系列抗心肌多肽自身抗体对扩张型心肌病的诊断价值
作者：苑海涛 廖玉华 王敏 董继华 曹林生 汪朝辉 王金萍 卢银平
单位：同济医科大学心血管病研究所 同济医科大学附属协和医院心内科 武汉，430022
关键词：心肌病，充血性；抗心肌多肽自身抗体
临床心血管病杂志000711 摘要 目的：探讨抗人工合成多肽自身抗体在扩张型心肌病(DCM)诊断中的价值。方法：根据计算机预测心肌ADP/ATP载体(ANT)、β1受体、M2受体和肌球蛋白重链(MHC)抗原决定簇的氨基酸序列并合成多肽片段，以此片段作为抗原，同时用天然抗原对比，以酶联免疫吸附方法检测48例DCM患者(DCM组)和48例健康献血员(对照组)血清中抗心肌多肽自身抗体。结果：DCM组中抗ANT抗体、抗β1受体抗体、抗M2受体抗体和抗MHC抗体阳性分别有31、26、20和23例，与对照组比较有显著性差异(P<0.005)，且与天然心肌抗原检测结果高度一致(P<0.01)。结论：人工合成多肽可代替天然心肌抗原用于检测抗心肌自身抗体，抗心肌多肽抗体检测可以作为DCM免疫学诊断方法。
, 百拇医药
Diagnostic value of serial autoantibodies against cardiac
peptides in dilated cardiomyopathy
YUAN Hai-tao LIAO Yu-hua WANG Min DONG Ji-hua CAO Lin-sheng
WANG Zhao-hui WANG Jin-ping LU Yin-ping
(Institute of Cardiology,Tongji Medical University,Wuhan 430022)
Abstract Objective:To investigate the diagnostic value of autoantibodies against cardiac peptides in dilated cardiomyopathy (DCM) by using antigens of synthetic peptides in the examination.Method:According to computer prediction,we synthesized peptides whose amino acid sequences were derived from determinants of cardiac antigens including the adenine nucleotide translocator (ANT),β1-adrenoceptor,M2 muscarinic receptor and myosin heavy chain (MHC).Taking this synthetic peptides as antigens,autoantibodies were examined by an ELISA method in 48 patients with DCM and 48 healthy donors,and compared the results by using natural cardiac antigens.Result:Of 48 sera from patients with DCM,31(64.6%) bound to the peptides derived from ANT,23 (47.9%) reacted with the sequence from myosin heavy chain, 26 (54.2%) and 20 (41.7%) were positive in reacting with peptides from β1-adrenoceptor and M1 muscarinic receptor respectively.These results showed significant difference between these two groups.So the antigenicity of the selected determinants was confirmed,moreover,the results were approximatelly consistent with that of natural antigen.Conclusion:Synthetic peptides derived from determinants of cardiac antigens can substitute for natural antigens to screen autoantibodies.The examination of autoantibodies against cardiac peptides can be taken as the method of immunological diagnosis of DCM.
, 百拇医药
Key words Cardiomyopathy,congestive Autoantibodies against cardiac peptides
近年来的研究证实，扩张型心肌病(DCM)患者血清中存在抗ADP/ATP载体(ANT)抗体、抗β1肾上腺素能受体抗体〔1〕、抗M2胆碱能受体抗体〔2〕和抗肌球蛋白重链(MHC)抗体〔3〕。我们从上述几种心肌自身抗原的氨基酸序列中，选择其抗原决定簇片段，合成多肽作为抗原，以酶联免疫吸附(ELISA)法检测DCM患者血清中的抗心肌自身抗体，以探讨抗心肌多肽自身抗体在DCM诊断中的价值。
1 对象与方法
DCM组：48例，男26例，女22例，平均年龄(42.3±18.2)岁；临床诊断参照1995年WHO/ISFC心肌病的定义和分类〔4〕。对照组：健康献血员48例，男32例，女16例，平均年龄(37.8±17.4)岁。
, 百拇医药
根据计算机预测心肌ANT、β1受体、M2受体和MHC抗原决定簇的氨基酸序列，在多肽合成仪(PSSM-8型SHIMADZU公司)上以固相合成法合成多肽，并以高压液相色谱法对产物的纯度进行鉴定，其纯度均>95%。
天然抗原制备按本室建立的方法制备猪心肌肌球蛋白〔5〕。
抗心肌抗体检测按ELISA法。以碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释多肽或猪心肌肌球蛋白(终浓度50 mg/L)，包被96孔板，每孔100 μl，置4℃过夜。倾去包被液，用洗涤液(pH 7.4，0.01 mol/LPBS-Tween 20)加满各孔，置3 min，洗涤3次。然后加入待检血清(1∶100)，37℃ 2 h温浴；洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体(1∶2 000，同济医科大学附属协和医院病毒室产品)，37℃ 1 h温浴；洗涤后加入过氧化氢和TMB反应15 min后，以2 mol/L硫酸终止反应。于酶标仪450 nm处读数并记录OD值，以大于对照组OD值的均数与2.1倍标准差之和为阳性。
, 百拇医药
数据采用χ2检验，相关分析，t检验。
2 结果
2.1 抗心肌多肽自身抗体的检测结果
DCM及对照组几种抗心肌多肽自身抗体检测的结果和DCM患者4种抗心肌多肽抗体敏感性和特异性见表1。在DCM组抗心肌多肽抗体阳性的40例中，4种抗体均阳性8例(20.0%)，3种抗体阳性13例(32.5%)，2种抗体阳性10例(25.0%)，1种抗体阳性9例(22.5%)。
表1 DCM组及对照组抗心肌多肽自身抗体检测的分析 合成肽
抗心肌多肽自身抗体
阳性/例数(%)
DCM抗心肌多肽
, 百拇医药
自身抗体/%
对照组
DCM组
敏感性
特异性
ANT
4(8.3)
31(64.6)
64.6
91.7
β1
4(8.3)
26(54.2)
, 百拇医药
54.2
91.7
M2
3(6.3)
20(41.7)
41.7
93.7
MHC
2(4.2)
23(47.9)
47.9
95.8
, 百拇医药 与对照组比较均P<0.005
2.2 人工合成多肽与天然心肌抗原检测结果比较
应用天然心肌肌球蛋白作为抗原，检测48例DCM患者血清抗心肌肌球蛋白抗体，24例阳性，阳性率为50.0%。天然心肌抗原与人工合成多肽的检测结果比较，具有高度一致性(r=0.792，P<0.01)，见表2。
表2 天然心肌抗原与人工合成多肽的检测结果比较 例数 肌球蛋白
(天然)
肌球蛋白合成肽
合计
阳性
阴性
, 百拇医药
阳性
21
3
24
阴性
2
22
24
合计
23
25
48
3 讨论
近年来的研究证实，DCM的发生与持续性病毒感染引发的自身免疫反应有关，并且检测出具有疾病和器官特异性的抗心肌自身抗体〔6，7〕。90年代以来，我们就以天然心肌抗原检测患者血清中抗心肌抗体，对DCM进行免疫学诊断。由于天然心肌抗原不易获得，且难以长期保存，给临床应用和推广带来一定困难。本研究以合成肽作为抗原，检测出DCM患者血清中4种抗心肌多肽自身抗体，其敏感性41.7%～64.6%，特异性91.7%～95.8%。合成肽抗原与天然心肌抗原检测抗心肌自身抗体的结果具有高度一致性，合成肽基本上可以反映心肌抗原的主要抗原决定簇，可代替天然抗原用以检测DCM患者血清中抗心肌自身抗体。
, http://www.100md.com
本研究证实，DCM患者抗心肌抗体阳性共有40例，其中4种抗体均阳性8例(20.0%)，3种抗体阳性13例(32.5%)，2种抗体阳性10例(25.0%)，1种抗体阳性9例(22.5%)。针对不同心肌分子靶抗原的自身抗体具有不同的生物学活性，可通过不同的途径损害心肌细胞，如抗ANT抗体介导心肌细胞钙电流增加损害心肌细胞〔8〕，抗β1受体抗体通过增加心肌细胞浆游离钙浓度和钙超负荷导致心肌损伤〔9〕，抗肌球蛋白抗体诱导心肌免疫性炎症导致心肌损伤〔6〕，具有不同病理意义的自身抗体均可参与DCM的发病过程。Caforio〔10〕亦发现，抗心肌自身抗体是DCM的早期标志物，可在DCM患者表现出临床症状(如心功能不全、心脏扩大)之前而出现。因此开展系列抗心肌多肽抗体的检测，不仅有助于DCM早期的免疫学诊断，而且有助于指导DCM的临床干预。
参考文献
1，Limas C J,Goldenberg I F, Limas C. Effect of antireceptor antibodies in dilated cardiomyopathy on the cycling of cardic beta receptors. Am Heart J,1991,122:108～114
, 百拇医药
2，Fu L X,Magnusson Y,Bergh C H,et al.Localization of a functional autoimmune epitope on the muscarinic acetylcholine receptor-2 in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy. J Clin Invest,1993,91:1964～1968
3，Caforio A L,Grazzini M, Mann J M,et al.Identification of α-and β-cardiac myosin heavy chain isoforms as major autoantigens in dilated cardiomyopathy. Circulation,1992,85:1734～1742
4，Richardson P, McKenna W. Report of the 1995 WHO/ISFC task force on the definition and classification of cardiomyopathy. Circulation,1996,93:841～842
, 百拇医药
5，Wang Z H,Liao Y H, Dong J H, et al. Myosin-induced autoimmune myocarditis in BALB/c mice. J Tongji Med Univ,1999,19:112～114
6，廖玉华，涂源淑，李淑莉，等.扩张型心肌病抗心肌线粒体ADP/ATP载体自身抗体的研究.中华心血管病杂志，1994，22：43～45
7，刘颖，廖玉华，董继华，等.肠病毒感染及抗ADP/ATP载体抗体在病毒性心脏病发病中的意义.临床心血管病杂志，1999，15：106～109
8，程龙献，廖玉华，涂源淑，等.扩张型心肌病患者血清抗ADP/ATP载体抗体对心肌细胞胞浆游离钙浓度的影响.临床心血管病杂志，1995，11：335～337
9，Liao Y H,Cheng L X,Tu Y S,et al. Mechanism of anti-β-adrenoceptor antibody mediated myocardial damage in dilated cardiomyopathy. J Tongji Med Univ,1997,17:5～8
10，Caforio A L. Organ-specific cardiac autoantibodies in dilated cardiomyopathy——An update. Eur Heart J,1995,16:68～70
(收稿 1999-07-28), http://www.100md.com
单位：同济医科大学心血管病研究所 同济医科大学附属协和医院心内科 武汉，430022
关键词：心肌病，充血性；抗心肌多肽自身抗体
临床心血管病杂志000711 摘要 目的：探讨抗人工合成多肽自身抗体在扩张型心肌病(DCM)诊断中的价值。方法：根据计算机预测心肌ADP/ATP载体(ANT)、β1受体、M2受体和肌球蛋白重链(MHC)抗原决定簇的氨基酸序列并合成多肽片段，以此片段作为抗原，同时用天然抗原对比，以酶联免疫吸附方法检测48例DCM患者(DCM组)和48例健康献血员(对照组)血清中抗心肌多肽自身抗体。结果：DCM组中抗ANT抗体、抗β1受体抗体、抗M2受体抗体和抗MHC抗体阳性分别有31、26、20和23例，与对照组比较有显著性差异(P<0.005)，且与天然心肌抗原检测结果高度一致(P<0.01)。结论：人工合成多肽可代替天然心肌抗原用于检测抗心肌自身抗体，抗心肌多肽抗体检测可以作为DCM免疫学诊断方法。
, 百拇医药
Diagnostic value of serial autoantibodies against cardiac
peptides in dilated cardiomyopathy
YUAN Hai-tao LIAO Yu-hua WANG Min DONG Ji-hua CAO Lin-sheng
WANG Zhao-hui WANG Jin-ping LU Yin-ping
(Institute of Cardiology,Tongji Medical University,Wuhan 430022)
Abstract Objective:To investigate the diagnostic value of autoantibodies against cardiac peptides in dilated cardiomyopathy (DCM) by using antigens of synthetic peptides in the examination.Method:According to computer prediction,we synthesized peptides whose amino acid sequences were derived from determinants of cardiac antigens including the adenine nucleotide translocator (ANT),β1-adrenoceptor,M2 muscarinic receptor and myosin heavy chain (MHC).Taking this synthetic peptides as antigens,autoantibodies were examined by an ELISA method in 48 patients with DCM and 48 healthy donors,and compared the results by using natural cardiac antigens.Result:Of 48 sera from patients with DCM,31(64.6%) bound to the peptides derived from ANT,23 (47.9%) reacted with the sequence from myosin heavy chain, 26 (54.2%) and 20 (41.7%) were positive in reacting with peptides from β1-adrenoceptor and M1 muscarinic receptor respectively.These results showed significant difference between these two groups.So the antigenicity of the selected determinants was confirmed,moreover,the results were approximatelly consistent with that of natural antigen.Conclusion:Synthetic peptides derived from determinants of cardiac antigens can substitute for natural antigens to screen autoantibodies.The examination of autoantibodies against cardiac peptides can be taken as the method of immunological diagnosis of DCM.
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Key words Cardiomyopathy,congestive Autoantibodies against cardiac peptides
近年来的研究证实，扩张型心肌病(DCM)患者血清中存在抗ADP/ATP载体(ANT)抗体、抗β1肾上腺素能受体抗体〔1〕、抗M2胆碱能受体抗体〔2〕和抗肌球蛋白重链(MHC)抗体〔3〕。我们从上述几种心肌自身抗原的氨基酸序列中，选择其抗原决定簇片段，合成多肽作为抗原，以酶联免疫吸附(ELISA)法检测DCM患者血清中的抗心肌自身抗体，以探讨抗心肌多肽自身抗体在DCM诊断中的价值。
1 对象与方法
DCM组：48例，男26例，女22例，平均年龄(42.3±18.2)岁；临床诊断参照1995年WHO/ISFC心肌病的定义和分类〔4〕。对照组：健康献血员48例，男32例，女16例，平均年龄(37.8±17.4)岁。
, 百拇医药
根据计算机预测心肌ANT、β1受体、M2受体和MHC抗原决定簇的氨基酸序列，在多肽合成仪(PSSM-8型SHIMADZU公司)上以固相合成法合成多肽，并以高压液相色谱法对产物的纯度进行鉴定，其纯度均>95%。
天然抗原制备按本室建立的方法制备猪心肌肌球蛋白〔5〕。
抗心肌抗体检测按ELISA法。以碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释多肽或猪心肌肌球蛋白(终浓度50 mg/L)，包被96孔板，每孔100 μl，置4℃过夜。倾去包被液，用洗涤液(pH 7.4，0.01 mol/LPBS-Tween 20)加满各孔，置3 min，洗涤3次。然后加入待检血清(1∶100)，37℃ 2 h温浴；洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体(1∶2 000，同济医科大学附属协和医院病毒室产品)，37℃ 1 h温浴；洗涤后加入过氧化氢和TMB反应15 min后，以2 mol/L硫酸终止反应。于酶标仪450 nm处读数并记录OD值，以大于对照组OD值的均数与2.1倍标准差之和为阳性。
, 百拇医药
数据采用χ2检验，相关分析，t检验。
2 结果
2.1 抗心肌多肽自身抗体的检测结果
DCM及对照组几种抗心肌多肽自身抗体检测的结果和DCM患者4种抗心肌多肽抗体敏感性和特异性见表1。在DCM组抗心肌多肽抗体阳性的40例中，4种抗体均阳性8例(20.0%)，3种抗体阳性13例(32.5%)，2种抗体阳性10例(25.0%)，1种抗体阳性9例(22.5%)。
表1 DCM组及对照组抗心肌多肽自身抗体检测的分析 合成肽
抗心肌多肽自身抗体
阳性/例数(%)
DCM抗心肌多肽
, 百拇医药
自身抗体/%
对照组
DCM组
敏感性
特异性
ANT
4(8.3)
31(64.6)
64.6
91.7
β1
4(8.3)
26(54.2)
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54.2
91.7
M2
3(6.3)
20(41.7)
41.7
93.7
MHC
2(4.2)
23(47.9)
47.9
95.8
, 百拇医药 与对照组比较均P<0.005
2.2 人工合成多肽与天然心肌抗原检测结果比较
应用天然心肌肌球蛋白作为抗原，检测48例DCM患者血清抗心肌肌球蛋白抗体，24例阳性，阳性率为50.0%。天然心肌抗原与人工合成多肽的检测结果比较，具有高度一致性(r=0.792，P<0.01)，见表2。
表2 天然心肌抗原与人工合成多肽的检测结果比较 例数 肌球蛋白
(天然)
肌球蛋白合成肽
合计
阳性
阴性
, 百拇医药
阳性
21
3
24
阴性
2
22
24
合计
23
25
48
3 讨论
近年来的研究证实，DCM的发生与持续性病毒感染引发的自身免疫反应有关，并且检测出具有疾病和器官特异性的抗心肌自身抗体〔6，7〕。90年代以来，我们就以天然心肌抗原检测患者血清中抗心肌抗体，对DCM进行免疫学诊断。由于天然心肌抗原不易获得，且难以长期保存，给临床应用和推广带来一定困难。本研究以合成肽作为抗原，检测出DCM患者血清中4种抗心肌多肽自身抗体，其敏感性41.7%～64.6%，特异性91.7%～95.8%。合成肽抗原与天然心肌抗原检测抗心肌自身抗体的结果具有高度一致性，合成肽基本上可以反映心肌抗原的主要抗原决定簇，可代替天然抗原用以检测DCM患者血清中抗心肌自身抗体。
, http://www.100md.com
本研究证实，DCM患者抗心肌抗体阳性共有40例，其中4种抗体均阳性8例(20.0%)，3种抗体阳性13例(32.5%)，2种抗体阳性10例(25.0%)，1种抗体阳性9例(22.5%)。针对不同心肌分子靶抗原的自身抗体具有不同的生物学活性，可通过不同的途径损害心肌细胞，如抗ANT抗体介导心肌细胞钙电流增加损害心肌细胞〔8〕，抗β1受体抗体通过增加心肌细胞浆游离钙浓度和钙超负荷导致心肌损伤〔9〕，抗肌球蛋白抗体诱导心肌免疫性炎症导致心肌损伤〔6〕，具有不同病理意义的自身抗体均可参与DCM的发病过程。Caforio〔10〕亦发现，抗心肌自身抗体是DCM的早期标志物，可在DCM患者表现出临床症状(如心功能不全、心脏扩大)之前而出现。因此开展系列抗心肌多肽抗体的检测，不仅有助于DCM早期的免疫学诊断，而且有助于指导DCM的临床干预。
参考文献
1，Limas C J,Goldenberg I F, Limas C. Effect of antireceptor antibodies in dilated cardiomyopathy on the cycling of cardic beta receptors. Am Heart J,1991,122:108～114
, 百拇医药
2，Fu L X,Magnusson Y,Bergh C H,et al.Localization of a functional autoimmune epitope on the muscarinic acetylcholine receptor-2 in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy. J Clin Invest,1993,91:1964～1968
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4，Richardson P, McKenna W. Report of the 1995 WHO/ISFC task force on the definition and classification of cardiomyopathy. Circulation,1996,93:841～842
, 百拇医药
5，Wang Z H,Liao Y H, Dong J H, et al. Myosin-induced autoimmune myocarditis in BALB/c mice. J Tongji Med Univ,1999,19:112～114
6，廖玉华，涂源淑，李淑莉，等.扩张型心肌病抗心肌线粒体ADP/ATP载体自身抗体的研究.中华心血管病杂志，1994，22：43～45
7，刘颖，廖玉华，董继华，等.肠病毒感染及抗ADP/ATP载体抗体在病毒性心脏病发病中的意义.临床心血管病杂志，1999，15：106～109
8，程龙献，廖玉华，涂源淑，等.扩张型心肌病患者血清抗ADP/ATP载体抗体对心肌细胞胞浆游离钙浓度的影响.临床心血管病杂志，1995，11：335～337
9，Liao Y H,Cheng L X,Tu Y S,et al. Mechanism of anti-β-adrenoceptor antibody mediated myocardial damage in dilated cardiomyopathy. J Tongji Med Univ,1997,17:5～8
10，Caforio A L. Organ-specific cardiac autoantibodies in dilated cardiomyopathy——An update. Eur Heart J,1995,16:68～70
(收稿 1999-07-28), http://www.100md.com