APC抑癌基因在人类急性白血病中的杂合性缺失
作者：吕良敬 陈志哲 黄明清 张学敏
单位：吕良敬(福建省立医院 350001)；陈志哲 黄明清 张学敏(350004 福州，福建省血液病研究所)
关键词：
中华血液学杂志000715 APC基因是近年来发现的定位于人染色体5q21的抑癌基因，目前已被发现涉及多种肿瘤的形成。我们采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测了急性白血病患者48例的APC基因杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)，具体报道如下。
对象和方法
1 标本 病例组标本取自1995年1月～9月在福建省血液病研究所就诊患者的骨髓，其中未经治疗的初诊或复发的急性非淋巴细胞白血病(ANLL)36例,急性淋巴细胞白血病(ALL) 12例。经Ficoll-Urografin(华美公司)密度梯度离心后，取上层单个核细胞。重复离心以提高白血病细胞的纯度。作为对照的正常体细胞取自相应患者的口腔粘膜。正常对照15名，采样同前。
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2 DNA的抽提 采用酚/氯仿抽提法，获得的DNA标本经TE溶解后，测定其在260nm处的吸光度(A)，用TE调至100ng/μl, 4℃保存。
3 PCR-RFLP分析
3.1 PCR扩增APC基因外显子11: 引物设计按文献[1]，由福建省血液病研究所合成。APC25(上游引物序列): 5′-GGACTACAGGCCATTGCAGAA-3′; APC26(下游引物序列)：5′-GGCTACAATCTCCAAAAGTCAA-3′。扩增体系含10×缓冲液(华美公司)2.5μl，dNTP 50μmol/L(Promega公司),引物APC25和APC26各0.2μmol/L,模板DNA 100ng,用ddH2O补至25μl。95℃预变性5min后加入Taq DNA聚合酶(华美公司)0.5U，按94℃ 30s ，62℃ 40s，72℃ 30s，循环28次，72℃延伸5min(PE9600扩增仪)。用20g/L琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物。
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3.2 RsaⅠ酶解PCR产物：10 ×缓冲液(Promega公司)2μl,PCR产物5μl,RsaⅠ(Promega公司)0.5μl,用ddH2O补足20μl,37℃消化过夜。
3.3 120g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳：酶解产物20μl，加上样缓冲液4μl，混匀，以1×TBE 作为电泳缓冲液，150V室温下电泳1h。凝胶用0.5μg/ml溴乙锭染色40min，紫外光下观察并照相。底片上的电泳带用 Backman Appraise型密度扫描仪进行分析,并计算代表不同等位基因的电泳带密度比值R。
上述实验流程能检测白血病细胞纯度低至0.60的标本[1]。
结果
1 APC基因LOH的判断 根据RsaⅠ位点多态性等位基因的有无，杂合子显示出一条未切割带(132bp)和两条切割带(86bp及46bp)，而纯合子则显示为132bp的单一条带或仅有86bp及46bp两条切割带。杂合子能提供缺失信息,若未切割带(或切割带)消失或明显减弱，则说明等位基因缺失，LOH阳性。为进一步明确缺失与否，在体细胞R值正常时，如瘤细胞R值→∞或→0(即任一多态性片段密度扫描峰接近0)，则说明标本中绝大多数细胞均发生LOH；如果瘤细胞R值在正常范围外，但没有→∝或→0，那么可能白血病细胞标本纯度低或含多克隆成分，前者可参照APC-LOH模型判断。
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2 各组标本的LOH频率 48份ANLL和ALL标本经过重复密度梯度离心，镜下计算白血病细胞的比例，其白血病细胞的纯度均大于0.60。各组中能提供缺失信息的杂合子个体共有39例(22例ANLL、8例ALL和9名正常人)。正常组9名均未见LOH，而ANLL组中3例(图1，泳道1，5，7)出现明显等位基因缺失，1例(图1，泳道2)可能存在部分细胞的LOH。3例LOH明显阳性ANLL患者的FAB分型均为M2a，在6例具杂合性的M2a中占50%。1例M4a 患者R值为0.54，该标本纯度为0.82,此纯度条件根据APC-LOH模型[2]，R值应>0.67，因此判其为阳性，可能缺失仅来自某个瘤细胞克隆，其它克隆没有发生LOH。此外，在8例杂合子ALL个体中无一例LOH阳性。经由2×2列联表的Fisher精确检验法证实M2a组的LOH阳性率与正常组相比，差异有显著性(P=0.044),从而排除了“背景”缺失的可能性。M4a也有较高比例的APC等位基因缺失，但因例数较少，与正常组比较差异无显著性。另外，ALL组与正常组比较，差异无统计学意义。
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M:pBR322/HaeⅢ；1～8：患者自身正常组织对照；1′～8′：
相应患者白血病细胞。3，4，6为纯合子；
1，2，5，7，8为杂合子；1，2，5，7发生杂合性缺失
图1 ANLL患者APC基因的杂合性缺失分析结果
讨论
5号染色体长臂缺失是急性白血病(尤其ANLL)常见的核型异常之一,位于5q的APC基因为一个典型的抑癌基因，现已陆续在多种人类肿瘤中发现其结构异常，这些资料说明APC基因可能涉及广谱人类肿瘤的发生。我们在研究中发现APC抑癌基因缺失存在于部分ANLL患者中，尤其与具有粒系表型特征的AML(尤其M2a和M4a)有较高的相关性，在该类AML中，APC基因LOH的发生率至少为57%，而在ALL中则无一例发生LOH，表明APC基因的异常可能是发生于髓系恶性疾病中粒系异常克隆的一个独立分子事件。
参 考 文 献
1，吕良敬, 陈志哲,黄明清，等. 瘤细胞纯度梯度体系及APC-LOH模型的建立和意义.实验血液学杂志，1997，5:94-97.
(收稿日期：1999-11-25), 百拇医药
单位：吕良敬(福建省立医院 350001)；陈志哲 黄明清 张学敏(350004 福州，福建省血液病研究所)
关键词：
中华血液学杂志000715 APC基因是近年来发现的定位于人染色体5q21的抑癌基因，目前已被发现涉及多种肿瘤的形成。我们采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测了急性白血病患者48例的APC基因杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)，具体报道如下。
对象和方法
1 标本 病例组标本取自1995年1月～9月在福建省血液病研究所就诊患者的骨髓，其中未经治疗的初诊或复发的急性非淋巴细胞白血病(ANLL)36例,急性淋巴细胞白血病(ALL) 12例。经Ficoll-Urografin(华美公司)密度梯度离心后，取上层单个核细胞。重复离心以提高白血病细胞的纯度。作为对照的正常体细胞取自相应患者的口腔粘膜。正常对照15名，采样同前。
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2 DNA的抽提 采用酚/氯仿抽提法，获得的DNA标本经TE溶解后，测定其在260nm处的吸光度(A)，用TE调至100ng/μl, 4℃保存。
3 PCR-RFLP分析
3.1 PCR扩增APC基因外显子11: 引物设计按文献[1]，由福建省血液病研究所合成。APC25(上游引物序列): 5′-GGACTACAGGCCATTGCAGAA-3′; APC26(下游引物序列)：5′-GGCTACAATCTCCAAAAGTCAA-3′。扩增体系含10×缓冲液(华美公司)2.5μl，dNTP 50μmol/L(Promega公司),引物APC25和APC26各0.2μmol/L,模板DNA 100ng,用ddH2O补至25μl。95℃预变性5min后加入Taq DNA聚合酶(华美公司)0.5U，按94℃ 30s ，62℃ 40s，72℃ 30s，循环28次，72℃延伸5min(PE9600扩增仪)。用20g/L琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物。
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3.2 RsaⅠ酶解PCR产物：10 ×缓冲液(Promega公司)2μl,PCR产物5μl,RsaⅠ(Promega公司)0.5μl,用ddH2O补足20μl,37℃消化过夜。
3.3 120g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳：酶解产物20μl，加上样缓冲液4μl，混匀，以1×TBE 作为电泳缓冲液，150V室温下电泳1h。凝胶用0.5μg/ml溴乙锭染色40min，紫外光下观察并照相。底片上的电泳带用 Backman Appraise型密度扫描仪进行分析,并计算代表不同等位基因的电泳带密度比值R。
上述实验流程能检测白血病细胞纯度低至0.60的标本[1]。
结果
1 APC基因LOH的判断 根据RsaⅠ位点多态性等位基因的有无，杂合子显示出一条未切割带(132bp)和两条切割带(86bp及46bp)，而纯合子则显示为132bp的单一条带或仅有86bp及46bp两条切割带。杂合子能提供缺失信息,若未切割带(或切割带)消失或明显减弱，则说明等位基因缺失，LOH阳性。为进一步明确缺失与否，在体细胞R值正常时，如瘤细胞R值→∞或→0(即任一多态性片段密度扫描峰接近0)，则说明标本中绝大多数细胞均发生LOH；如果瘤细胞R值在正常范围外，但没有→∝或→0，那么可能白血病细胞标本纯度低或含多克隆成分，前者可参照APC-LOH模型判断。
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2 各组标本的LOH频率 48份ANLL和ALL标本经过重复密度梯度离心，镜下计算白血病细胞的比例，其白血病细胞的纯度均大于0.60。各组中能提供缺失信息的杂合子个体共有39例(22例ANLL、8例ALL和9名正常人)。正常组9名均未见LOH，而ANLL组中3例(图1，泳道1，5，7)出现明显等位基因缺失，1例(图1，泳道2)可能存在部分细胞的LOH。3例LOH明显阳性ANLL患者的FAB分型均为M2a，在6例具杂合性的M2a中占50%。1例M4a 患者R值为0.54，该标本纯度为0.82,此纯度条件根据APC-LOH模型[2]，R值应>0.67，因此判其为阳性，可能缺失仅来自某个瘤细胞克隆，其它克隆没有发生LOH。此外，在8例杂合子ALL个体中无一例LOH阳性。经由2×2列联表的Fisher精确检验法证实M2a组的LOH阳性率与正常组相比，差异有显著性(P=0.044),从而排除了“背景”缺失的可能性。M4a也有较高比例的APC等位基因缺失，但因例数较少，与正常组比较差异无显著性。另外，ALL组与正常组比较，差异无统计学意义。
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M:pBR322/HaeⅢ；1～8：患者自身正常组织对照；1′～8′：
相应患者白血病细胞。3，4，6为纯合子；
1，2，5，7，8为杂合子；1，2，5，7发生杂合性缺失
图1 ANLL患者APC基因的杂合性缺失分析结果
讨论
5号染色体长臂缺失是急性白血病(尤其ANLL)常见的核型异常之一,位于5q的APC基因为一个典型的抑癌基因，现已陆续在多种人类肿瘤中发现其结构异常，这些资料说明APC基因可能涉及广谱人类肿瘤的发生。我们在研究中发现APC抑癌基因缺失存在于部分ANLL患者中，尤其与具有粒系表型特征的AML(尤其M2a和M4a)有较高的相关性，在该类AML中，APC基因LOH的发生率至少为57%，而在ALL中则无一例发生LOH，表明APC基因的异常可能是发生于髓系恶性疾病中粒系异常克隆的一个独立分子事件。
参 考 文 献
1，吕良敬, 陈志哲,黄明清，等. 瘤细胞纯度梯度体系及APC-LOH模型的建立和意义.实验血液学杂志，1997，5:94-97.
(收稿日期：1999-11-25), 百拇医药