肾细胞癌FHIT基因蛋白编码外显子突变的研究
作者：刘本春 丁强 王忠 张元芳
单位：上海医科大学泌尿外科研究所 华山医院泌尿外科，上海，200040
关键词：癌；肾细胞；FHIT基因；聚合酶链反应；Southern blot技术
临床泌尿外科杂志000813 摘要 目的：检测肾细胞癌(RCC)组织FHIT基因(fragile histidine triad)蛋白编码外显子异常情况，了解RCC中FHIT基因异常特征，探讨FHIT 基因与RCC发生的关系。方法：收集RCC及相应癌周肾组织标本22份和16份，提取组织DNA。DIG标记FHIT全长cDNA探针。PCR扩增FHIT基因E5～E9，产物行Southern blot杂交。结果：15份(68.2%)癌组织标本、6份(37.5%)癌周肾组织标本存在FHIT基因蛋白编码外显子缺失或突变，其中10份同时存在两个外显子异常改变。癌组织及癌周肾组织E5异常(含缺失、异常)发生率分别为40.9%(9/22)和25.0%(4/16)。结论：FHIT基因异常可能是RCC发生过程中的早期事件。
, 百拇医药
Alterations of the human FHIT gene in renal cell carcinoma
LIU Ben-chun DING Qiang WANG Zhong ZHANG Yuan-fang
(Department of Urology, Huashan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200040)
Abstract Purpose:To detect aberrant of FHIT gene(fragile histidine traid) exons in tissues of RCCs(renal cell carcinoma), surrounding RCCs, and normal kidney, in order to understand the feature of FHIT gene exones alteration in RCC, to inquire into the relationship between FHIT gene and development of RCC.Methods:A total of 22 RCCs and 14 surrounding tissues were obtained from surgical specimens. PCR (polymerase chain reaction) amplications of individual FHIT exons were carried out. PCR products were hybridized with DIG-labeled cDNA probes.Results:Sixty-eight percent of RCCs (15/22) and 37.5% (6/16) of surrounding cancer tissues have deletion or aberrant of FHIT exons for protein, and abnormal of FHIT E5 and E8 are much more common than other exons for protein. These alterations usually involve more than one locus of FHIT exon.Conclusion:Lesions at the FHIT DNA level may be the early event in the development of RCC.
, 百拇医药
Key words Carcinoma,kidney cell FHIT gene PCR Southern blot
肿瘤遗传学研究发现，人类肾细胞癌(RCC)组织中常存在3号染色体短臂(3p)杂合性缺失(Loss of heterozygosity，LOH)，尤其集中在3p14、3p21和3p25〔1〕。继肿瘤抑制基因VHL(位于3p25)发现后，Ohta等于1996年成功克隆了位于3 p 14.2的FHIT(Fragile histidine triad)基因，并发现人类食道癌、头颈部癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、宫颈癌及相应细胞株中存在较高频率的FHIT基因异常转录产物〔2～5〕。本实验采用PCR和Southern blot杂交技术检测RCC组织中FHIT基因蛋白编码外显子缺失或突变情况，并与相应癌周及正常肾组织者相比，以明确RCC中FHIT基因异常特征，探讨FHIT基因与RCC发生发展的关系。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 实验标本
收集1996年9月～1997年12月在我院行手术治疗的原发性RCC标本22份，男16份，女6份，年龄38～71岁，平均54.5岁。所有标本均经病理检查证实，其中透明细胞癌19份，颗粒细胞癌1份，混合细胞癌2份。组织学分级I级12份，II级7份，III级3份。按照Robson临床分期，I期6份，II期9份，III期4份，IV期3份。按国际抗癌联盟(UICC)的TNM临床分期系统，为T1～3bN0～2M0～1。同时采集16份距癌灶边界3cm以上的肾组织，尽快置于Eppendorff管内，放入液氮中快速冷冻并保存待用。另取4份因外伤行肾切除的正常肾组织作为对照(排除肿瘤可能)。
1.2 实验方法
提取组织DNA，参照FHIT cDNA序列设计PCR引物〔6〕。FHIT cDNA探针制备，作PCR扩增及电泳结果评定。Southern blot杂交及检测按试剂盒说明进行操作。
, 百拇医药
2 结果
2.1 PCR产物电泳分析结果
采用针对FHIT基因蛋白编码外显子E5、E6、E7、E8、E9特异性引物序列对22份RCC组织、16份癌周肾组织及4份正常肾组织行PCR扩增，结果发现15份(68.2%)癌组织存在FHIT基因蛋白编码外显子缺失或异常，其中10份同时存在2个外显子异常改变，即5份癌组织中同时存在E5、E6异常，3份同时存在E5、E8异常，1份同时存在E6、E7异常，1份同时存在E8、E9异常。6份(37.5%)癌周肾组织存在FHIT基因蛋白编码外显子缺失或异常。癌组织及癌周肾组织中FHIT基因E5异常(含缺失、异常)发生率分别为40.9%(9/22)和25.0%(4/16)，E6为27.3%(6/22)和12.5%(2/16)，E8为36.4%(8/22)和12.5%(2/16)(表1)。4份正常肾组织中，1份出现E9异常PCR扩增条带。另外，1份RCC组织同时存在E7正常(野生型)及异常PCR扩增产物。
, 百拇医药
所有标本经PCR扩增检测β-actin均见244 bp条带，所有阴性对照结果未见PCR产物生成。
表1 FHIT基因蛋白编码外显子PCR产物电泳分析结果 FHIT基因
外显子
癌周肾组织(n=16)
癌组织(n=22)
正常
缺失
异常
正常
缺失
异常
, 百拇医药
E5
12
3
1
13
6
3
E6
14
1
1
16
4
2
, 百拇医药
E7
15
1
0
20
1
1
E8
14
2
0
14
6
2
, 百拇医药
E9
16
0
0
21
1
0
非野生型扩增片段
2.2 Southern blot杂交结果
经电泳后转膜的PCR产物与DIG标记FHIT cDNA探针杂交，所有条带均呈阳性，证实PCR产物为FHIT基因片段(图1)。
, 百拇医药
图1 PCR产物与FHIT cDNA探针杂交，所有条带均呈阳性
3 讨论
3.1 PCR扩增靶标的选择
结构和功能研究表明，FHIT基因位于3p 14.2，大小约1 Mb，具有10个外显子，其开放阅读框架(ORF)由E5～E9组成，编码1.1 kb的mRNA，生成分子量为16 800、具有多磷酸二腺苷水解酶活性的蛋白产物〔2，7〕。肿瘤分子生物学和分子遗传学研究发现，FHIT基因缺失或异常表达见于人类多种原发性肿瘤和肿瘤细胞株〔2～5，8，9〕。外显子异常最易累及的是E5，该外显子含有转录起始密码，突变或缺失将导致基因产物失表达。E8含组氨酸三联体(HIT)编码序列，对蛋白产物的功能至关重要〔7〕。故本实验选择E5～E9整个ORF涉及的蛋白编码外显子为靶标，检测其在RCC组织中的结构变化，以探讨FHIT基因异常与RCC的关系。
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3.2 RCC组织中FHIT基因的异常改变
多种肿瘤的发生、发展过程涉及细胞基因的异常改变，包括特定序列的缺失、点突变、插入或染色体重排。目前多数研究提示，FHIT基因可能是一种涉及人类多种常见肿瘤的肿瘤抑制基因〔1～5〕，但其极少发生点突变〔10〕。有研究表明，肺癌、宫颈癌、胃癌等组织中FHIT基因E5和E8是最常发生异常的蛋白编码外显子〔10～12〕。
本实验采用特异性寡核苷酸引物分别行PCR扩增FHIT基因蛋白编码外显子，并经Southern blot杂交证实PCR产物为FHIT基因序列，结果发现RCC组织中FHIT基因蛋白编码外显子的异常情况与其他常见肿瘤者相似，即存在较高频率的缺失或突变现象。同时发现，与正常肾组织相比，部分癌周肾组织FHIT基因蛋白编码外显子已经出现异常改变，提示FHIT基因异常可能是RCC发生过程中的早期事件，支持FHIT为肿瘤抑制基因。另外，1份RCC组织中同时存在FHIT E7正常及异常PCR扩增产物，可能是肿瘤组织标本受到正常组织细胞的污染，或是由肿瘤细胞异质性导致，即部分癌细胞可含有完全正常的FHIT等位基因，而另一些癌细胞则存在FHIT等位基因的突变或缺失。亦有人认为，两种不同扩增片段可能为同一等位基因编码产物经不同剪切过程所致。
, 百拇医药
RCC组织中存在FHIT基因异常的大多数病例涉及多个位点，提示RCC的发生是一种涉及诸多遗传性改变的复杂过程。如能将FHIT基因与其他肿瘤相关基因如P53、nm23、P16等进行同步分析，则可更准确地反映RCC的生物学行为。
参考文献
1，Druck T, Kastury K, Hadaczek P, et al. Loss of heterozygosity at the familial RCC t(3;8) locus in most clear cell carcinomas. Cancer Res,1995,55:5348～5353
2，Ohta M, Inoue H, Cotticelli M G, et al. The FHIT gene, spanning the chromosome 3p14.2 fragile site and renal carcinoma-associated t(3;8) breakpoint, is abnormal in digestive tract cancers. Cell,1996,84:587～597
, 百拇医药
3，Sozzi G, Veronese M L, Negrini M, et al. The FHIT gene at 3p14.2 is abnormal in lung cancer. Cell,1996,85:17～26
4，Sozzi G,Tornielli S,Tagliabue E, et al. Absence of fhit protein in primary lung tumors and cell lines with FHIT gene abnormalities. Cancer Res,1997,57:5207～5212
5，Jicher K, Marguitan G, Werner N, et al. Novel tumor suppressor locus in human chromosome region 3p14.2. J Natl Cancer Inst,1999,91:1563～1568
, 百拇医药
6，Mao L. Tumor suppressor genes: does FHIT fit? J Natl Cancer Inst,1998,90:412～414
7，Barnes L D, Garrison P N, Siprashvili Z, et al. FHIT, a putative tumor suppressor in humans, is a dinucleoside 5′,5-P1,P3-triphosphate hydrolase. Biochemistry,1996,35:11529～11535
8，Kastury K, Baffa R, Druck T, et al. Potential gastric intestinal tumor suppressor locus at the 3p14.2 FRA3B site identified by homozygose deletions in tumor cell lines. Cancer Res,1996,56:978～983
, http://www.100md.com
9，Van den Berg A，Buys C H C M. Involvement of Multiple loci on chromosome 3 in renal cell cancer development. Genes Chromosom Cancer,1997,19:59～76
10，Druck T, Hadaczek P, Fu T B, et al. Structure and expression of the human FHIT gene in normal and tumor cells. Cancer Res,1997,57:504～512
11，Greenspan D L, Connolly D C, Wu R, et al. Loss of FHIT expression in cervical carcinoma cell lines and primary tumors. Cancer Res,1997,57:4692～4698
12，Fong K M, Biesterveld E J, Virmani A, et al. FHIT and FRA3B 3p14.2 allele loss are common in lung cancer and preneoplastic bronchial lesions and are associated with cancer-related FHIT cDNA splicing aberrations. Cancer Res,1997,57:2256～2267
收稿 1999-12-28 修回 2000-03-28, 百拇医药
单位：上海医科大学泌尿外科研究所 华山医院泌尿外科，上海，200040
关键词：癌；肾细胞；FHIT基因；聚合酶链反应；Southern blot技术
临床泌尿外科杂志000813 摘要 目的：检测肾细胞癌(RCC)组织FHIT基因(fragile histidine triad)蛋白编码外显子异常情况，了解RCC中FHIT基因异常特征，探讨FHIT 基因与RCC发生的关系。方法：收集RCC及相应癌周肾组织标本22份和16份，提取组织DNA。DIG标记FHIT全长cDNA探针。PCR扩增FHIT基因E5～E9，产物行Southern blot杂交。结果：15份(68.2%)癌组织标本、6份(37.5%)癌周肾组织标本存在FHIT基因蛋白编码外显子缺失或突变，其中10份同时存在两个外显子异常改变。癌组织及癌周肾组织E5异常(含缺失、异常)发生率分别为40.9%(9/22)和25.0%(4/16)。结论：FHIT基因异常可能是RCC发生过程中的早期事件。
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Alterations of the human FHIT gene in renal cell carcinoma
LIU Ben-chun DING Qiang WANG Zhong ZHANG Yuan-fang
(Department of Urology, Huashan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200040)
Abstract Purpose:To detect aberrant of FHIT gene(fragile histidine traid) exons in tissues of RCCs(renal cell carcinoma), surrounding RCCs, and normal kidney, in order to understand the feature of FHIT gene exones alteration in RCC, to inquire into the relationship between FHIT gene and development of RCC.Methods:A total of 22 RCCs and 14 surrounding tissues were obtained from surgical specimens. PCR (polymerase chain reaction) amplications of individual FHIT exons were carried out. PCR products were hybridized with DIG-labeled cDNA probes.Results:Sixty-eight percent of RCCs (15/22) and 37.5% (6/16) of surrounding cancer tissues have deletion or aberrant of FHIT exons for protein, and abnormal of FHIT E5 and E8 are much more common than other exons for protein. These alterations usually involve more than one locus of FHIT exon.Conclusion:Lesions at the FHIT DNA level may be the early event in the development of RCC.
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Key words Carcinoma,kidney cell FHIT gene PCR Southern blot
肿瘤遗传学研究发现，人类肾细胞癌(RCC)组织中常存在3号染色体短臂(3p)杂合性缺失(Loss of heterozygosity，LOH)，尤其集中在3p14、3p21和3p25〔1〕。继肿瘤抑制基因VHL(位于3p25)发现后，Ohta等于1996年成功克隆了位于3 p 14.2的FHIT(Fragile histidine triad)基因，并发现人类食道癌、头颈部癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、宫颈癌及相应细胞株中存在较高频率的FHIT基因异常转录产物〔2～5〕。本实验采用PCR和Southern blot杂交技术检测RCC组织中FHIT基因蛋白编码外显子缺失或突变情况，并与相应癌周及正常肾组织者相比，以明确RCC中FHIT基因异常特征，探讨FHIT基因与RCC发生发展的关系。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 实验标本
收集1996年9月～1997年12月在我院行手术治疗的原发性RCC标本22份，男16份，女6份，年龄38～71岁，平均54.5岁。所有标本均经病理检查证实，其中透明细胞癌19份，颗粒细胞癌1份，混合细胞癌2份。组织学分级I级12份，II级7份，III级3份。按照Robson临床分期，I期6份，II期9份，III期4份，IV期3份。按国际抗癌联盟(UICC)的TNM临床分期系统，为T1～3bN0～2M0～1。同时采集16份距癌灶边界3cm以上的肾组织，尽快置于Eppendorff管内，放入液氮中快速冷冻并保存待用。另取4份因外伤行肾切除的正常肾组织作为对照(排除肿瘤可能)。
1.2 实验方法
提取组织DNA，参照FHIT cDNA序列设计PCR引物〔6〕。FHIT cDNA探针制备，作PCR扩增及电泳结果评定。Southern blot杂交及检测按试剂盒说明进行操作。
, 百拇医药
2 结果
2.1 PCR产物电泳分析结果
采用针对FHIT基因蛋白编码外显子E5、E6、E7、E8、E9特异性引物序列对22份RCC组织、16份癌周肾组织及4份正常肾组织行PCR扩增，结果发现15份(68.2%)癌组织存在FHIT基因蛋白编码外显子缺失或异常，其中10份同时存在2个外显子异常改变，即5份癌组织中同时存在E5、E6异常，3份同时存在E5、E8异常，1份同时存在E6、E7异常，1份同时存在E8、E9异常。6份(37.5%)癌周肾组织存在FHIT基因蛋白编码外显子缺失或异常。癌组织及癌周肾组织中FHIT基因E5异常(含缺失、异常)发生率分别为40.9%(9/22)和25.0%(4/16)，E6为27.3%(6/22)和12.5%(2/16)，E8为36.4%(8/22)和12.5%(2/16)(表1)。4份正常肾组织中，1份出现E9异常PCR扩增条带。另外，1份RCC组织同时存在E7正常(野生型)及异常PCR扩增产物。
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所有标本经PCR扩增检测β-actin均见244 bp条带，所有阴性对照结果未见PCR产物生成。
表1 FHIT基因蛋白编码外显子PCR产物电泳分析结果 FHIT基因
外显子
癌周肾组织(n=16)
癌组织(n=22)
正常
缺失
异常
正常
缺失
异常
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E5
12
3
1
13
6
3
E6
14
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, 百拇医药
E7
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E8
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2
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E9
16
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0
非野生型扩增片段
2.2 Southern blot杂交结果
经电泳后转膜的PCR产物与DIG标记FHIT cDNA探针杂交，所有条带均呈阳性，证实PCR产物为FHIT基因片段(图1)。
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图1 PCR产物与FHIT cDNA探针杂交，所有条带均呈阳性
3 讨论
3.1 PCR扩增靶标的选择
结构和功能研究表明，FHIT基因位于3p 14.2，大小约1 Mb，具有10个外显子，其开放阅读框架(ORF)由E5～E9组成，编码1.1 kb的mRNA，生成分子量为16 800、具有多磷酸二腺苷水解酶活性的蛋白产物〔2，7〕。肿瘤分子生物学和分子遗传学研究发现，FHIT基因缺失或异常表达见于人类多种原发性肿瘤和肿瘤细胞株〔2～5，8，9〕。外显子异常最易累及的是E5，该外显子含有转录起始密码，突变或缺失将导致基因产物失表达。E8含组氨酸三联体(HIT)编码序列，对蛋白产物的功能至关重要〔7〕。故本实验选择E5～E9整个ORF涉及的蛋白编码外显子为靶标，检测其在RCC组织中的结构变化，以探讨FHIT基因异常与RCC的关系。
, http://www.100md.com
3.2 RCC组织中FHIT基因的异常改变
多种肿瘤的发生、发展过程涉及细胞基因的异常改变，包括特定序列的缺失、点突变、插入或染色体重排。目前多数研究提示，FHIT基因可能是一种涉及人类多种常见肿瘤的肿瘤抑制基因〔1～5〕，但其极少发生点突变〔10〕。有研究表明，肺癌、宫颈癌、胃癌等组织中FHIT基因E5和E8是最常发生异常的蛋白编码外显子〔10～12〕。
本实验采用特异性寡核苷酸引物分别行PCR扩增FHIT基因蛋白编码外显子，并经Southern blot杂交证实PCR产物为FHIT基因序列，结果发现RCC组织中FHIT基因蛋白编码外显子的异常情况与其他常见肿瘤者相似，即存在较高频率的缺失或突变现象。同时发现，与正常肾组织相比，部分癌周肾组织FHIT基因蛋白编码外显子已经出现异常改变，提示FHIT基因异常可能是RCC发生过程中的早期事件，支持FHIT为肿瘤抑制基因。另外，1份RCC组织中同时存在FHIT E7正常及异常PCR扩增产物，可能是肿瘤组织标本受到正常组织细胞的污染，或是由肿瘤细胞异质性导致，即部分癌细胞可含有完全正常的FHIT等位基因，而另一些癌细胞则存在FHIT等位基因的突变或缺失。亦有人认为，两种不同扩增片段可能为同一等位基因编码产物经不同剪切过程所致。
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RCC组织中存在FHIT基因异常的大多数病例涉及多个位点，提示RCC的发生是一种涉及诸多遗传性改变的复杂过程。如能将FHIT基因与其他肿瘤相关基因如P53、nm23、P16等进行同步分析，则可更准确地反映RCC的生物学行为。
参考文献
1，Druck T, Kastury K, Hadaczek P, et al. Loss of heterozygosity at the familial RCC t(3;8) locus in most clear cell carcinomas. Cancer Res,1995,55:5348～5353
2，Ohta M, Inoue H, Cotticelli M G, et al. The FHIT gene, spanning the chromosome 3p14.2 fragile site and renal carcinoma-associated t(3;8) breakpoint, is abnormal in digestive tract cancers. Cell,1996,84:587～597
, 百拇医药
3，Sozzi G, Veronese M L, Negrini M, et al. The FHIT gene at 3p14.2 is abnormal in lung cancer. Cell,1996,85:17～26
4，Sozzi G,Tornielli S,Tagliabue E, et al. Absence of fhit protein in primary lung tumors and cell lines with FHIT gene abnormalities. Cancer Res,1997,57:5207～5212
5，Jicher K, Marguitan G, Werner N, et al. Novel tumor suppressor locus in human chromosome region 3p14.2. J Natl Cancer Inst,1999,91:1563～1568
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6，Mao L. Tumor suppressor genes: does FHIT fit? J Natl Cancer Inst,1998,90:412～414
7，Barnes L D, Garrison P N, Siprashvili Z, et al. FHIT, a putative tumor suppressor in humans, is a dinucleoside 5′,5-P1,P3-triphosphate hydrolase. Biochemistry,1996,35:11529～11535
8，Kastury K, Baffa R, Druck T, et al. Potential gastric intestinal tumor suppressor locus at the 3p14.2 FRA3B site identified by homozygose deletions in tumor cell lines. Cancer Res,1996,56:978～983
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9，Van den Berg A，Buys C H C M. Involvement of Multiple loci on chromosome 3 in renal cell cancer development. Genes Chromosom Cancer,1997,19:59～76
10，Druck T, Hadaczek P, Fu T B, et al. Structure and expression of the human FHIT gene in normal and tumor cells. Cancer Res,1997,57:504～512
11，Greenspan D L, Connolly D C, Wu R, et al. Loss of FHIT expression in cervical carcinoma cell lines and primary tumors. Cancer Res,1997,57:4692～4698
12，Fong K M, Biesterveld E J, Virmani A, et al. FHIT and FRA3B 3p14.2 allele loss are common in lung cancer and preneoplastic bronchial lesions and are associated with cancer-related FHIT cDNA splicing aberrations. Cancer Res,1997,57:2256～2267
收稿 1999-12-28 修回 2000-03-28, 百拇医药
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