HCV慢性患者干扰素治疗前后血清HCV RNA水平的变化
作者：周国平 白敬羽 黄育清 王永忠 邓伟群 陈敏 童福易
单位：(江苏省常州市第三人民医院，江苏 常州 213001)
关键词：丙型肝炎病毒核糖核酸；聚合酶链反应—杂交；α-干扰素
宁夏医学杂志000707 【摘要】 目的 探讨丙型肝炎病毒(HCV)基因含量与干扰素疗效的关系。方法 采用“ELISA模式”化的HCV-RNA聚合酶链反应—杂交定量(PCR-Hyb)检测了19例慢性丙型肝炎患者α-干扰素治疗前后的血清中的HCV-RNA的水平。结果 3MU、6MU α-干扰素治疗，分别是11例、8例，完全反应者分别占72.5%、75%，部分及无效反应者分别占27.5%、25%(P>0.05)。两种剂量的完全反应者治疗前血清中HCV-RNA平均含量(4.3±1.6×104fg/μl)，显著低于部分反应(7.6±1.1×104fg/μl)及无反应者(7.5±0.1×104fg/μl，P<0.05)。自治疗开始第6个月，完全反应组中9例(9/14)血清中HCV RNA水平仍较高(大于1.6×102fg/μl)，在第12个月仍有3例(3/14)血清中含较高水平的HCVRNA(大于6.9×102fg/μl)。结论 两种剂量的干扰素治疗效果无显著性差异，治疗前血清中HCV RNA水平低者干扰素治疗效果较好。
, http://www.100md.com
【中图分类号】 R512.6+3 【文献标识码】 A
文章编号：1001-5949(2000)07-0397-03
The levels of Hepatitis C virus RNA of sera in patients with Chronic hepatitis C during alfa in terferon treatment.
ZHOU Guo-ping，BAI Jing-yu， HUANG Yu-qing
(Changzhou third people ′s Hosp.，Changzhou 213001，China)
【Abstract】 Objectives Discuss the relationship between the content of hepatitis C Virus RNA(HCV-RNA)in sera and alfa-interferon therapy.Methods 19 patients with chronic hepatitic C received interferon，the lever if sera HCV-RNA was quantitated at the beginning and the end of treatment by Hybridizaation Reverse transcription polymerase chain reaction (PCR-Hyb).Results A complet response (3MU、6MU)was abserved in 72.5%、75%of all cases，partial response 、non-response was abserved in 27.5%、25%of cases ofter therapy.The average amout of HCV RNA in complete responsers before therapy(4.3±1.6 ×104fg/μl)was significantly lower(P<0.05).than that of partial responsers(7.6±1.1×104fg/μl)and non-responsers(7.5±0.1×104fg/μl ).at the sixth month of treatment ，the level of sera HCV RNA in 9 complete responsers(9/14)were yet high ，and the lever of sera HCV RNA in 3 complete response (3/14)were yet very high at the twelveth since treatment .Conclusions The effect of two doses alfa-interferon therapy is no significantl difference ，and that is good in lower lever of HCV RNA in sera.
, 百拇医药
【Key word】 Hepatitis C Virus RNA；Polymerase chain reaction-hybridization；Alpha-interferon
丙型肝炎病毒是引起输血性非甲非乙型肝炎的主要病毒。干扰素能抑制HCV-RNA复制、蛋白合成及病毒从感染细胞中释放，目前，已被广泛用于治疗慢性丙型肝炎。我们用ELISA模式化的HCV-RNA聚合酶链反应—杂交(PCR-Hyb)定量检测了慢性丙型肝炎患者干扰素治疗前后血清中的HCV-RNA的含量，以探讨慢性丙肝患者血清中病毒基因水平与临床病情关系。
1 资料与方法
1.1 研究对象：根据1995年5月北京第五次全国传染病与寄生虫学术会议修订的临床诊断分型标准[1]，选择了19例慢性丙型肝炎均为1998年3月～1999年5月我院住院及门诊患者。男10例，女9例，年龄18～50岁。其中17例有输血或血制品史，2例为无确定危险因素。3例病人经肝活检证实为慢性肝炎。每例患者均接受α-干扰素治疗，3MU 3次/周×6个月11例，6MU 3次/周×6个月8例，治疗前用抗—HCV第二代试剂盒及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测均阳性，并排除甲、乙、戊、庚型等肝炎病毒感染。于治疗前、治疗第3个月、治疗第6个月、停药后半年，分别检测HCV-RNA，同时检测肝功能ALT(酶速率法测ALT，日本奥林巴斯AU-800全自动生化分析仪)。为评价干扰素疗效，将ALT水平划分为三种反应：完全反应，用药后ALT于1～2个月降至正常且无反跳者；部分反应，ALT比治疗前水平下降一半以上者或在治疗期间下降停药后再次上升者；无反应，用药后ALT水平无明显下降者。
, 百拇医药
1.2 主要试剂：“ELISA模式”化的HCV-RNA PCR-Hyb试剂盒，批号990506。HCV-RNA质粒标准由华美公司提供，扩增片段位于丙型肝炎病毒基因组的5′非编码区。
1.3 PCR-Hyb定量方法原理：标本中模板提取出来后，在同样条件下和外参标准浓度一起进行一次PCR扩增，然后利用一定的技术(如NaOH的处理)先使被固相所捕获的PCR产物成为单链，再应用生物素标记的探针去和PCR产物进行杂交、比色，利用外参标准浓度与吸光度的双对数线性关系，得出样品中HCV-RNA的含量。该方法消除了PCR反应中非特异扩增杂带的影响和两次PCR反应引起的模板扩增倍数太大影响。PCR-Hyb定量方法具体操作步骤见试剂盒说明书。
2 结果
2.1 HCV-RNA质粒定量分析结果：HCV-RNA质粒标准浓度分别为1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105fg/μl经过逆转录，PCR扩增35循环，再进行杂交，在450nm波长测定OD值，分别为0.071、0.289、0.716、1.406、2.776进行回归分析。HCV-RNA浓度与吸光度的双对数线性关系r=0.986，表明HCV-RNA含量与吸光度有良好的双对数线性关系。
, 百拇医药
2.2 6MU α-干扰素治疗前后丙肝患者血清中ALT、HCV RNA动态观察(见表1)
表1 6MU α-干扰素治疗前后丙肝患者血清中ALT、HCV-RNA的动态观察 例号
ALT(IU/L)
HCV-RNA含量(fg/μl)
治疗前
3个月
6个月
12个月
治疗前
3个月
6个月
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12个月
1
127
60
35
28
1.3×104
1.5×103
2.0×102
0
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103
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38
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20
3.5×104
0
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3
98
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19
5.4×104
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0
0
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4
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8.0×104
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0
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6.2×104
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2.1×103
3.1×102
7
210
51
30
22
4.5×104
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2.4×103
1.6×102
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30
76
82
7.5×104
1.4×103
5.0×102
4.8×104
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由表1可知，8例慢性丙肝中完全反应者6例(75%)，部分反应者1例(12.5%)，无反应者1例(12.5%)；动态观察血清中HCV-RNA含量变化，完全反应者治疗前血清中平均HCV-RNA含量(4.4±2.0×104fg/μl)显著低于部分(6.2×104fg/μl)和无反应者(7.5×104fg/μl)。从干扰素治疗开始在第6个月6例完全反应者就开始显著下降，但有4例，血清中HCV-RNA水平仍较高(大于1.6×102fg/μl)，1例在第12个月后血清中还存在浓度很高的HCV-RNA含量。部分反应、无反应者在治疗前后血清中HCV-RNA含量无明显变化。
2.3 3MU α-干扰素治疗前后丙肝患者血清中ALT、HCV-RNA动态观察(见表2)表2 3MU α-干扰素治疗前后丙肝患者血清中ALT、HCV-RNA动态观察 例号
ALT(IU/L)
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HCV-RNA含量(fg/μl)
治疗前
3个月
6个月
12个月
治疗前
3个月
6个月
12个月
1
108
46
28
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22
4.5×104
0
0
0
2
210
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5.5×104
0
0
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0
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127
40
26
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2.0×103
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63
57
7.6×104
3.8×103
3.1×102
1.3×104
5
243
45
30
24
4.4×104
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7.5×103
8.5×102
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3.2×104
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20
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4.3×104
1.8×104
7.8×105
9
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16
15
20
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3.2×103
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8.8×104
6.5×103
6.6×104
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28
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4.7×104
2.3×104
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0
由表2可知，11例慢性丙肝中完全反应者8例(72.5%)，部分反应者2例(18.18%)，无反应者1例(9.01%)；动态观察血清中HCV RNA含量变化，完全反应者治疗前血清中HCV RNA平均水平(4.2±0.5×104fg/μl)显著低于部分(8.5±0.5×104fg/μl)和无效反应者(7.6×104fg/μl)。从干扰素治疗开始在第6个月8例完全反应者就开始显著下降，但有5例血清中HCV RNA水平仍较高(大于2.0×102fg/μl)，2例在第12个月后血清中还存在浓度很高的HCV RNA含量。部分反应、无反应者治疗前后血清中HCV RNA含量无明显变化。
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3 讨论
在丙型病毒性肝炎抗病毒治疗中，目前国内外公认疗效较好的药物是干扰素[2～3]。本研究采用“ELISA模式”化的聚合酶链反应—杂交(PCR-Hyb)定量检测血清中HCV-RNA含量，来预测和评价干扰素治疗丙型肝炎的疗效。目前在国内已报道的各种检测PCR产物的方法中，PCR-Hyb定量方法还未见报道。本研究在动态观察患者血清中的HCV-RNA含量变化，显示结果3MU、6MU α-干扰素治疗慢性丙肝的完全反应者分别占72.5%、75%，部分及无效反应者分别占27.5%、25%，两组之间无显著性差异(P>0.05)。在动态观察患者血清中的HCV-RNA变化时，结果显示两种剂量的完全反应组治疗前血清中HCV RNA平均含量(4.18±1.6×104fg/μl显著低于部分(7.6±1.1×104fg/μl)和无反应者(7.5±0.1×104fg/μlP<0.05)，自干扰素治疗开始第6个月，3MU、6MU α-干扰素治疗的完全反应者中ALT与HCV RNA同步恢复的分别占6/8(75%)、56(82.2%)，在ALT恢复后，第12个月患者血清中还存在较高水平的HCV RNA，ALT与HCV RNA恢复不同步，分别占2/8(25%)、1/6(17.8%)。3MU、6MU治疗部分及无反应者治疗前后血清中HCV RNA含量者无太大的变化，两组之间无显著性差异(P>0.05)。以上提示，治疗前血清HCV RNA水平低者，α-干扰素治疗效果较治疗前血清水平高者好，这与国外学者Yamada G博士报道基本一致[4]。同时提示在选用α-干扰素剂量治疗慢性丙肝时，3MU每周3次，皮下注射，是适当有效的。也提示在干扰素治疗丙肝时，ALT恢复后，还必须结合HCV—RNA定量指标，才能更客观、真实地反应疗效，因此HCV RNA定量检测更有利于指导临床。
, 百拇医药
参考文献
[1] 病毒性肝炎防治方案(试行)[S].中华传染病杂志，1995，13：24
[2] Yoshilka k，HigashiY Yamada M，et al.Predictive factors in the response to interferon therapy in chronic hepatitis C[J]. Liver，1997，15：57
[3] 袁和俊，胡德昌，翟得溶，等.丙型肝炎患者干扰素治疗前后肝内丙型肝炎病毒抗原表达[J].中华内科杂志，1997，36：831
[4] Yamada G， Takatani M，Kishi F，et al.Efficacy of interferon alfa therapy in Chronic Hepatitis C patients depends primarily on Hepatitis C virus RNA level[J].Hepatology，1995，122(5)：1351
(收稿：1999-11-24 修回：200-01-03), 百拇医药
单位：(江苏省常州市第三人民医院，江苏 常州 213001)
关键词：丙型肝炎病毒核糖核酸；聚合酶链反应—杂交；α-干扰素
宁夏医学杂志000707 【摘要】 目的 探讨丙型肝炎病毒(HCV)基因含量与干扰素疗效的关系。方法 采用“ELISA模式”化的HCV-RNA聚合酶链反应—杂交定量(PCR-Hyb)检测了19例慢性丙型肝炎患者α-干扰素治疗前后的血清中的HCV-RNA的水平。结果 3MU、6MU α-干扰素治疗，分别是11例、8例，完全反应者分别占72.5%、75%，部分及无效反应者分别占27.5%、25%(P>0.05)。两种剂量的完全反应者治疗前血清中HCV-RNA平均含量(4.3±1.6×104fg/μl)，显著低于部分反应(7.6±1.1×104fg/μl)及无反应者(7.5±0.1×104fg/μl，P<0.05)。自治疗开始第6个月，完全反应组中9例(9/14)血清中HCV RNA水平仍较高(大于1.6×102fg/μl)，在第12个月仍有3例(3/14)血清中含较高水平的HCVRNA(大于6.9×102fg/μl)。结论 两种剂量的干扰素治疗效果无显著性差异，治疗前血清中HCV RNA水平低者干扰素治疗效果较好。
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【中图分类号】 R512.6+3 【文献标识码】 A
文章编号：1001-5949(2000)07-0397-03
The levels of Hepatitis C virus RNA of sera in patients with Chronic hepatitis C during alfa in terferon treatment.
ZHOU Guo-ping，BAI Jing-yu， HUANG Yu-qing
(Changzhou third people ′s Hosp.，Changzhou 213001，China)
【Abstract】 Objectives Discuss the relationship between the content of hepatitis C Virus RNA(HCV-RNA)in sera and alfa-interferon therapy.Methods 19 patients with chronic hepatitic C received interferon，the lever if sera HCV-RNA was quantitated at the beginning and the end of treatment by Hybridizaation Reverse transcription polymerase chain reaction (PCR-Hyb).Results A complet response (3MU、6MU)was abserved in 72.5%、75%of all cases，partial response 、non-response was abserved in 27.5%、25%of cases ofter therapy.The average amout of HCV RNA in complete responsers before therapy(4.3±1.6 ×104fg/μl)was significantly lower(P<0.05).than that of partial responsers(7.6±1.1×104fg/μl)and non-responsers(7.5±0.1×104fg/μl ).at the sixth month of treatment ，the level of sera HCV RNA in 9 complete responsers(9/14)were yet high ，and the lever of sera HCV RNA in 3 complete response (3/14)were yet very high at the twelveth since treatment .Conclusions The effect of two doses alfa-interferon therapy is no significantl difference ，and that is good in lower lever of HCV RNA in sera.
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【Key word】 Hepatitis C Virus RNA；Polymerase chain reaction-hybridization；Alpha-interferon
丙型肝炎病毒是引起输血性非甲非乙型肝炎的主要病毒。干扰素能抑制HCV-RNA复制、蛋白合成及病毒从感染细胞中释放，目前，已被广泛用于治疗慢性丙型肝炎。我们用ELISA模式化的HCV-RNA聚合酶链反应—杂交(PCR-Hyb)定量检测了慢性丙型肝炎患者干扰素治疗前后血清中的HCV-RNA的含量，以探讨慢性丙肝患者血清中病毒基因水平与临床病情关系。
1 资料与方法
1.1 研究对象：根据1995年5月北京第五次全国传染病与寄生虫学术会议修订的临床诊断分型标准[1]，选择了19例慢性丙型肝炎均为1998年3月～1999年5月我院住院及门诊患者。男10例，女9例，年龄18～50岁。其中17例有输血或血制品史，2例为无确定危险因素。3例病人经肝活检证实为慢性肝炎。每例患者均接受α-干扰素治疗，3MU 3次/周×6个月11例，6MU 3次/周×6个月8例，治疗前用抗—HCV第二代试剂盒及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测均阳性，并排除甲、乙、戊、庚型等肝炎病毒感染。于治疗前、治疗第3个月、治疗第6个月、停药后半年，分别检测HCV-RNA，同时检测肝功能ALT(酶速率法测ALT，日本奥林巴斯AU-800全自动生化分析仪)。为评价干扰素疗效，将ALT水平划分为三种反应：完全反应，用药后ALT于1～2个月降至正常且无反跳者；部分反应，ALT比治疗前水平下降一半以上者或在治疗期间下降停药后再次上升者；无反应，用药后ALT水平无明显下降者。
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1.2 主要试剂：“ELISA模式”化的HCV-RNA PCR-Hyb试剂盒，批号990506。HCV-RNA质粒标准由华美公司提供，扩增片段位于丙型肝炎病毒基因组的5′非编码区。
1.3 PCR-Hyb定量方法原理：标本中模板提取出来后，在同样条件下和外参标准浓度一起进行一次PCR扩增，然后利用一定的技术(如NaOH的处理)先使被固相所捕获的PCR产物成为单链，再应用生物素标记的探针去和PCR产物进行杂交、比色，利用外参标准浓度与吸光度的双对数线性关系，得出样品中HCV-RNA的含量。该方法消除了PCR反应中非特异扩增杂带的影响和两次PCR反应引起的模板扩增倍数太大影响。PCR-Hyb定量方法具体操作步骤见试剂盒说明书。
2 结果
2.1 HCV-RNA质粒定量分析结果：HCV-RNA质粒标准浓度分别为1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105fg/μl经过逆转录，PCR扩增35循环，再进行杂交，在450nm波长测定OD值，分别为0.071、0.289、0.716、1.406、2.776进行回归分析。HCV-RNA浓度与吸光度的双对数线性关系r=0.986，表明HCV-RNA含量与吸光度有良好的双对数线性关系。
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2.2 6MU α-干扰素治疗前后丙肝患者血清中ALT、HCV RNA动态观察(见表1)
表1 6MU α-干扰素治疗前后丙肝患者血清中ALT、HCV-RNA的动态观察 例号
ALT(IU/L)
HCV-RNA含量(fg/μl)
治疗前
3个月
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由表1可知，8例慢性丙肝中完全反应者6例(75%)，部分反应者1例(12.5%)，无反应者1例(12.5%)；动态观察血清中HCV-RNA含量变化，完全反应者治疗前血清中平均HCV-RNA含量(4.4±2.0×104fg/μl)显著低于部分(6.2×104fg/μl)和无反应者(7.5×104fg/μl)。从干扰素治疗开始在第6个月6例完全反应者就开始显著下降，但有4例，血清中HCV-RNA水平仍较高(大于1.6×102fg/μl)，1例在第12个月后血清中还存在浓度很高的HCV-RNA含量。部分反应、无反应者在治疗前后血清中HCV-RNA含量无明显变化。
2.3 3MU α-干扰素治疗前后丙肝患者血清中ALT、HCV-RNA动态观察(见表2)表2 3MU α-干扰素治疗前后丙肝患者血清中ALT、HCV-RNA动态观察 例号
ALT(IU/L)
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HCV-RNA含量(fg/μl)
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由表2可知，11例慢性丙肝中完全反应者8例(72.5%)，部分反应者2例(18.18%)，无反应者1例(9.01%)；动态观察血清中HCV RNA含量变化，完全反应者治疗前血清中HCV RNA平均水平(4.2±0.5×104fg/μl)显著低于部分(8.5±0.5×104fg/μl)和无效反应者(7.6×104fg/μl)。从干扰素治疗开始在第6个月8例完全反应者就开始显著下降，但有5例血清中HCV RNA水平仍较高(大于2.0×102fg/μl)，2例在第12个月后血清中还存在浓度很高的HCV RNA含量。部分反应、无反应者治疗前后血清中HCV RNA含量无明显变化。
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3 讨论
在丙型病毒性肝炎抗病毒治疗中，目前国内外公认疗效较好的药物是干扰素[2～3]。本研究采用“ELISA模式”化的聚合酶链反应—杂交(PCR-Hyb)定量检测血清中HCV-RNA含量，来预测和评价干扰素治疗丙型肝炎的疗效。目前在国内已报道的各种检测PCR产物的方法中，PCR-Hyb定量方法还未见报道。本研究在动态观察患者血清中的HCV-RNA含量变化，显示结果3MU、6MU α-干扰素治疗慢性丙肝的完全反应者分别占72.5%、75%，部分及无效反应者分别占27.5%、25%，两组之间无显著性差异(P>0.05)。在动态观察患者血清中的HCV-RNA变化时，结果显示两种剂量的完全反应组治疗前血清中HCV RNA平均含量(4.18±1.6×104fg/μl显著低于部分(7.6±1.1×104fg/μl)和无反应者(7.5±0.1×104fg/μlP<0.05)，自干扰素治疗开始第6个月，3MU、6MU α-干扰素治疗的完全反应者中ALT与HCV RNA同步恢复的分别占6/8(75%)、56(82.2%)，在ALT恢复后，第12个月患者血清中还存在较高水平的HCV RNA，ALT与HCV RNA恢复不同步，分别占2/8(25%)、1/6(17.8%)。3MU、6MU治疗部分及无反应者治疗前后血清中HCV RNA含量者无太大的变化，两组之间无显著性差异(P>0.05)。以上提示，治疗前血清HCV RNA水平低者，α-干扰素治疗效果较治疗前血清水平高者好，这与国外学者Yamada G博士报道基本一致[4]。同时提示在选用α-干扰素剂量治疗慢性丙肝时，3MU每周3次，皮下注射，是适当有效的。也提示在干扰素治疗丙肝时，ALT恢复后，还必须结合HCV—RNA定量指标，才能更客观、真实地反应疗效，因此HCV RNA定量检测更有利于指导临床。
, 百拇医药
参考文献
[1] 病毒性肝炎防治方案(试行)[S].中华传染病杂志，1995，13：24
[2] Yoshilka k，HigashiY Yamada M，et al.Predictive factors in the response to interferon therapy in chronic hepatitis C[J]. Liver，1997，15：57
[3] 袁和俊，胡德昌，翟得溶，等.丙型肝炎患者干扰素治疗前后肝内丙型肝炎病毒抗原表达[J].中华内科杂志，1997，36：831
[4] Yamada G， Takatani M，Kishi F，et al.Efficacy of interferon alfa therapy in Chronic Hepatitis C patients depends primarily on Hepatitis C virus RNA level[J].Hepatology，1995，122(5)：1351
(收稿：1999-11-24 修回：200-01-03), 百拇医药