三裂叶野葛茎段和叶柄培养成再生植株
作者：施和平
单位：华南师范大学生物系 广州 510631
关键词：三裂叶野葛；植株再生；愈伤组织
中草药000738摘 要 三裂叶野葛的叶柄和茎段外植体在含有6-BA 1.0 mg/L 和 N AA 0.1 mg/L 的 MS 培养基上产生愈伤组织，愈伤诱导率分别为 100% 和 94%，并进一步 分化出芽，芽再生率分别为 100% 和 33.3%。而在添加 6-BA 3.0 mg/L 和 NAA 1.0 mg /L 的 MS 培养基中叶柄和茎段外植体的愈伤诱导率分别为 100% 和 64.3%， 芽再生率分 别为 57.1% 和 21.4%。芽长成嫩枝后转移至添加 0.1 mg/L NAA 的 MS 培养基后分化出 根，形成小植株。再生植株的移栽成活率达90%。
Plantlet Regeneration from the Petiole and Stem of Pue raria phaseoloides
, 百拇医药
Shi Heping
(Department of Biology, South China Normal University Guangzhou 510631)
Abstract The callus induction rates on MS medium containing 6 -BA 1.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L were 100% for petiole explant and 94% for stem expl ant. Callus could differentiate buds on the same medium, shoot regeneration rate s were 100% and 33.3% respectively. While cultured in the medium supplemented w ith 6-BA 3.0 mg/L and NAA 1.0 mg/L, the callus induction rates were 100% and 64 .3% respectively, and the shoot regeneration rates were 57.1% for petiole expla n t and 21.4% for stems. When the shoots were transferred onto MS medium containin g 0.1 mg/L NAA, they differentiated into roots and formed regenerated plants. Th e survival rate was 90%.
, http://www.100md.com
Key words Pueraria phaseoloides (Roxb.) Benth. plant let regeneration callus
三裂叶野葛Pueraria phaseoloides (Roxb.)Benth是豆科 葛属的药用植 物，其块根为解暑退热、生津解渴的常用生药。药理实验表明，其块根有效成分葛根素等异 黄酮类化合物具有抗氧化、抗心律失常、增强机体免疫力和降血糖等多种功能[1～3] 。目前野葛的生药来源主要是靠挖掘野生资源，不仅不能满足医药工业的需要，还会破坏 生态环境，造成水土流失。国外曾利用野葛愈伤组织来生产葛根素等异黄酮类化合物，但未 能获得再生植株[4]。我们曾成功地从三裂叶野葛子叶得到了再生植株[5] 。本文报道利用三裂叶野葛无菌苗茎段和叶柄为外植体诱导形成愈伤组织，并得到再生植 株的实验结果。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 植物材料和培养基：三裂叶野葛的新鲜种子萌发的无菌苗，在 MS 培养基上继代培养 1月后，分别取其茎段和叶柄进行培养。所用的培养基配方为： M1：MS + 6-BA 1.0 mg/L (单位下同) + NAA 0.1; M2: MS + 6-BA 3.0 + NAA 1.0,M3:MS+ KT 0.2 + 2,4-D 1 .0 +6-BA 0.5. M4: MS + NAA 0.1. 上述培养基均加 3% 蔗糖、0.8%琼脂，pH 5.8～6.0 ，在 2 000 lx 光强、每天 12 h 光照，(25±1) ℃ 培养。
1.2 根的诱导及再生植株的移栽：将愈伤组织上再生的芽切下置于 M4 培养基上诱导生根 。当再生植株的根长至 3～4 cm、株高 8～12 cm 时，将锥形瓶移至同外界气温一致的室内 靠窗处接受自然光，打开封口塑料薄膜，2 d后取出小苗、小心洗去根上的培养基，移栽至 盛有蛭石-椰糖-菜园土 (1∶1∶2) 的塑料盆中，用保鲜膜袋分别覆盖保温保湿 3 d 后置 于温室中盆栽。
, 百拇医药
2 结果分析与讨论
2.1 愈伤组织的诱导和芽的再生：三裂叶野葛叶柄和茎段外植体在 M1 培养基上培养一周 后开始形成浅绿色或浅黄绿色或灰白色、表面被白色短绒毛的致密愈伤组织(图1-1，2)， 愈伤诱导率分别为100%和94%，所产生的愈伤组织在 M1 培养基上继代2 周后分散成黄绿色 的或灰白色的圆球形或瘤状愈伤组织，并逐渐分化出芽、芽簇生(图1-3，4)：三裂叶野葛 叶 柄和茎段愈伤组织的芽再生频率分别为 100% 和 33.3%。并观察到贴近培养基的愈伤组织 呈暗褐色，可分泌黄褐色或黄色油状分泌物，不产生芽的分化。当三裂叶野葛叶柄和茎段外 植体在 M2 培养基上培养时，虽然可诱导出被白色短绒毛的黄绿色或灰色致密的愈伤组织， 但它们的愈伤组织分化芽的频率明显降低，分别为 57.1% 和 21.4% (表1)；平均每块愈 伤组织上产生芽的数目分别为 7 条和 3 条(图1-5)。
, 百拇医药
1-叶柄外植体产生的愈伤组织 2-茎段外植体产生的愈伤组织 3-叶柄愈伤组织在 MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L 培养基上产生的不定芽 4-茎段愈伤组织在 MS + 6- BA 1.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L 培养基上产生的不定芽 5-叶柄愈伤组织在 MS + 6-BA 3. 0 mg/L + NAA 1.0 mg/L 培养基上产生的不定芽 6-三裂叶野葛再生植株
图1 三裂叶野葛茎段和叶柄培养成再生植株
表1 激素组合对茎段和叶柄外植体愈伤组织
产生及芽分化的影响 外植体
培养基
愈伤诱导率
(%)
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芽再生频率
(%)
每块愈伤组织
产生的平 均
芽数
叶柄
M1
100
100
15
M2
100
57.1
, 百拇医药
8
茎段
M1
94
33.3
7
M2
64.3
21.4
3
三裂叶野葛叶柄和茎段外植体在 M3 培养基上培养两周后，在叶柄和茎段两端均形成浅绿色的 致密愈伤组织，其贴近培养基表面的愈伤组织呈褐色，不断分泌黄色或褐色的分泌物， 35 d 后从愈伤组织上长出白色不定根。如果把产生的愈伤组织在 M3 培养基上进行反复继代( 隔周继代 1 次)时，愈伤组织会增殖，不产生不定根，但始终未见幼芽的分化，愈伤组织逐 渐褐化变黑，死亡。
, 百拇医药
2.2 根的诱导和试管苗的移栽：将三裂叶野葛叶柄和茎段愈伤组织产生的幼芽切下，接至 添加 0.1 mg/L NAA 的 M4 培养基上，10 d 后长出根，形成再生植株，生根率为100%，每 株有6～15 条根(图1-6)。根系发达，根的生长很快，15 d后长达 8～10 cm。三裂叶野葛再生植株经锻炼后，在移栽基质中的移栽成活率达 90 % 以上。
有关三裂叶野葛叶柄和茎段的组织培养和植株再生的研究目前尚未见正式报道。我们的结果 表明，三裂叶野葛叶柄的组织培养和植株再生效果比其茎段更好。比较野葛不同外植体再生 植株的效果，我们认为野葛组培快繁材料以选取叶柄最合适。本文结果为我们利用细胞工程 技术来生产葛根的药用有效成分提供了基础材料。广州市科委资助项目(1999-J-00701)
施和平 男，1990年毕业于中山大学，获理学硕士学位；1996年毕业于华南师范大学，获理 学博士学位。现任华南师范大学生物系植物生理研究室、广东省植物发育生物工程重点实验 室副研究员。主要从事发根农杆菌对植物遗传转化机理和应用以及植物生长发育调控方面的 科研和教学工作。现承担国家自然科学基金项目、广东省科技攻关项目和省自然科学基金项 目等计4 项。并在《植物学报》和《云南植物研究》等核心期刊上发表论文10 多篇。
, 百拇医药
参考文献
1，郭建平，周 全，孙其荣.中草药，1995，27(3)：163
2，石昌顺.中草药，1994，25(4)：496
3，范礼理，赵德化，赵敏崎，等.药学学报，1985，20(9)：647
4，Takaya K, Itokawa H. Chem Pharm Bull, 1982, 30(4):1496
5，施和平，潘瑞炽.植物生理学通讯，1998， 34(6)：444
(1999-05-13收稿), 百拇医药
单位：华南师范大学生物系 广州 510631
关键词：三裂叶野葛；植株再生；愈伤组织
中草药000738摘 要 三裂叶野葛的叶柄和茎段外植体在含有6-BA 1.0 mg/L 和 N AA 0.1 mg/L 的 MS 培养基上产生愈伤组织，愈伤诱导率分别为 100% 和 94%，并进一步 分化出芽，芽再生率分别为 100% 和 33.3%。而在添加 6-BA 3.0 mg/L 和 NAA 1.0 mg /L 的 MS 培养基中叶柄和茎段外植体的愈伤诱导率分别为 100% 和 64.3%， 芽再生率分 别为 57.1% 和 21.4%。芽长成嫩枝后转移至添加 0.1 mg/L NAA 的 MS 培养基后分化出 根，形成小植株。再生植株的移栽成活率达90%。
Plantlet Regeneration from the Petiole and Stem of Pue raria phaseoloides
, 百拇医药
Shi Heping
(Department of Biology, South China Normal University Guangzhou 510631)
Abstract The callus induction rates on MS medium containing 6 -BA 1.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L were 100% for petiole explant and 94% for stem expl ant. Callus could differentiate buds on the same medium, shoot regeneration rate s were 100% and 33.3% respectively. While cultured in the medium supplemented w ith 6-BA 3.0 mg/L and NAA 1.0 mg/L, the callus induction rates were 100% and 64 .3% respectively, and the shoot regeneration rates were 57.1% for petiole expla n t and 21.4% for stems. When the shoots were transferred onto MS medium containin g 0.1 mg/L NAA, they differentiated into roots and formed regenerated plants. Th e survival rate was 90%.
, http://www.100md.com
Key words Pueraria phaseoloides (Roxb.) Benth. plant let regeneration callus
三裂叶野葛Pueraria phaseoloides (Roxb.)Benth是豆科 葛属的药用植 物，其块根为解暑退热、生津解渴的常用生药。药理实验表明，其块根有效成分葛根素等异 黄酮类化合物具有抗氧化、抗心律失常、增强机体免疫力和降血糖等多种功能[1～3] 。目前野葛的生药来源主要是靠挖掘野生资源，不仅不能满足医药工业的需要，还会破坏 生态环境，造成水土流失。国外曾利用野葛愈伤组织来生产葛根素等异黄酮类化合物，但未 能获得再生植株[4]。我们曾成功地从三裂叶野葛子叶得到了再生植株[5] 。本文报道利用三裂叶野葛无菌苗茎段和叶柄为外植体诱导形成愈伤组织，并得到再生植 株的实验结果。
1 材料和方法
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1.1 植物材料和培养基：三裂叶野葛的新鲜种子萌发的无菌苗，在 MS 培养基上继代培养 1月后，分别取其茎段和叶柄进行培养。所用的培养基配方为： M1：MS + 6-BA 1.0 mg/L (单位下同) + NAA 0.1; M2: MS + 6-BA 3.0 + NAA 1.0,M3:MS+ KT 0.2 + 2,4-D 1 .0 +6-BA 0.5. M4: MS + NAA 0.1. 上述培养基均加 3% 蔗糖、0.8%琼脂，pH 5.8～6.0 ，在 2 000 lx 光强、每天 12 h 光照，(25±1) ℃ 培养。
1.2 根的诱导及再生植株的移栽：将愈伤组织上再生的芽切下置于 M4 培养基上诱导生根 。当再生植株的根长至 3～4 cm、株高 8～12 cm 时，将锥形瓶移至同外界气温一致的室内 靠窗处接受自然光，打开封口塑料薄膜，2 d后取出小苗、小心洗去根上的培养基，移栽至 盛有蛭石-椰糖-菜园土 (1∶1∶2) 的塑料盆中，用保鲜膜袋分别覆盖保温保湿 3 d 后置 于温室中盆栽。
, 百拇医药
2 结果分析与讨论
2.1 愈伤组织的诱导和芽的再生：三裂叶野葛叶柄和茎段外植体在 M1 培养基上培养一周 后开始形成浅绿色或浅黄绿色或灰白色、表面被白色短绒毛的致密愈伤组织(图1-1，2)， 愈伤诱导率分别为100%和94%，所产生的愈伤组织在 M1 培养基上继代2 周后分散成黄绿色 的或灰白色的圆球形或瘤状愈伤组织，并逐渐分化出芽、芽簇生(图1-3，4)：三裂叶野葛 叶 柄和茎段愈伤组织的芽再生频率分别为 100% 和 33.3%。并观察到贴近培养基的愈伤组织 呈暗褐色，可分泌黄褐色或黄色油状分泌物，不产生芽的分化。当三裂叶野葛叶柄和茎段外 植体在 M2 培养基上培养时，虽然可诱导出被白色短绒毛的黄绿色或灰色致密的愈伤组织， 但它们的愈伤组织分化芽的频率明显降低，分别为 57.1% 和 21.4% (表1)；平均每块愈 伤组织上产生芽的数目分别为 7 条和 3 条(图1-5)。
, 百拇医药
1-叶柄外植体产生的愈伤组织 2-茎段外植体产生的愈伤组织 3-叶柄愈伤组织在 MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L 培养基上产生的不定芽 4-茎段愈伤组织在 MS + 6- BA 1.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L 培养基上产生的不定芽 5-叶柄愈伤组织在 MS + 6-BA 3. 0 mg/L + NAA 1.0 mg/L 培养基上产生的不定芽 6-三裂叶野葛再生植株
图1 三裂叶野葛茎段和叶柄培养成再生植株
表1 激素组合对茎段和叶柄外植体愈伤组织
产生及芽分化的影响 外植体
培养基
愈伤诱导率
(%)
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芽再生频率
(%)
每块愈伤组织
产生的平 均
芽数
叶柄
M1
100
100
15
M2
100
57.1
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8
茎段
M1
94
33.3
7
M2
64.3
21.4
3
三裂叶野葛叶柄和茎段外植体在 M3 培养基上培养两周后，在叶柄和茎段两端均形成浅绿色的 致密愈伤组织，其贴近培养基表面的愈伤组织呈褐色，不断分泌黄色或褐色的分泌物， 35 d 后从愈伤组织上长出白色不定根。如果把产生的愈伤组织在 M3 培养基上进行反复继代( 隔周继代 1 次)时，愈伤组织会增殖，不产生不定根，但始终未见幼芽的分化，愈伤组织逐 渐褐化变黑，死亡。
, 百拇医药
2.2 根的诱导和试管苗的移栽：将三裂叶野葛叶柄和茎段愈伤组织产生的幼芽切下，接至 添加 0.1 mg/L NAA 的 M4 培养基上，10 d 后长出根，形成再生植株，生根率为100%，每 株有6～15 条根(图1-6)。根系发达，根的生长很快，15 d后长达 8～10 cm。三裂叶野葛再生植株经锻炼后，在移栽基质中的移栽成活率达 90 % 以上。
有关三裂叶野葛叶柄和茎段的组织培养和植株再生的研究目前尚未见正式报道。我们的结果 表明，三裂叶野葛叶柄的组织培养和植株再生效果比其茎段更好。比较野葛不同外植体再生 植株的效果，我们认为野葛组培快繁材料以选取叶柄最合适。本文结果为我们利用细胞工程 技术来生产葛根的药用有效成分提供了基础材料。广州市科委资助项目(1999-J-00701)
施和平 男，1990年毕业于中山大学，获理学硕士学位；1996年毕业于华南师范大学，获理 学博士学位。现任华南师范大学生物系植物生理研究室、广东省植物发育生物工程重点实验 室副研究员。主要从事发根农杆菌对植物遗传转化机理和应用以及植物生长发育调控方面的 科研和教学工作。现承担国家自然科学基金项目、广东省科技攻关项目和省自然科学基金项 目等计4 项。并在《植物学报》和《云南植物研究》等核心期刊上发表论文10 多篇。
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参考文献
1，郭建平，周 全，孙其荣.中草药，1995，27(3)：163
2，石昌顺.中草药，1994，25(4)：496
3，范礼理，赵德化，赵敏崎，等.药学学报，1985，20(9)：647
4，Takaya K, Itokawa H. Chem Pharm Bull, 1982, 30(4):1496
5，施和平，潘瑞炽.植物生理学通讯，1998， 34(6)：444
(1999-05-13收稿), 百拇医药