]。
1.2 肾小球系膜细胞增殖情况的观察
, 百拇医药 取2～4代生长良好的系膜细胞接种于96孔细胞培养板，约3×103细胞/孔，用20%FCS1640培养液培养48h后，换无血清1640培养液同步24h，然后分2组，每组8个样本进行以下实验。第1组为对照组加入无血清1640培养液，第2组为无血清1640培养液中加入10ng/ml的IL-1(北京中山公司)。分组培养8、16、24、32h后用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖，用酶标仪读取各个样本D490值。
1.3 流式细胞仪检测细胞周期各阶段细胞数的百分比
肾小球系膜细胞6×105培养于25cm2培养瓶中，24h后更换无血清培养液使细胞同步24h，然后进行同上的分组培养。根据以上MTT检测结果，选择IL-1作用最明显的时相点用流式细胞仪检测细胞周期各阶段细胞数的百分比，以观察IL-1对细胞周期的影响。流式细胞仪为美国BIO-RADModel3550。
, 百拇医药
1.4 免疫细胞化学染色 参照S-P试剂盒操作方法：细胞培养情况同上，8、16、24、32h后分别进行细胞滴片，4%的多聚甲醛固定，0.3%H2O2,0.3%TritonX-100及10%山羊血清进行封闭，加入1∶100稀释一抗37℃孵育1h(CDK2一抗购自武汉博士德公司)，再与生物素标记二抗及链霉素亲生物蛋白-过氧化物酶复合物反应，DAB显色。阴性对照用0.01mol/LPBS代替一抗进行免疫细胞化学染色。
1.5 统计学处理 采用t检验。
2 结果
2.1 IL-1对系膜细胞增殖的影响 MTT法检测证明IL-1对系膜细胞有明显的促增殖作用，在24h系膜细胞增殖达到高峰，见表1。
表1 MTT法检测IL-1对系膜细胞增殖的影响(
±s), 百拇医药
Tab 1 Effect of IL-1 on the proliferation of
mesangial cells(
±s) Group8 h
16 h
24 h
32 h
Control
0.194±0.006
0.205±0.011
0.215±0.018
, 百拇医药
0.211±0.009
IL-1
0.239±0.003*
0.287±0.004*
0.325±0.017*
0.309±0.008*
*：P<0.01 vs control
2.2 流式细胞仪检测细胞周期各阶段细胞数百分比的结果
根据MTT检测结果，我们分析了系膜细胞增殖达高峰时(IL-1作用后24 h)细胞周期各阶段细胞数百分比。结果与正常对照组比较，IL-1作用24 h时培养系膜细胞S期的细胞数增加显著(P<0.05)，见表2。
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表2 IL-1对系膜细胞细胞周期各阶段的影响(%)
Tab 2 Effect of IL-1 on the stages of cellcycle of mesangial cells(%) Group
G1
S
G2/M
Control
92.6
7.1
0.3
IL-1
, 百拇医药
88.9
10.9*
0.2
*：P<0.05 vs control
2.3 免疫细胞化学染色结果
与正常系膜细胞免疫化学染色相比，IL-1作用后各时相点CDK2免疫化学染色均明显增强，其中24 h时最为显著，见图1、2。
图1 体外培养正常系膜细胞CDK2低表达 (S-P×200)
Fig 1 Low expression of CDK2 in normal mesangial
, 百拇医药
cells cultured in vitro (S-P×200)
图2 IL-1作用24 h后CDK2表达明显增高 (S-P×200)
Fig 2 The expression of CDK2 increased significantly inmesangial cells treated with interleukin-1 for 24 h(S-P×200)
3 讨论
肾小球系膜细胞增生是导致肾小球硬化乃至肾功能衰竭的主要原因之一。而细胞增殖实质上是促进与抑制增生的失衡。近年来研究表明，细胞增殖的调节最终发生在细胞周期水平上，整个细胞周期的完成有赖于正性和负性周期调节蛋白之间的平衡[4]。周期蛋白依赖激酶(CDK)是一类正性细胞周期调节蛋白, 它们通过与周期素结合而形成活性复合物，这些复合物中有些是G0/G1时相转换与G1早期所需[5,6], 有些是G1/S期DNA合成与M期有丝分裂所需。在非肾系细胞的研究中发现, 细胞增殖时CDK2表达明显增高，细胞静止时CDK2水平则较低。所以我们推测CDK2有可能在肾小球系膜细胞的增生中占有重要的地位，各种细胞因子刺激系膜细胞增殖或许与CDK2表达变化密切相关。
, 百拇医药
已知IL-1是引起肾小球病变的主要炎症介质之一， 但到目前为止IL-1对肾小球系膜细胞的影响尤其是其影响机制尚未清楚。本实验的MTT和流式细胞仪结果表明IL-1可以显著刺激系膜细胞增生，使由G0/G1期进入S期的细胞增加，也就是DNA合成增加。我们进一步采用免疫细胞化学染色证实IL-1诱导培养系膜细胞增殖的同时CDK2表达增高。CDK2的表达增高将引起cyclin-CDK活性增强, 表明IL-1对系膜细胞的促增殖作用与CDK2的表达上调有关, 从而揭示了IL-1影响系膜细胞增生的内部机制。 并由此提示我们在治疗以肾小球系膜细胞增生为特征的肾脏疾病时,可以将CDK2作为作用目标。
随着细胞周期成为近年来的研究热点，在肾脏领域的研究也将日益受到关注，细胞因子与细胞周期正、负调控蛋白的关系已倍受重视，通过这方面的研究可以从根本上揭示各种细胞因子的作用机制，并从一个全新的角度揭示肾脏疾病的发生机制，为肾脏疾病提供新的治疗途径。
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作者简介： 赵景宏(1973-), 女，河北省保定市人，硕士研究生，医师，主要从事增殖性肾病方面的研究。电话：(023)65426995
参考文献：
[1] Floege J, Johnson R J, Gorder K, et al. Increased synthesis of extracellular matrix in mesangial proliferative nephritis[J]. Kidney Int,1991,40(3):477-488.
[2] Lees E M, Harlow E. Sequences within the conserved cyclin box of human cyclin A are sufficient for binding to and activation of cdc2 kinase[J]. Mol Cell Biol, 1993, 13(2)：1 194-1 201.
, 百拇医药
[3] 于力方，陈香美，黎磊石.正常人肾小球系膜细胞培养的研究[J].中华肾脏病杂志，1990，6(2)：70-72.
[4] Morgan D O. Principles of CDK regulation[J]. Nature,1995,374(6 518)：131-134.
[5] Ohtsubo M, Theodoras A M, Schumacher J, et al. Human cyclin E, a nuclear protein essential for the G1 to S phase transition[J]. Mol Cell Biol, 1995,15(5):2 612-2 624.
[6] Girard F, Strausfeld U, Fernandez A, et al. Cyclin A is required for the onset of DNA replication in mammalian fibroblasts[J]. Cell,1991，67(6):1 169-1 179.
收稿日期： 1999-11-07；修回日期： 2000-04-11, http://www.100md.com