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编号:10215232
食管癌APC/MCC基因杂合缺失的研究
http://www.100md.com 《第三军医大学学报》 2000年第7期
     作者:王明荣 王海东 熊刚 房殿春

    单位:王明荣(第三军医大学附属西南医院胸心外科,重庆 400038);王海东(第三军医大学附属西南医院胸心外科,重庆 400038);熊刚(第三军医大学附属西南医院胸心外科,重庆 400038);房殿春(第三军医大学附属西南医院胸心外科,重庆 400038)

    关键词:食管肿瘤;食管癌;抑癌基因;杂合缺失

    第三军医大学学报000712 提 要: 目的 研究APC/MCC基因杂合性缺失(LOH)与食管癌发生发展的关系。方法 应用多聚酶链反应技术及限制性片段长度多态现象对46例食管癌APC和MCC基因的LOH进行了分析。结果 食管癌APC和MCC基因LOH阳性表达分别为29.0%(9/31)和33.3%(8/24)。结论 APC、MCC基因的LOH是食管癌的常见改变,可能参与了食管癌的发生。

, 百拇医药     中图法分类号: R735.1;R394.3 文献标识码: A

    文章编号:1000-5404(2000)07-0653-03

    Loss of heterozygosity at APC and MCC genetic loci in esophageal carcinoma

    WANG Ming-rong, WANG Hai-dong, XIONG Gang, FANG Dian-chun

    (Department of Cardiovascular and Thoracic Surgery, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)

    Abstract: Objective To study the relationship between the loss of heterozygosity (LOH) at APC and MCC genetic loci and the incidence and development of esophageal carcinoma. Methods LOH at APC and MCC genetic loci in 46 specimens resected from esophageal neoplasm was studied with polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragment length polymorphism (RFLP). Results LOH was 29.0% and 33.3% at APC and MCC genetic loci, respectively. Significant correlation was found between LOH at genetic loci and clinical parameters (P>0.05). Conclusion This study suggests that LOH at APC and MCC genes is the common genetic alteration in esophageal carcinoma and may participate in the genesis of esophageal carcinoma.
, 百拇医药
    Key words: neoplasma; esophageal carcinoma; suppressor gene; loss of heterozygosity

    研究发现,特定染色体区域的丢失在食管癌发生发展过程中起重要作用,染色体5q即是常见的丢失区域[1,2]。现已发现,在染色体5q21区域毗邻存在2个抑癌基因,即腺瘤性息肉病基因(APC基因)[3]和结肠癌突变基因(MCC基因)[4]。有关食管癌APC和MCC基因杂合缺失(Loss of heterozygosity,LOH)的研究国外已见报道,国内却鲜见报道。为探讨这些基因改变和食管癌发生发展的关系,我们采用聚合酶链反应技术(PCR),并配合限制性片段长度多态现象(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析,对食管癌组织APC、MCC基因的杂合缺失进行研究。
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    1 材料与方法

    1.1 标本收集和DNA提取 46例食管癌为我院1995年6月至1997年6月手术切除标本。手术切下肿瘤后立即收集癌组织和手术切缘处的正常粘膜组织,剔除出血、坏死部分,-80℃冻存备用。癌组织均经冰冻切片染色,镜检证实所测的癌组织癌细胞在50%以上,正常组织证实无癌细胞。采用蛋白酶K消化、酚/氯仿提取法抽提癌组织及正常组织DNA,用TE液稀释,于紫外分光光度计上测定其波长260 nm和280 nm处吸光度,计算DNA的浓度和纯度。

    1.2 引物设计

    根据文献[2],针对APC和MCC基因合成了2对引物(引物由中国科学院上海细胞生物研究所合成),见表1。

    表1 食管癌组织杂合缺失测定中使用的引物

    Tab 1 Primer for testing heterozygosity loss ofesophageal carcinoma Testing loci
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    Enzyme

    Amplified segment

    (bp)

    Sequence of primer

    11th exon of APC

    RsaI

    133/85+48

    5-GGACTACAGGCCATTGCAGAA-3

    5-GGCTACATCTCCAAAAGTCAA-3

    10th exon of MCC

, http://www.100md.com     93/79

    5-TACGAATCCAATGCCACA-3

    5-CTGAAGTAGCTCCAAACA-3

    1.3 PCR扩增 PCR反应总体积20 μl,其中模板DNA 0.5 μg,Tris-HCl 10 mmol/L,KCl 50 mmol/L,MgCl 1.5 mmol/L,dATP、dCTP、dGTP各0.2 mmol/L,上游及下游引物各 20 pmol,Tap DNA多聚酶1.5 μl(华美生物工程公司)。在PCR扩增仪上(Perkin Elmer Cetus 2400型)操作。反应条件:95 ℃变性 5 min后,94 ℃40 s,52或56 ℃ 40 s,72 ℃延伸60 s,循环35次,最后在72 ℃继续延伸 10 min。

    1.4 RFLP分析
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    APC第11外显子扩增产物用内切酶Rsal16U酶切12h,MCC扩增产物无需酶切,直接在8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,溴乙锭染色,紫外光下观察电泳分离带并照像。

    1.5 分析方法 正常组织DNA进行PCR扩增,APC第11外显子酶切和电泳分离后仅出现133bp条带为纯合子(非信息个体),若出现133、85和48bp条带为杂合子(信息个体)。MCC第10外显子直接电泳分离后只出现93bp条带者为纯合子,出现93bp和79bp两条带者为杂合子。对信息个体癌组织DNA以同样的引物进行PCR-RFLP分析,比较同一病人癌组织及正常组织DNA条带及量的差异,就可以推算出是否存在LOH。

    2 结果

    2.1 食管癌组织APC和MCC基因的LOH 46例食管癌中,APC基因属信息个体者31例,检出LOH9例,占29.0%,见图1;MCC基因属信息个体者24例,检出LOH8例,占33.3%,见图2。将APC/MCC综合分析,属于信息个体者37例,检出LOH16例,占43.25。
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    2.2 LOH与临床病理参数的关系 根据食管癌组织学分类、肿瘤大小、有无浆膜浸润及淋巴结转移的不同类型进行分组,各组APC和MCC基因LOH情况见表2。经统计学处理,APC和MCC基因LOH阳性表达在各组间差异均不显著(P>0.05)。

    图1 食管癌组织APC基因的杂合缺失分析

    N:正常组织;T:肿瘤组织

    Fig 1 Analysis of APC heterozygosity loss of the esophageal carcinoma

    N:Normal tissue; T: Cancerous tissue
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    图2 食管癌组织MCC基因的杂合缺失分析

    N:正常组织;T:肿瘤组织;2、3:杂合缺失

    Fig 2 Analysis of MCC heterozygosity loss of

    the esophageal carcinoma

    N:Normal tissue; T: Cancerous tissue; 2、3: Heterozygosity loss

    表2 APC和MCC基因的杂合缺失与临床病理参数的关系

    Tab 2 Relationship between clinical pathological parameter and the heterozygosity loss of APC and MCC gene Clinical pathological parameter
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    LOH/case

    APC

    MCC

    Histological type

    Squamous cell carcinoma

    8/26

    6/19

    Adenocarcinoma

    1/5

    2/5

    Size of carcinoma

    <3 cm
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    5/17

    5/17

    >3 cm

    4/14

    3/7

    Penetrating muscle layer

    Not penetrated

    6/19

    5/15

    Penetrated

    3/12

    3/9
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    Lymph node metastasis

    No metastasis

    4/12

    4/10

    Metastasis

    5/19

    5/14

    3 讨论

    食管癌发生的分子机制颇为复杂,涉及到多种癌基因的扩增与高表达,抑癌基因的突变和缺失及微卫星DNA不稳定性[1]。国外文献[1,2]报道食管癌APC和MCC基因有较高的LOH阳性表达,APC基因LOH阳性表达为38%~66%,MCC为63%。国内研究也发现,在人原发性食管癌中有一些标本存在APC和MCC的缺失和突变[5]。本研究对APC和MCC的LOH进行检测,APC和MCC基因的LOH阳性表达分别为29%和33.35%。若将APC/MCC综合分析,其LOH阳性表达为43.2%,说明APC/MCC基因LOH是食管癌的常见改变,可能参与了食管癌的发生和发展。APC和MCC基因均定位于染色体5q21,一般认为APC基因只有当一等位基因拷贝的LOH和另一拷贝的突充同时存在时才能使APC基因失活[6]。尽管多数食管癌存在APC基因LOH,但APC基因突变却很罕见,因此有作者认为APC基因LOH并不是食管癌发生的主要原因[7]。晚近Ogasawara等[1]检测食管癌组织染色体5q二核苷酸重复序列(微卫星)位点,结果发现多数食管癌存在5q部分或完全丢失,与APC基因位点不同,最常见的异变区域定位于5q31.1,提示此部位存在一食管癌的候选抑癌基因。因此,APC和MCC在食管癌发生发展中的确切作用尚需进一步研究。
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    多数作者认为,APC和MCC基因LOH是胃肠道肿瘤的早期改变,可能与肿瘤发生有关[8]。本文对APC和MCC基因LOH与临床病理参数的关系进行分析,并未发现以上基因LOH与食管癌组织学类型、肿瘤大小、浸润深度和淋巴结转移有显著相关关系。

    癌是一种基因性疾病,这已被人们普遍接受。本研究表明,APC和MCC基因的LOH是食管癌发生、发展过程中较常见改变。通过对癌基因和抑癌基因的检测,不仅有助于我们从分子水平认识食管癌的发病机制,同时也可为食管癌的一级病因学预防提供分子生物学证据,有重要的理论和实践意义。

    作者简介:王明荣(1950-),男,江苏省南通市人,主任医师,教授,主要从事体外循环损伤、肺癌血管生长抑制治疗方面的研究,发表论文8篇。电话:(023)68754638

    参考文献:

    [1] Ogasawara S, Tamura G, Maesawa G,et al. Common deleted region on the long arm of chromosome 5 in esophageal carcinoma[J]. Gastroenterology, 1996,110(1):52-57.
, http://www.100md.com
    [2] Huang Y, Boynton R F, Blunt P L, et al. Loss of heterozygosity involves multiple tumor suppressor genes in human esophageal cancer[J]. Cancer Res, 1992,52(47):6 525-6 530.

    [3] Greenwald B D, Harpaz N, Yin J, et al. Loss of heterozygosity affecting the p53, Rb and APC/MCC tumor suppressor gene loci in dysplastic and cancerous ulcerative colitis[J]. Cancer Res,1992,52(47):741-745.

    [4] Ashton-Rickardt P G, Wyllie A H, Bird C C, et al. MCC, candidate familial polyposis gene in 5q21, show frequent allele loss in colorectal and lung cancer[J]. Oncogene, 1991,6(10):1 881-1 886.
, 百拇医药
    [5] 李华川,陆士新.人原发食管癌组织中多种抑癌基因的研究[J].中华医学杂志,1994,74(11):489-491.

    [6] Aoki T, Mon T, Ciqun D, et al. Allelotype study of esophageal carcinoma[J].Genes Chromosome Cancer, 1994,10(2):177-182.

    [7] Powell S M, Papadopoulos N, Kinaler K W, et al. APC gene mutations in the mutation cluster region are rare in esophageal cancer[J]. Gastroenterology, 1994,107(6):1 759-1 763.

    [8] Tamura G, Macsawa C, Suzuki Y, et al. Primary gastric car-cinoma cell frequently lose heterozygosity at the genetic loci[J]. Jpn Cancer Res, 1993,84(7):1 015-1 021.

    收稿日期:1999-09-22;修回日期:2000-03-19, http://www.100md.com