三氯苯达唑体内外杀灭卫氏并殖吸虫的效果和虫体蛋白质、糖原及DNA含量测定
蛋白质、糖原及DNA含量测定
许世锷 陆秀君 金立群
摘 要：目的 探讨三氯苯达唑在家犬体内及体外培养中对卫氏并殖吸虫的杀虫效果，并取得大量死虫。探讨该药对虫体蛋白质、糖原及DNA含量的影响，为研究该药的杀虫机理奠定基础。方法 用卫氏并殖吸虫囊蚴感染家犬，至粪检查到虫卵后，用三氯苯达唑口服治疗观察疗效。将从对照犬获得的活虫培养于 BME培养液内，观察体外杀虫效果。用Lowry法测定虫体蛋白质含量；用Johnson法测定还原糖含量；用二苯胺显色法测定DNA含量。结果 治疗犬于服药后3天及5天解剖，均可获得大量死虫，杀虫率达 100%。在体外培养中，加入药物后虫体的平均存活时间为2.39天，与对照组有显著差异。体内杀虫所取得的死虫较对照组的活虫，虫体显著缩小，重量减轻；体外培养中杀死的虫体，体积无明显缩小，但重量显著减轻。经测定体内外杀虫组与对照组之间，虫体蛋白质含量及 DNA含量均有非常显著的减少；而虫体糖原的含量，体内杀虫组有非常显著的减少，而体外杀虫组则无显著差异。结论 三氯苯达唑在体内外对卫氏并殖吸虫有良好的杀虫效果。药物主要作用于虫体的蛋白质及核酸的合成或代谢，而对虫体糖原的合成与代谢影响不大。
, 百拇医药
关键词：卫氏并殖吸虫 三氯苯达唑 蛋白质 糖原 DNA
三氯苯达唑(triclabendazole)是由瑞士汽巴—嘉基(Ciba-Geigy)制药有限公司于80年代研究生产的一类新的苯并咪唑类衍生物。该药已证明对牛、羊及人体的肝片吸虫病[1，2]，棉鼠的双侧子宫并殖吸虫(P.uterbilateralis)感染[3 及喀麦隆并殖吸虫病患儿[4]，墨西哥并殖吸虫病(P.mexicanus)[5]均有良好的治疗作用。我国高劲松等[6，7]实验证明对卫氏并殖吸虫和斯氏狸殖吸虫均有良好的杀虫作用。有关该药杀虫机理的报告则较少，仅见到Stitt[8]等对肝片吸虫蛋白质合成影响的报告。为对该药临床治疗卫氏并殖吸虫病提供更多的依据，我们拟对其杀虫机理进行探讨。先将工作的第一部分：体内外对虫体的杀灭效果及虫体蛋白质、糖原及DNA含量的变化小结于下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 动物实验 健康家犬8只，感染前体重在10～13.5kg之间。卫氏并殖吸虫囊蚴由采自广东省梅州市平远县的华溪蟹中分离获得。将囊蚴包于熟肉丸中喂饲。实验分二批进行，第一批于1997年10月感染犬2只(200及150个囊蚴)，至 85天粪中查获虫卵，第107天给1犬服药 2天，5天后两犬同时解剖。第2批于1998年 10月感染 6只(每犬100个囊蚴)，至89天均查到虫卵。于第109天给2只犬服药；至第130天给另1只服药，5天后解剖；上述3犬均同时解剖对照犬1只。
1.2 体外培养 培养液为BME培养基(美国产)加10%灭活小牛血清，每100ml中加青霉素0.5万单位及链霉素0.05g。每个培养瓶中用培养液 5ml，培养虫体2条，置 37℃温箱，每 12小时在解剖镜下观察1次，每2天更换培养液1次。
1.3 药物与剂量 三氯苯达唑原药粉来自北京汽巴—嘉基制药有限公司。治疗犬按100mg/kg.d× 2d，将药粉包埋在肉丸内喂饲。体外培养组用药量 取三氯苯达唑20mg，加入培养液2ml，吐温-20 0.1ml，使成均匀混悬液。每培养瓶中加药液2滴(16滴/ml)，平均每ml培养液中含药0.24mg。对照组每瓶加对照液2滴(培养液2ml，吐温-20 0.1ml)。
, 百拇医药
1.4 杀虫效果观察项目 动物解剖肺部肉眼观察及摄影；病理切片检查；虫体回收率及死虫率；新鲜虫体湿重(滤纸吸去虫体表面水份，万分之一天平秤量)；在解剖镜下测虫体长与宽；染色制片后用显微镜观察形态学改变并摄影。
1.5 虫体蛋白质、糖原及DNA含量测定 将虫体5条，每条加1ml双蒸水用匀浆器磨成均浆，离心取上清液。用Lowry法[9]测定蛋白质含量；Park与Johnson法(9)测定还原糖含量；二苯胺显色法测定 DNA含量。用岛津 U-V-120型分光光度计，分别在波长540nm，690nm及595nm处测定样品吸光率，用本实验室的标准曲线算出相应的含量。
2 结果
2.1 犬体内杀虫效果
2.1.1 肺部病变 对照犬两肺呈淡红或深红色，上有多处鲜红或暗红色出血斑，并有多个紫红色突出表面的虫囊，质软有弹性；剖面呈囊状，内有肉红色活虫(大多为2条)。治疗犬两肺充血较轻，呈淡红色，有些部位较苍白。表面较平整，出血斑小(1～2mm)而色淡，有些呈黄白色斑点。突出肺表面的虫囊较小，多数内有暗红色体积明显缩小的死虫，部分虫囊内为脓液及腐烂虫体碎片；部分虫囊呈实心结节状。
, 百拇医药
2.1.2 虫囊与虫体 对照犬4只，虫体检出率为42.6%，全部虫体在培养液中活动良好。治疗后3天犬1只，虫体检出率为26.0%；治疗后5天犬3只，虫体检出率为23.71%。全部治疗后获得的虫体均比正常虫体小，暗红色，在培养液内不活动，均为死虫，杀虫率达100%。三组虫体的检出率经用χ2检验，P<0.005，有非常显著性差异，见表1。
表1 三氯苯达唑在犬体内杀灭卫氏并殖吸虫的效果
Table 1 killing effect of triclabendazole to P. westermani in dogs
对照组(4只)
control group
停药后3天组(1只)
, 百拇医药 stop treatment 3 days
停药后5天组(3只)
stop treatment 5 days
数量
number
%
数量
number
%
数量
number
%
, 百拇医药
感染囊蚴总数
500
100
350
total of metacercaria
检出总虫数
213
26
83
total of the worm
检出率
42.6
, 百拇医药 26.0
23.71
rates of discovery
虫体死活
situation of the worm
全活
all alive
全死
all dead
全死
all dead
3条
, 百拇医药
2
2.27
2条
102
74.45
9
39.13
30
34.09
囊内不同虫数的虫囊数
capsules with different
1条
9
, 百拇医药
6.57
8
34.78
17
19.32
numbers of the worm
无虫
26
18.98
6
26.09
39
44.32
, http://www.100md.com
总虫囊数
137
100
23
100
88
100
total of capsules
在3组犬肺的虫囊中，每个囊内含虫体的数量也有差异，对照犬每囊中含2条虫的囊数占总囊数的74.54%，而2个治疗组分别为39.13 %及34.09%，有非常显著性差异(P<0.005)。而每个囊内含1条虫者，以治疗后3天组最高；无虫的空囊或实心囊则以治疗后5天组最高，3组间也均有非常显著性差异(P均<0.005)。
, 百拇医药
2.1.3 病理切片检查 对照组虫体寄生于肺组织内，局部肺组织结构破坏，虫体周围大量嗜酸性粒细胞浸润；虫卵沉积。支气管腔内充满炎性渗出物。囊腔内的虫体体壁完整，皮层细胞正常。治疗后3天组 虫体周围大量中性粒细胞、浆细胞浸润，形成慢性脓肿。并可见少量巨噬细胞、嗜酸性粒细胞。外围纤维组织增生包绕，脓肿周围有大量虫卵沉积伴异物巨细胞反应。虫囊中的虫体体壁约有1/3被破坏消失，其余的体壁皮层细胞也已不规则、不完整。治疗后5天组 基本与治疗后3天组相似，但在周围形成的脓肿中，中性粒细胞的比例减少，嗜酸性粒细胞比例增加。
2.2 体外培养中杀虫效果 将从对照犬中检获的成虫，放入盛有培养液的平皿中，置 37℃温箱半小时，选取活动正常、虫体无破损者进行培养。24小时后，在解剖镜下观察虫体均活动正常，将每批培养的虫体随机分为2组，1 组加药液，1 组加对照液。待杀虫组的虫体全部死亡后，将对照组再随机分为2组，对照组Ⅰ置4 ℃冰箱冻死，作为其它测定时的对照组；对照组Ⅱ则继续培养，直至自然死亡。体外培养中的杀虫试验共进行 3批，结果见表2。 表2 三氯苯达唑在体外培养中的杀虫效果
, 百拇医药
Table 2 killing effect of triclabendazole to westernmani in culture
体外杀虫组
with the drug in vitro
对照组1
control group 1
对照组2
control group 2
虫数
number
平均存活天数
, 百拇医药
living days X±s
虫数
number
处理办法
method
虫数
number
平均存活天数
living days X±s
第一批培养
20
1.95±0.83
, http://www.100md.com
10
6天后冻死freeze
10
28.6±15.6
the first batch of culture
to dead after 6 dyas
第二批培养
10
2.70±0.42
6
5天后冻死freeze
0
, 百拇医药
the second batch of culture
to dead after 5 days
第三批培养
24
2.63±0.71
12
6天后冻死freeze
12
16.25±9.18
the third batch of culture
to dead after 6 days
, 百拇医药
合计(total)
54
2.39±0.84
28
22
21.86±14.37
结果显示，体外杀虫组的虫体，在药物滴入后，最快24小时死亡，最慢5天死亡，平均存活2.39天。而对照组最短5天死亡，最长存活 67天，平均 21.86天。两组间的t＝2.34，P<0.05，说明有显著性差异。
2.3 虫体湿重及大小测量表3 各组虫体湿重的比较(单位：mg)
Table 3 Comparison of wet weight among different groups of the worm
, http://www.100md.com
第一次实验
The first test
第二次实验
The second test
第三次实验
The third test
虫数
number
平均数±标准差
X±s
虫数
number
, 百拇医药
平均数±标准差
X±s
虫数
number
平均数±标准差
X±s
体内杀虫
对照组
10
26.2±0.77
10
24.85±3.34
in vivo
, 百拇医药
control group
用药后三天组
10
6.52±1.72
with the drug
after 3 days
用药后五天组
10
9.65±0.42
10
7.32±2.23
with the drug
, http://www.100md.com
after 5 days
体外杀虫
对照组
10
32.95±2.56
10
16.35±6.62
15
19.83±10.27
in vitro
control group
杀虫组
, 百拇医药
10
15.85±0.78
10
9.86±3.04
15
12.42±3.93
with the drug
2.3.1 虫体湿重测定 从表3的平均值，根据同批对比的原则分别进行t检验：体内杀虫对照组与用药后5天组2次结果及用药后3天组的1次结果之间均有非常显著性差异(t＝ 59.11，14.05及15.72，P均<0.01)。而用药后3天与5天组间则无显著性差异(t＝0.898，P>0.05)。体外杀虫对照组与杀虫组之间的湿重，三次实验均有显著性差异(t＝20.18，2.703及2.609，P<0.001，0.05及0.05)。说明不论在犬体内，还是在体外培养中，用三氯苯达唑杀虫后，均会使虫体的湿重显著减轻。
, 百拇医药
2.3.2 虫体大小的测定 从表4的平均值，经t检验结果：体内杀虫对照组与用药后5天组的虫体长与宽之间均有非常显著性差异(t＝6.71，3.714及 5.846，11.36，P均<0.01)。对照组与用药后3天组的虫体长与宽也均有非常显著性差异(t＝5.194及9.216，P均<0.001)。而用药后3天与5天组之间则无显著差异(P均>0.05)。体外杀虫3次实验的对照组与杀虫组之间的长与宽均无显著性差异(P均>0.05)。表4 各组虫体大小的测量(单位：mm)
Table 4 The measurements on the sides of different groups of the worm
第一次实验
The first test
第二次实验
, 百拇医药
The second test
第三次实验
The third test
虫数
number
平均数±标准差
X±s
虫数
number
平均数±标准差
X±s
虫数
, 百拇医药 number
平均数±标准差
X±s
对照组
长
9
6.88±0.89
10
5.27±0.82
control group
length
宽
9
, 百拇医药
3.22±0.52
10
3.16±0.33
width
用药后三天组
长
10
3.40±0.80
体内杀虫
with the drug
length
in vivo
, 百拇医药
after 3 days
宽
10
1.75±0.35
width
用药后五天组
长
6
4.13±0.53
10
3.97±0.76
with the drug
, http://www.100md.com length
after 5 days
宽
6
1.70±0.47
10
1.66±0.30
width
对照组
长
6
5.78±0.78
6
, http://www.100md.com
6.32±1.44
15
4.94±1.12
control group
length
宽
6
2.93±0.27
6
2.83±0.27
15
2.66±0.50
, 百拇医药 体外杀虫
width
in vitro
杀虫组
长
6
6.12±0.37
10
4.70±1.32
15
5.43±0.87
with the drug
length
, 百拇医药
宽
6
2.87±0.20
10
1.98±0.48
15
2.43±0.48
width
2.4 显微镜下虫体的形态变化
2.4.1 成虫的形态变化 体内杀虫组的虫体表面多处粘附有中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，尤以口腹吸盘的凹窝内更多。卵黄腺小叶基本消失，卵黄细胞大部分破坏，呈散在颗粒状。子宫内虫卵已排空；卵巢及睾丸明显缩小，分叶较少，高倍镜下内部结构仍呈颗粒状。体外杀虫组的虫体表面无明显变化，卵黄小叶大部分消失，但仍有部分可见，卵黄细胞大部分可见，但边界较模糊。子宫内虫卵也已排空，卵巢及睾丸略小，但分叶尚可见。
, 百拇医药
2.4.2 虫卵的形态变化 对照组虫囊内的虫卵均为正常虫卵；体内杀虫组虫囊内的虫卵明显增多，但大部分为空壳卵或卵黄细胞数少且肿胀或破碎的虫卵。体外杀虫组在虫体死亡前排出的虫卵明显增加，其中有部分虫卵内的卵黄细胞数量减少，体积增大，颗粒变稀疏，似有肿胀状态。
2.5 虫体蛋白质、糖原及DNA含量测定，见表5。表5 虫体的蛋白质、糖原及DNA含量测定(单位：μg / 条)
Table 5 The measurements on the contents of protein， glycogen and DNA of the worm
蛋白质含量
protein
糖原含量
glycogen
, 百拇医药
DNA含量
DNA
虫数
number
平均数±标准差
X±s
虫数
number
平均数±标准差
X±s
虫数
number
平均数±标准差
, 百拇医药
X±s
体内杀虫
对照组
5
2072±114.71
5
141.26±15.03
5
227.2±0.84
in vivo
control group
用药后三天组
, 百拇医药 5
910±12.25
5
38.92±2.46
5
103.6±0.89
with the drug
after 3 days
用药后五天组
5
937±67.88
5
, 百拇医药 38.92±2.91
5
82.2±1.30
with the drug
after 5 days
体外杀虫
对照组
5
763±84.75
5
19.19±7.00
in vitro
, http://www.100md.com
control group
杀虫组
5
463±34.79
5
14.30±0.33
with the drug
2.5.1 虫体蛋白质含量 体内杀虫的对照组与用药后3天组及5天组之间的t值分别为22.52及19.04，P均< 0.001。而两个用药组间则无显著性差异(t＝ 0.310，P>0.05)。体外培养中的对照组与杀虫组之间的t＝ 7.322，P<0.001。上述结果说明，不论在犬体内还是在体外培养中，三氯苯达唑均能使虫体的蛋白质含量非常显著地减少。
, 百拇医药
2.5.2 虫体糖原含量 体内杀虫对照组与用药后3天及5天组之间t＝15.03及14.94，P均<0.001；而两个用药组之间则无显著性差异。体外培养中的对照组与杀虫组之间，t＝1.56，P>0.05。结果说明，虫体糖原含量在体内杀虫组有非常显著的减少，而在体外杀虫组则无明显减少。
2.5.3 虫体的DNA含量 体内杀虫对照组与两个用药组之间的t＝209.24及225.55，P均<0.001。说明药物能使虫体的DNA含量非常显著地减少。
3 讨论
三氯苯达唑对家犬卫氏并殖吸虫感染的实验治疗效果，高劲松等[6]报告已得到肯定结果，但未能检获较多死虫。本实验在治疗后5天及3天解剖家犬，能获得大量死虫；在体外培养中杀虫可得到死后 12小时内的虫体，为进行杀虫机理研究创造了条件。
本研究同时在家犬体内及体外培养中进行杀虫，均获得100%的疗效，进一步证明了此药对卫氏并殖吸虫的疗效。犬体内杀虫的结果显示，各组间虫体的检出率及每个虫囊中的虫数的百分率均有非常显著性差异，并在杀虫犬的虫囊中常可见到虫体碎片或脓液，说明虫体被药物杀死后，可较快被宿主机体消灭。在体外培养中虫体大部分在药物加入后2～2.5天死亡，这也与Robinson[1]提出的此药需在虫体内积聚到一定程度才起作用，故杀虫作用缓慢相一致。
, http://www.100md.com
从药物作用后虫体的组织形态变化，损害较严重的为体壁皮层及生殖系统，以卵黄腺的破坏为明显，提示药物主要是通过体壁吸收。体内杀虫组虫体的损坏比体外杀虫组更为明显，这可能是由于体内杀虫组是在治疗结束后3或5天，而体外杀虫组是12小时之内取材；同时体内杀虫组还有宿主的免疫系统参与作用所致。
本组资料显示，在家犬体内杀虫后获得的虫体，在虫体的大小、湿重，蛋白质和 DNA含量等，均比对照组显著减少。在体外杀虫组，因是在虫体死亡后12小时内即进行测定，因此虫体大小与对照组无显著性差异，但在虫体湿重、蛋白质及DNA含量等方面也有非常显著的减少。这提示三氯苯达唑对卫氏并殖吸虫的杀灭作用，主要是对其蛋白质的合成、代谢起抑制、破坏作用，这与Stitt等[8]对肝片吸虫的研究符合。同时也提示对核酸代谢也有抑制作用。关于该药对虫体糖原含量的影响，在体内杀虫组与对照组间有显著减少，而在体外杀虫则无显著差异。这可能是因为体内杀虫组是在停药后3至5天测定，而体外杀虫组是在24小时之内，而糖原是水溶性的，在活虫有自身的屏障保护机制，而虫体死亡后屏障机制已消失，因此糖原可随虫体的水份而渗透出体外所致，而并非破坏虫体糖原的合成或代谢。关于三氯苯达唑对虫体蛋白质及核酸代谢破坏作用的进一步机理，以及对糖代谢是否确无影响，尚有待进一步研究。
, 百拇医药
(本工作蒙重庆医科大学刘约翰教授指导，并赠送药物，特此致谢)
许世锷(汕头大学医学院寄生虫学教研室 汕头，515031)
陆秀君(汕头大学医学院寄生虫学教研室 汕头，515031)
金立群(汕头大学医学院寄生虫学教研室 汕头，515031)
参考文献
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6，高劲松，刘约翰，王小根，等.三氯苯达唑治疗家犬卫氏并殖吸虫感染的实验观察[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志， 1997，15(5)：263～265.
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9，徐晓利主译. 生物化学工具[M].人民卫生出版社. 1983，51，55., 百拇医药
许世锷 陆秀君 金立群
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关键词：卫氏并殖吸虫 三氯苯达唑 蛋白质 糖原 DNA
三氯苯达唑(triclabendazole)是由瑞士汽巴—嘉基(Ciba-Geigy)制药有限公司于80年代研究生产的一类新的苯并咪唑类衍生物。该药已证明对牛、羊及人体的肝片吸虫病[1，2]，棉鼠的双侧子宫并殖吸虫(P.uterbilateralis)感染[3 及喀麦隆并殖吸虫病患儿[4]，墨西哥并殖吸虫病(P.mexicanus)[5]均有良好的治疗作用。我国高劲松等[6，7]实验证明对卫氏并殖吸虫和斯氏狸殖吸虫均有良好的杀虫作用。有关该药杀虫机理的报告则较少，仅见到Stitt[8]等对肝片吸虫蛋白质合成影响的报告。为对该药临床治疗卫氏并殖吸虫病提供更多的依据，我们拟对其杀虫机理进行探讨。先将工作的第一部分：体内外对虫体的杀灭效果及虫体蛋白质、糖原及DNA含量的变化小结于下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 动物实验 健康家犬8只，感染前体重在10～13.5kg之间。卫氏并殖吸虫囊蚴由采自广东省梅州市平远县的华溪蟹中分离获得。将囊蚴包于熟肉丸中喂饲。实验分二批进行，第一批于1997年10月感染犬2只(200及150个囊蚴)，至 85天粪中查获虫卵，第107天给1犬服药 2天，5天后两犬同时解剖。第2批于1998年 10月感染 6只(每犬100个囊蚴)，至89天均查到虫卵。于第109天给2只犬服药；至第130天给另1只服药，5天后解剖；上述3犬均同时解剖对照犬1只。
1.2 体外培养 培养液为BME培养基(美国产)加10%灭活小牛血清，每100ml中加青霉素0.5万单位及链霉素0.05g。每个培养瓶中用培养液 5ml，培养虫体2条，置 37℃温箱，每 12小时在解剖镜下观察1次，每2天更换培养液1次。
1.3 药物与剂量 三氯苯达唑原药粉来自北京汽巴—嘉基制药有限公司。治疗犬按100mg/kg.d× 2d，将药粉包埋在肉丸内喂饲。体外培养组用药量 取三氯苯达唑20mg，加入培养液2ml，吐温-20 0.1ml，使成均匀混悬液。每培养瓶中加药液2滴(16滴/ml)，平均每ml培养液中含药0.24mg。对照组每瓶加对照液2滴(培养液2ml，吐温-20 0.1ml)。
, 百拇医药
1.4 杀虫效果观察项目 动物解剖肺部肉眼观察及摄影；病理切片检查；虫体回收率及死虫率；新鲜虫体湿重(滤纸吸去虫体表面水份，万分之一天平秤量)；在解剖镜下测虫体长与宽；染色制片后用显微镜观察形态学改变并摄影。
1.5 虫体蛋白质、糖原及DNA含量测定 将虫体5条，每条加1ml双蒸水用匀浆器磨成均浆，离心取上清液。用Lowry法[9]测定蛋白质含量；Park与Johnson法(9)测定还原糖含量；二苯胺显色法测定 DNA含量。用岛津 U-V-120型分光光度计，分别在波长540nm，690nm及595nm处测定样品吸光率，用本实验室的标准曲线算出相应的含量。
2 结果
2.1 犬体内杀虫效果
2.1.1 肺部病变 对照犬两肺呈淡红或深红色，上有多处鲜红或暗红色出血斑，并有多个紫红色突出表面的虫囊，质软有弹性；剖面呈囊状，内有肉红色活虫(大多为2条)。治疗犬两肺充血较轻，呈淡红色，有些部位较苍白。表面较平整，出血斑小(1～2mm)而色淡，有些呈黄白色斑点。突出肺表面的虫囊较小，多数内有暗红色体积明显缩小的死虫，部分虫囊内为脓液及腐烂虫体碎片；部分虫囊呈实心结节状。
, 百拇医药
2.1.2 虫囊与虫体 对照犬4只，虫体检出率为42.6%，全部虫体在培养液中活动良好。治疗后3天犬1只，虫体检出率为26.0%；治疗后5天犬3只，虫体检出率为23.71%。全部治疗后获得的虫体均比正常虫体小，暗红色，在培养液内不活动，均为死虫，杀虫率达100%。三组虫体的检出率经用χ2检验，P<0.005，有非常显著性差异，见表1。
表1 三氯苯达唑在犬体内杀灭卫氏并殖吸虫的效果
Table 1 killing effect of triclabendazole to P. westermani in dogs
对照组(4只)
control group
停药后3天组(1只)
, 百拇医药 stop treatment 3 days
停药后5天组(3只)
stop treatment 5 days
数量
number
%
数量
number
%
数量
number
%
, 百拇医药
感染囊蚴总数
500
100
350
total of metacercaria
检出总虫数
213
26
83
total of the worm
检出率
42.6
, 百拇医药 26.0
23.71
rates of discovery
虫体死活
situation of the worm
全活
all alive
全死
all dead
全死
all dead
3条
, 百拇医药
2
2.27
2条
102
74.45
9
39.13
30
34.09
囊内不同虫数的虫囊数
capsules with different
1条
9
, 百拇医药
6.57
8
34.78
17
19.32
numbers of the worm
无虫
26
18.98
6
26.09
39
44.32
, http://www.100md.com
总虫囊数
137
100
23
100
88
100
total of capsules
在3组犬肺的虫囊中，每个囊内含虫体的数量也有差异，对照犬每囊中含2条虫的囊数占总囊数的74.54%，而2个治疗组分别为39.13 %及34.09%，有非常显著性差异(P<0.005)。而每个囊内含1条虫者，以治疗后3天组最高；无虫的空囊或实心囊则以治疗后5天组最高，3组间也均有非常显著性差异(P均<0.005)。
, 百拇医药
2.1.3 病理切片检查 对照组虫体寄生于肺组织内，局部肺组织结构破坏，虫体周围大量嗜酸性粒细胞浸润；虫卵沉积。支气管腔内充满炎性渗出物。囊腔内的虫体体壁完整，皮层细胞正常。治疗后3天组 虫体周围大量中性粒细胞、浆细胞浸润，形成慢性脓肿。并可见少量巨噬细胞、嗜酸性粒细胞。外围纤维组织增生包绕，脓肿周围有大量虫卵沉积伴异物巨细胞反应。虫囊中的虫体体壁约有1/3被破坏消失，其余的体壁皮层细胞也已不规则、不完整。治疗后5天组 基本与治疗后3天组相似，但在周围形成的脓肿中，中性粒细胞的比例减少，嗜酸性粒细胞比例增加。
2.2 体外培养中杀虫效果 将从对照犬中检获的成虫，放入盛有培养液的平皿中，置 37℃温箱半小时，选取活动正常、虫体无破损者进行培养。24小时后，在解剖镜下观察虫体均活动正常，将每批培养的虫体随机分为2组，1 组加药液，1 组加对照液。待杀虫组的虫体全部死亡后，将对照组再随机分为2组，对照组Ⅰ置4 ℃冰箱冻死，作为其它测定时的对照组；对照组Ⅱ则继续培养，直至自然死亡。体外培养中的杀虫试验共进行 3批，结果见表2。 表2 三氯苯达唑在体外培养中的杀虫效果
, 百拇医药
Table 2 killing effect of triclabendazole to westernmani in culture
体外杀虫组
with the drug in vitro
对照组1
control group 1
对照组2
control group 2
虫数
number
平均存活天数
, 百拇医药
living days X±s
虫数
number
处理办法
method
虫数
number
平均存活天数
living days X±s
第一批培养
20
1.95±0.83
, http://www.100md.com
10
6天后冻死freeze
10
28.6±15.6
the first batch of culture
to dead after 6 dyas
第二批培养
10
2.70±0.42
6
5天后冻死freeze
0
, 百拇医药
the second batch of culture
to dead after 5 days
第三批培养
24
2.63±0.71
12
6天后冻死freeze
12
16.25±9.18
the third batch of culture
to dead after 6 days
, 百拇医药
合计(total)
54
2.39±0.84
28
22
21.86±14.37
结果显示，体外杀虫组的虫体，在药物滴入后，最快24小时死亡，最慢5天死亡，平均存活2.39天。而对照组最短5天死亡，最长存活 67天，平均 21.86天。两组间的t＝2.34，P<0.05，说明有显著性差异。
2.3 虫体湿重及大小测量表3 各组虫体湿重的比较(单位：mg)
Table 3 Comparison of wet weight among different groups of the worm
, http://www.100md.com
第一次实验
The first test
第二次实验
The second test
第三次实验
The third test
虫数
number
平均数±标准差
X±s
虫数
number
, 百拇医药
平均数±标准差
X±s
虫数
number
平均数±标准差
X±s
体内杀虫
对照组
10
26.2±0.77
10
24.85±3.34
in vivo
, 百拇医药
control group
用药后三天组
10
6.52±1.72
with the drug
after 3 days
用药后五天组
10
9.65±0.42
10
7.32±2.23
with the drug
, http://www.100md.com
after 5 days
体外杀虫
对照组
10
32.95±2.56
10
16.35±6.62
15
19.83±10.27
in vitro
control group
杀虫组
, 百拇医药
10
15.85±0.78
10
9.86±3.04
15
12.42±3.93
with the drug
2.3.1 虫体湿重测定 从表3的平均值，根据同批对比的原则分别进行t检验：体内杀虫对照组与用药后5天组2次结果及用药后3天组的1次结果之间均有非常显著性差异(t＝ 59.11，14.05及15.72，P均<0.01)。而用药后3天与5天组间则无显著性差异(t＝0.898，P>0.05)。体外杀虫对照组与杀虫组之间的湿重，三次实验均有显著性差异(t＝20.18，2.703及2.609，P<0.001，0.05及0.05)。说明不论在犬体内，还是在体外培养中，用三氯苯达唑杀虫后，均会使虫体的湿重显著减轻。
, 百拇医药
2.3.2 虫体大小的测定 从表4的平均值，经t检验结果：体内杀虫对照组与用药后5天组的虫体长与宽之间均有非常显著性差异(t＝6.71，3.714及 5.846，11.36，P均<0.01)。对照组与用药后3天组的虫体长与宽也均有非常显著性差异(t＝5.194及9.216，P均<0.001)。而用药后3天与5天组之间则无显著差异(P均>0.05)。体外杀虫3次实验的对照组与杀虫组之间的长与宽均无显著性差异(P均>0.05)。表4 各组虫体大小的测量(单位：mm)
Table 4 The measurements on the sides of different groups of the worm
第一次实验
The first test
第二次实验
, 百拇医药
The second test
第三次实验
The third test
虫数
number
平均数±标准差
X±s
虫数
number
平均数±标准差
X±s
虫数
, 百拇医药 number
平均数±标准差
X±s
对照组
长
9
6.88±0.89
10
5.27±0.82
control group
length
宽
9
, 百拇医药
3.22±0.52
10
3.16±0.33
width
用药后三天组
长
10
3.40±0.80
体内杀虫
with the drug
length
in vivo
, 百拇医药
after 3 days
宽
10
1.75±0.35
width
用药后五天组
长
6
4.13±0.53
10
3.97±0.76
with the drug
, http://www.100md.com length
after 5 days
宽
6
1.70±0.47
10
1.66±0.30
width
对照组
长
6
5.78±0.78
6
, http://www.100md.com
6.32±1.44
15
4.94±1.12
control group
length
宽
6
2.93±0.27
6
2.83±0.27
15
2.66±0.50
, 百拇医药 体外杀虫
width
in vitro
杀虫组
长
6
6.12±0.37
10
4.70±1.32
15
5.43±0.87
with the drug
length
, 百拇医药
宽
6
2.87±0.20
10
1.98±0.48
15
2.43±0.48
width
2.4 显微镜下虫体的形态变化
2.4.1 成虫的形态变化 体内杀虫组的虫体表面多处粘附有中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，尤以口腹吸盘的凹窝内更多。卵黄腺小叶基本消失，卵黄细胞大部分破坏，呈散在颗粒状。子宫内虫卵已排空；卵巢及睾丸明显缩小，分叶较少，高倍镜下内部结构仍呈颗粒状。体外杀虫组的虫体表面无明显变化，卵黄小叶大部分消失，但仍有部分可见，卵黄细胞大部分可见，但边界较模糊。子宫内虫卵也已排空，卵巢及睾丸略小，但分叶尚可见。
, 百拇医药
2.4.2 虫卵的形态变化 对照组虫囊内的虫卵均为正常虫卵；体内杀虫组虫囊内的虫卵明显增多，但大部分为空壳卵或卵黄细胞数少且肿胀或破碎的虫卵。体外杀虫组在虫体死亡前排出的虫卵明显增加，其中有部分虫卵内的卵黄细胞数量减少，体积增大，颗粒变稀疏，似有肿胀状态。
2.5 虫体蛋白质、糖原及DNA含量测定，见表5。表5 虫体的蛋白质、糖原及DNA含量测定(单位：μg / 条)
Table 5 The measurements on the contents of protein， glycogen and DNA of the worm
蛋白质含量
protein
糖原含量
glycogen
, 百拇医药
DNA含量
DNA
虫数
number
平均数±标准差
X±s
虫数
number
平均数±标准差
X±s
虫数
number
平均数±标准差
, 百拇医药
X±s
体内杀虫
对照组
5
2072±114.71
5
141.26±15.03
5
227.2±0.84
in vivo
control group
用药后三天组
, 百拇医药 5
910±12.25
5
38.92±2.46
5
103.6±0.89
with the drug
after 3 days
用药后五天组
5
937±67.88
5
, 百拇医药 38.92±2.91
5
82.2±1.30
with the drug
after 5 days
体外杀虫
对照组
5
763±84.75
5
19.19±7.00
in vitro
, http://www.100md.com
control group
杀虫组
5
463±34.79
5
14.30±0.33
with the drug
2.5.1 虫体蛋白质含量 体内杀虫的对照组与用药后3天组及5天组之间的t值分别为22.52及19.04，P均< 0.001。而两个用药组间则无显著性差异(t＝ 0.310，P>0.05)。体外培养中的对照组与杀虫组之间的t＝ 7.322，P<0.001。上述结果说明，不论在犬体内还是在体外培养中，三氯苯达唑均能使虫体的蛋白质含量非常显著地减少。
, 百拇医药
2.5.2 虫体糖原含量 体内杀虫对照组与用药后3天及5天组之间t＝15.03及14.94，P均<0.001；而两个用药组之间则无显著性差异。体外培养中的对照组与杀虫组之间，t＝1.56，P>0.05。结果说明，虫体糖原含量在体内杀虫组有非常显著的减少，而在体外杀虫组则无明显减少。
2.5.3 虫体的DNA含量 体内杀虫对照组与两个用药组之间的t＝209.24及225.55，P均<0.001。说明药物能使虫体的DNA含量非常显著地减少。
3 讨论
三氯苯达唑对家犬卫氏并殖吸虫感染的实验治疗效果，高劲松等[6]报告已得到肯定结果，但未能检获较多死虫。本实验在治疗后5天及3天解剖家犬，能获得大量死虫；在体外培养中杀虫可得到死后 12小时内的虫体，为进行杀虫机理研究创造了条件。
本研究同时在家犬体内及体外培养中进行杀虫，均获得100%的疗效，进一步证明了此药对卫氏并殖吸虫的疗效。犬体内杀虫的结果显示，各组间虫体的检出率及每个虫囊中的虫数的百分率均有非常显著性差异，并在杀虫犬的虫囊中常可见到虫体碎片或脓液，说明虫体被药物杀死后，可较快被宿主机体消灭。在体外培养中虫体大部分在药物加入后2～2.5天死亡，这也与Robinson[1]提出的此药需在虫体内积聚到一定程度才起作用，故杀虫作用缓慢相一致。
, http://www.100md.com
从药物作用后虫体的组织形态变化，损害较严重的为体壁皮层及生殖系统，以卵黄腺的破坏为明显，提示药物主要是通过体壁吸收。体内杀虫组虫体的损坏比体外杀虫组更为明显，这可能是由于体内杀虫组是在治疗结束后3或5天，而体外杀虫组是12小时之内取材；同时体内杀虫组还有宿主的免疫系统参与作用所致。
本组资料显示，在家犬体内杀虫后获得的虫体，在虫体的大小、湿重，蛋白质和 DNA含量等，均比对照组显著减少。在体外杀虫组，因是在虫体死亡后12小时内即进行测定，因此虫体大小与对照组无显著性差异，但在虫体湿重、蛋白质及DNA含量等方面也有非常显著的减少。这提示三氯苯达唑对卫氏并殖吸虫的杀灭作用，主要是对其蛋白质的合成、代谢起抑制、破坏作用，这与Stitt等[8]对肝片吸虫的研究符合。同时也提示对核酸代谢也有抑制作用。关于该药对虫体糖原含量的影响，在体内杀虫组与对照组间有显著减少，而在体外杀虫则无显著差异。这可能是因为体内杀虫组是在停药后3至5天测定，而体外杀虫组是在24小时之内，而糖原是水溶性的，在活虫有自身的屏障保护机制，而虫体死亡后屏障机制已消失，因此糖原可随虫体的水份而渗透出体外所致，而并非破坏虫体糖原的合成或代谢。关于三氯苯达唑对虫体蛋白质及核酸代谢破坏作用的进一步机理，以及对糖代谢是否确无影响，尚有待进一步研究。
, 百拇医药
(本工作蒙重庆医科大学刘约翰教授指导，并赠送药物，特此致谢)
许世锷(汕头大学医学院寄生虫学教研室 汕头，515031)
陆秀君(汕头大学医学院寄生虫学教研室 汕头，515031)
金立群(汕头大学医学院寄生虫学教研室 汕头，515031)
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, 百拇医药
3，Weber F， Buscher G， Buttner DW. The effect of triclabendazole on the lung flukes Paragonimus uterbilateralis in the experimental host sigmodin hispidus[J]. Trop Med Parasitol. 1988,39:322.
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, 百拇医药
6，高劲松，刘约翰，王小根，等.三氯苯达唑治疗家犬卫氏并殖吸虫感染的实验观察[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志， 1997，15(5)：263～265.
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