狂犬病毒抗原刺激小鼠的细胞免疫反应试验
艾智武 肖鼎昌
摘 要：为了研究狂犬病毒抗原刺激机体所产生的细胞介导免疫反应的抗病毒作用，我们利用小鼠进行试验。注射环磷酰胺(Cy)的小鼠再接种狂犬疫苗和稀释液，然后将其脾细胞转移到24小时前脑内接种1或1000 LD50狂犬病毒标准攻击毒(CVS)的同系小鼠，结果表明小鼠的脾细胞不仅可以转递抗狂犬病毒攻击的能力，而且可以转移“早期死亡”现象；另一方面，注射Cy的小鼠接种狂犬病毒抗原，两周后用CVS攻击，结果发现接种狂犬病毒抗原的小鼠有一定程度的保护作用，但中和试验结果阐明这些小鼠体内没有产生中和抗体，从而说明狂犬病毒抗原刺激所产生的细胞免疫作用有一定抗狂犬病毒攻击的能力。
关键词：狂犬病毒抗原 细胞免疫 狂犬病毒标准攻击毒 中和抗体
狂犬病是一种严重危害人们身体健康的病毒性疾病。接种过狂犬病毒抗原的机体，一般都能抵抗狂犬病毒的感染；然而疫苗处理无效的病例依然存在，虽然这些患者体内具有中和抗体[1，2]；而狂犬疫苗免疫后没有测到抗体的动物也能抵抗狂犬病毒的攻击[3，4]。大量的研究表明，在机体内的免疫过程中，T淋巴细胞不仅对产生体液抗体反应的B细胞起着控制作用，而且细胞介导的免疫反应在抵抗狂犬病毒感染方面也起到重要作用[5，6]。
, 百拇医药
我们利用小鼠作为实验动物，使用药物(Cy)来抑制小鼠的体液免疫反应，在同系小鼠间转移脾细胞，从而检测细胞免疫作用与抗病毒感染的关系。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物 NIH小鼠和C57/BL小鼠(本所实验动物室提供)。
1.1.2 狂犬病毒抗原
1.1.2.1 重组痘苗病毒 表达狂犬病毒糖蛋白的重组痘苗病毒经过鸡胚细胞培养[7]，滴度为2.4×107PFU。
1.1.2.2 地鼠肾组织培养狂犬疫苗(狂苗) 不低于2.5IU/ml(本所狂犬疫苗室提供)。
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1.1.2.3 狂犬病毒标准攻击毒(CVS) 1～1000LD50。
1.2 方法
1.2.1 小鼠早期死亡现象 腹腔注射 Cy (200mg/kg)的小鼠(18～20g)，两天后腹腔内接种狂苗或狂苗稀释液，24h后用大剂量 CVS (1000LD50)对小鼠进行脑内攻击，所有小鼠自攻击之日起记录死亡情况。
1.2.2 脾细胞转移试验 50只C57/BL小鼠腹腔注射Cy(200mg/kg)，两天后25只小鼠腹腔接种狂苗，同时另外25只小鼠腹腔接种等量的狂苗稀释液；所有小鼠在2、3、4、5天后杀死，收集脾细胞，并将107个脾细胞静脉注射转移到同系小鼠(该小鼠在24h前分别用1LD50和1000LD50CVS进行脑内攻击)，自攻击之日起记录所有小鼠的死亡情况。
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1.2.3 小鼠保护试验 NIH小鼠(18～20g)被分为5组，其中A组和B组小鼠腹腔注射Cy(200mg/kg)，2天后分别皮下接种重组痘苗病毒和狂苗，隔7天后再接种一次；而C组和D组小鼠未注射Cy，与A组和B组同时接种重组痘苗病毒和狂苗；E组的小鼠接种疫苗稀释液作为阴性对照；小鼠自第一次免疫14天后，采集部分小鼠的血清，并用100LD50的CVS脑内攻击剩余小鼠(0.03ml/只)，所有小鼠自攻击之日起记录死亡情况。
1.2.4 中和抗体检测 采用病毒中和试验[8]测定小鼠血清的抗体水平。
2 结果
2.1 小鼠的早期死亡现象 由于小鼠的体液免疫反应受到抑制，CVS攻击的时间较早，加之剂量较大，所以小鼠没有获得保护，在12天内全部死亡；但接种狂苗的小鼠组之死亡时间比接种稀释液的小鼠组死亡时间要提前一些，在第5天接种狂苗的小鼠已经有死亡，而对照组全部存活，从第6～10天接种狂苗的小鼠组之累积死亡率也明显地高于对照组，在第11、12天两组的累积死亡率基本相似(图1)。
, 百拇医药
图1 小鼠的累积死亡率与时间的关系
Picture 1 The relation of cumulative death rate and time
2.2 脾细胞在实验狂犬病过程中的作用 注射Cy并接种狂苗的小鼠脾细胞在同系小鼠之间进行转输后，受体小鼠就能抗低剂量狂犬病毒的攻击，即暴露感染狂犬病后，小鼠的脾细胞具有一定程度的保护作用(见表1)；然而，对于大剂量狂犬病毒攻击的小鼠，转移注射Cy并接种狂苗的脾细胞后可以将“早期死亡”现象从一只同系的供体小鼠转移到另一只受体小鼠(见表2)。
2.3 细胞免疫反应的抵抗病毒感染作用 注射Cy的A、B两组小鼠，疫苗免疫后血清不能中和病毒，接种的小鼠全部死亡，从而说明这两组小鼠免疫后没有产生抗狂犬病毒的中和抗体；C、D两组未注射Cy的小鼠血清有一定的中和病毒作用，接种的小鼠没有全部因患狂犬病而死亡，这表明该两组小鼠免疫后产生一定滴度的中和抗体。虽然A、B两组小鼠的体液免疫反应受到抑制，但是体内诱生的细胞免疫作用对狂犬病毒感染有一定程度的抵抗能力(表3)；阴性对照组(E组)小鼠因未接种狂犬病毒抗原，没有抵抗病毒攻击的能力，所以小鼠全部死亡。试验结果表明接种狂犬病毒抗原后小鼠不仅产生体液免疫反应，而且产生细胞免疫反应。
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表1 脾细胞转输的保护作用
Table 1 The possible protective role of splenocytes
脾细胞收获天数
供体的处理(组别)
受体小鼠的死亡率
2
疫苗组
0/5
对照组
3/4
3
疫苗组
, 百拇医药
0/5
对照组
2/5
4
疫苗组
0/5
对照组
2/4
5
疫苗组
0/5
对照组
2/5
, 百拇医药 表2 脾细胞转输对小鼠死亡时间的影响
Table 2Fuction of splenocytes on the death time of mice
脾细胞收获
天数
供体组别
攻击后不同天数死亡数
死亡率
5
6
7
8
9
, 百拇医药
10
2
疫苗免疫组
1
2
1
1
5/5
对照组
0
1
1
1
1
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1
5/5
3
疫苗免疫组
1
2
1
1
5/5
对照组
0
1
1
1
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1
1
5/5
4
疫苗免疫组
1
2
1
4/4
对照组
0
1
0
2
, 百拇医药
1
4/4
5
疫苗免疫组
2
1
1
1
5/5
对照组
1
1
0
1
, 百拇医药
1
1
5/5
表3 疫苗免疫小鼠的保护作用
Table 3 The protection of vaccine-immunization mice
小鼠组别
保护率(%)
一
二
三
A
75
, 百拇医药
75
66.7
B
44.4
55.6
75
C
100
100
87.5
D
75
100
, 百拇医药 90
E
0
0
注：一、二、三为3次试验结果
3 讨论
本文的结果与国外许多研究人员在小鼠体内的试验结果是一致的，即狂犬病毒抗原免疫后小鼠产生的中和抗体水平虽然很低，甚至没有可测的抗体，但却有很强的抗狂犬病毒感染的保护作用[3，4]；小鼠注射活的减毒狂犬病毒后，体内将产生强的、细胞介导的细胞毒反应，但街毒不能，而狂犬病毒株的毒力是与中和抗体和可溶性抗体或干扰素水平不相关的，效应T细胞作用的水平是直接与存活率相关的[9]。有的狂犬病人在临死前具有很高的抗体滴度，但仍免不了死亡，同时狂犬病人存在细胞免疫低下，但免疫球蛋白却正常；如果无胸腺小鼠接种无毒力的Flury HEP株狂犬病毒，或者无胸腺小鼠暴露狂犬病毒后接种狂犬病毒抗血清，那么将出现无胸腺小鼠全部死亡的结果[10]。因此狂犬病毒疫苗的免疫效果在考虑中和抗体水平的同时，也不应该忽视抗原免疫机体后的细胞免疫反应。
, http://www.100md.com
当用从小鼠脑制备的灭活狂犬病毒疫苗暴露后处理机体，在某些病例中发生过早期死亡现象[11，12]；正如本试验中注射Cy的小鼠所表现出的症状一样，也将死亡时间提前，这种现象可能与不良免疫反应有关，这也许是小鼠脾的免疫病理学作用[9，13]。在暴露狂犬病毒前由灭活狂苗诱生的高水平病毒中和抗体给予机体抗随后致死性狂犬病毒感染的完全保护；但是，暴露后处理的保护效应仅仅是由疫苗诱生的，而不完全是由于抗体的作用，特异性细胞介导的免疫性可能也是宿主防御的关键因素之一。
大量资料表明，体液免疫反应和细胞免疫反应是相辅相成、缺一不可的。机体抗CVS攻击的保护可能是体液免疫反应和细胞免疫反应共同作用的结果，在某种意义上，细胞免疫反应的意义更值得我们考虑。因此，需要加强狂犬病细胞免疫研究，提高细胞免疫反应在抗狂犬病效应的重要地位。
艾智武(卫生部武汉生物制品研究所 武汉，430060)
, http://www.100md.com
肖鼎昌(卫生部武汉生物制品研究所 武汉，430060)
参考文献
1，Fekadu M,et al.J Virol，1992，66(5)∶2601.
2，Fekadu M,et al.Am J Vet Res，1984，45∶724.
3，Prever L,et al.J Infect Dis，1990，161∶27.
4，Bunschoten H,et al.J Gen Virol，1989，70∶1513.
5，Kawano H,et al.J Gen Virol，1990，71∶281.
, http://www.100md.com
6，林枫，等.病毒学报，1992，8(3)∶210.
7，WHO Expert Committee on Rabies Seventh Report.WHO,Geneva,1984,28.
8，Shope R E,et al.J Infect Dis，1979，140(3)∶431.
9，黎天德.新医学杂志，1996，27(3)∶167.
10，Baer G M,et al.J Infect Dis，1972，125∶520.
11，Wiktor T J,et al.J Infect Dis，1976，133∶260.
12，Blancou H,et al.In:The Natural History of Rabies[M].vo12(Ed-G.M.Baer),Academic Press,New York 1980,179.
13，Mifune K,et al.Microbiol and Immunol，1981，25∶895., 百拇医药
摘 要：为了研究狂犬病毒抗原刺激机体所产生的细胞介导免疫反应的抗病毒作用，我们利用小鼠进行试验。注射环磷酰胺(Cy)的小鼠再接种狂犬疫苗和稀释液，然后将其脾细胞转移到24小时前脑内接种1或1000 LD50狂犬病毒标准攻击毒(CVS)的同系小鼠，结果表明小鼠的脾细胞不仅可以转递抗狂犬病毒攻击的能力，而且可以转移“早期死亡”现象；另一方面，注射Cy的小鼠接种狂犬病毒抗原，两周后用CVS攻击，结果发现接种狂犬病毒抗原的小鼠有一定程度的保护作用，但中和试验结果阐明这些小鼠体内没有产生中和抗体，从而说明狂犬病毒抗原刺激所产生的细胞免疫作用有一定抗狂犬病毒攻击的能力。
关键词：狂犬病毒抗原 细胞免疫 狂犬病毒标准攻击毒 中和抗体
狂犬病是一种严重危害人们身体健康的病毒性疾病。接种过狂犬病毒抗原的机体，一般都能抵抗狂犬病毒的感染；然而疫苗处理无效的病例依然存在，虽然这些患者体内具有中和抗体[1，2]；而狂犬疫苗免疫后没有测到抗体的动物也能抵抗狂犬病毒的攻击[3，4]。大量的研究表明，在机体内的免疫过程中，T淋巴细胞不仅对产生体液抗体反应的B细胞起着控制作用，而且细胞介导的免疫反应在抵抗狂犬病毒感染方面也起到重要作用[5，6]。
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我们利用小鼠作为实验动物，使用药物(Cy)来抑制小鼠的体液免疫反应，在同系小鼠间转移脾细胞，从而检测细胞免疫作用与抗病毒感染的关系。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物 NIH小鼠和C57/BL小鼠(本所实验动物室提供)。
1.1.2 狂犬病毒抗原
1.1.2.1 重组痘苗病毒 表达狂犬病毒糖蛋白的重组痘苗病毒经过鸡胚细胞培养[7]，滴度为2.4×107PFU。
1.1.2.2 地鼠肾组织培养狂犬疫苗(狂苗) 不低于2.5IU/ml(本所狂犬疫苗室提供)。
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1.1.2.3 狂犬病毒标准攻击毒(CVS) 1～1000LD50。
1.2 方法
1.2.1 小鼠早期死亡现象 腹腔注射 Cy (200mg/kg)的小鼠(18～20g)，两天后腹腔内接种狂苗或狂苗稀释液，24h后用大剂量 CVS (1000LD50)对小鼠进行脑内攻击，所有小鼠自攻击之日起记录死亡情况。
1.2.2 脾细胞转移试验 50只C57/BL小鼠腹腔注射Cy(200mg/kg)，两天后25只小鼠腹腔接种狂苗，同时另外25只小鼠腹腔接种等量的狂苗稀释液；所有小鼠在2、3、4、5天后杀死，收集脾细胞，并将107个脾细胞静脉注射转移到同系小鼠(该小鼠在24h前分别用1LD50和1000LD50CVS进行脑内攻击)，自攻击之日起记录所有小鼠的死亡情况。
, http://www.100md.com
1.2.3 小鼠保护试验 NIH小鼠(18～20g)被分为5组，其中A组和B组小鼠腹腔注射Cy(200mg/kg)，2天后分别皮下接种重组痘苗病毒和狂苗，隔7天后再接种一次；而C组和D组小鼠未注射Cy，与A组和B组同时接种重组痘苗病毒和狂苗；E组的小鼠接种疫苗稀释液作为阴性对照；小鼠自第一次免疫14天后，采集部分小鼠的血清，并用100LD50的CVS脑内攻击剩余小鼠(0.03ml/只)，所有小鼠自攻击之日起记录死亡情况。
1.2.4 中和抗体检测 采用病毒中和试验[8]测定小鼠血清的抗体水平。
2 结果
2.1 小鼠的早期死亡现象 由于小鼠的体液免疫反应受到抑制，CVS攻击的时间较早，加之剂量较大，所以小鼠没有获得保护，在12天内全部死亡；但接种狂苗的小鼠组之死亡时间比接种稀释液的小鼠组死亡时间要提前一些，在第5天接种狂苗的小鼠已经有死亡，而对照组全部存活，从第6～10天接种狂苗的小鼠组之累积死亡率也明显地高于对照组，在第11、12天两组的累积死亡率基本相似(图1)。
, 百拇医药
图1 小鼠的累积死亡率与时间的关系
Picture 1 The relation of cumulative death rate and time
2.2 脾细胞在实验狂犬病过程中的作用 注射Cy并接种狂苗的小鼠脾细胞在同系小鼠之间进行转输后，受体小鼠就能抗低剂量狂犬病毒的攻击，即暴露感染狂犬病后，小鼠的脾细胞具有一定程度的保护作用(见表1)；然而，对于大剂量狂犬病毒攻击的小鼠，转移注射Cy并接种狂苗的脾细胞后可以将“早期死亡”现象从一只同系的供体小鼠转移到另一只受体小鼠(见表2)。
2.3 细胞免疫反应的抵抗病毒感染作用 注射Cy的A、B两组小鼠，疫苗免疫后血清不能中和病毒，接种的小鼠全部死亡，从而说明这两组小鼠免疫后没有产生抗狂犬病毒的中和抗体；C、D两组未注射Cy的小鼠血清有一定的中和病毒作用，接种的小鼠没有全部因患狂犬病而死亡，这表明该两组小鼠免疫后产生一定滴度的中和抗体。虽然A、B两组小鼠的体液免疫反应受到抑制，但是体内诱生的细胞免疫作用对狂犬病毒感染有一定程度的抵抗能力(表3)；阴性对照组(E组)小鼠因未接种狂犬病毒抗原，没有抵抗病毒攻击的能力，所以小鼠全部死亡。试验结果表明接种狂犬病毒抗原后小鼠不仅产生体液免疫反应，而且产生细胞免疫反应。
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表1 脾细胞转输的保护作用
Table 1 The possible protective role of splenocytes
脾细胞收获天数
供体的处理(组别)
受体小鼠的死亡率
2
疫苗组
0/5
对照组
3/4
3
疫苗组
, 百拇医药
0/5
对照组
2/5
4
疫苗组
0/5
对照组
2/4
5
疫苗组
0/5
对照组
2/5
, 百拇医药 表2 脾细胞转输对小鼠死亡时间的影响
Table 2Fuction of splenocytes on the death time of mice
脾细胞收获
天数
供体组别
攻击后不同天数死亡数
死亡率
5
6
7
8
9
, 百拇医药
10
2
疫苗免疫组
1
2
1
1
5/5
对照组
0
1
1
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1
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疫苗免疫组
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对照组
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疫苗免疫组
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1
1
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对照组
1
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0
1
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1
1
5/5
表3 疫苗免疫小鼠的保护作用
Table 3 The protection of vaccine-immunization mice
小鼠组别
保护率(%)
一
二
三
A
75
, 百拇医药
75
66.7
B
44.4
55.6
75
C
100
100
87.5
D
75
100
, 百拇医药 90
E
0
0
注：一、二、三为3次试验结果
3 讨论
本文的结果与国外许多研究人员在小鼠体内的试验结果是一致的，即狂犬病毒抗原免疫后小鼠产生的中和抗体水平虽然很低，甚至没有可测的抗体，但却有很强的抗狂犬病毒感染的保护作用[3，4]；小鼠注射活的减毒狂犬病毒后，体内将产生强的、细胞介导的细胞毒反应，但街毒不能，而狂犬病毒株的毒力是与中和抗体和可溶性抗体或干扰素水平不相关的，效应T细胞作用的水平是直接与存活率相关的[9]。有的狂犬病人在临死前具有很高的抗体滴度，但仍免不了死亡，同时狂犬病人存在细胞免疫低下，但免疫球蛋白却正常；如果无胸腺小鼠接种无毒力的Flury HEP株狂犬病毒，或者无胸腺小鼠暴露狂犬病毒后接种狂犬病毒抗血清，那么将出现无胸腺小鼠全部死亡的结果[10]。因此狂犬病毒疫苗的免疫效果在考虑中和抗体水平的同时，也不应该忽视抗原免疫机体后的细胞免疫反应。
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当用从小鼠脑制备的灭活狂犬病毒疫苗暴露后处理机体，在某些病例中发生过早期死亡现象[11，12]；正如本试验中注射Cy的小鼠所表现出的症状一样，也将死亡时间提前，这种现象可能与不良免疫反应有关，这也许是小鼠脾的免疫病理学作用[9，13]。在暴露狂犬病毒前由灭活狂苗诱生的高水平病毒中和抗体给予机体抗随后致死性狂犬病毒感染的完全保护；但是，暴露后处理的保护效应仅仅是由疫苗诱生的，而不完全是由于抗体的作用，特异性细胞介导的免疫性可能也是宿主防御的关键因素之一。
大量资料表明，体液免疫反应和细胞免疫反应是相辅相成、缺一不可的。机体抗CVS攻击的保护可能是体液免疫反应和细胞免疫反应共同作用的结果，在某种意义上，细胞免疫反应的意义更值得我们考虑。因此，需要加强狂犬病细胞免疫研究，提高细胞免疫反应在抗狂犬病效应的重要地位。
艾智武(卫生部武汉生物制品研究所 武汉，430060)
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肖鼎昌(卫生部武汉生物制品研究所 武汉，430060)
参考文献
1，Fekadu M,et al.J Virol，1992，66(5)∶2601.
2，Fekadu M,et al.Am J Vet Res，1984，45∶724.
3，Prever L,et al.J Infect Dis，1990，161∶27.
4，Bunschoten H,et al.J Gen Virol，1989，70∶1513.
5，Kawano H,et al.J Gen Virol，1990，71∶281.
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6，林枫，等.病毒学报，1992，8(3)∶210.
7，WHO Expert Committee on Rabies Seventh Report.WHO,Geneva,1984,28.
8，Shope R E,et al.J Infect Dis，1979，140(3)∶431.
9，黎天德.新医学杂志，1996，27(3)∶167.
10，Baer G M,et al.J Infect Dis，1972，125∶520.
11，Wiktor T J,et al.J Infect Dis，1976，133∶260.
12，Blancou H,et al.In:The Natural History of Rabies[M].vo12(Ed-G.M.Baer),Academic Press,New York 1980,179.
13，Mifune K,et al.Microbiol and Immunol，1981，25∶895., 百拇医药