新生儿感染时外周血中性粒细胞功能异常膜分子机制研究
作者：陈晶 许东琳 李珊 吴惠毅 梁文学
单位：陈晶 许东琳 李珊(222002 连云港市第一人民医院儿科)；吴惠毅 梁文学(临床医学实验研究中心)
关键词：婴儿，新生；败血症；肺炎；中性粒细胞膜流动性
江苏医药000820 【摘要】 目的 探讨新生儿感染时外周血中性粒细胞(PMN)功能异常的膜分子机制。方法 应用DPH荧光探针标记PMN膜，荧光偏振法测定51例感染新生儿(其中败血症28例、肺炎23例)、19例健康新生儿PMN膜流动性。结果 感染新生儿PMN流动性较对照组比较显著降低(P<0.01)，尤以败血症更为明显；相关分析结果表明，PMN膜微粘度(η)与吞噬、杀菌率呈负相关，相关系数(γ)分别为-0.301(P<0.05)、-0.256(P<0.05)。结论 PMN膜流动性降低是造成感染新生儿PMN吞噬、杀菌功能降低的重要原因。
, http://www.100md.com
为了探讨新生儿感染外周血PMN功能异常的膜分子机制，我们应用荧光探针标记技术研究了膜流动性变化及其与吞噬、杀菌功能的关系，现报道如下。
对象和方法
一、对象
19例健康新生儿来自我院产房婴儿室，51例感染新生儿来自我院儿科新生儿病房，病种分布为败血症28例(血培养均阳性，其中金黄色葡萄球菌14例；表皮葡萄球菌7例；克雷伯氏肺炎杆菌2例；溶血性链球菌3例，埃希氏大肠杆菌2例)；肺炎23例，诊断标准按1987年上海会议制定的诊断标准。
二、方法
健康新生儿采集股静脉血2 ml，感染新生儿均于入院治疗前取静脉血2 ml，EDTA-Na2抗凝，标本采集后立即送院中心实验室。将EDTA-Na2抗凝血叠加于淋巴细胞分离液(中科院上海化学试剂厂生产)上，3 000 r/min离心20分钟，取沉淀细胞加等量3%Dextran-500(T500，Pharmacia产品)混匀，37℃直立放置30 min，然后取富含PMN层，低渗法溶解残存的红细胞，用1640培养液(Sigma公司产品)洗涤细胞3次，配成2×106/ml浓度，涂片鉴定PMN纯度>95%，台盼蓝拒染法计算活力为99%。
, 百拇医药
1.PMN膜流动性测定：应用DPH(1，6-Diphenyl-1，3，5 hexatriene Sigma公司产品)作为荧光探针标记PMN，荧光偏振法[3]测定PMN膜流动性，取新鲜制备的PMN(2×106/ml)2 ml，加2×10-6mol/LDPH液2 ml，30℃放置30 min，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，用HitachiF-4010荧光分光光度计附加荧光偏振片(日本日立制造)分别测定溶液垂直和水平时的荧光强度并计算出荧光偏振度(P)，P值越大，微粘度越大，流动性越小；P值越小，微粘度越小，流动性越大。
2.PMN吞噬、杀菌功能测定：按照全国临床检验操作规程[4]进行。
3.血浆纤维连接蛋白(Fn)含量测定：应用免疫比浊法测定Fn浓度，试剂盒由华美生物工程公司提供。
三、统计学处理
, http://www.100md.com
所有数据均经计算机采用Minitab统计软件包进行方差分析、t检验和直线相关分析。
结 果
一、感染新生儿外周血PMN膜流动性、吞噬、杀菌率及血浆Fn含量变化见表1
从表1中可以看出，感染新生儿外周血PMN荧光偏振度、微粘度高于对照组，差别有显著性意义(P<0.05)，表明流动性显著降低，尤以败血症患儿下降更为显著(P<0.01)。感染组新生儿血浆Fn含量、PMN吞噬率、杀菌率较对照组显著降低(P<0.05)。
二、PMN膜流动性与血浆Fn、外周血PMN吞噬、杀菌功能之间的关系
应用直接相关分析法分析了感染新生儿PMN膜流动性与吞噬、杀菌率以及血浆Fn含量之间的关系，结果表明，PMN微粘度(η)与吞噬、杀菌率及血浆Fn含量呈负相关，γ分别为-0.301(P<0.05)、-0.256(P<0.05)、-0.387(P<0.01)。
, 百拇医药
表1 感染新生儿外周血PMN膜流动性、吞噬、杀菌率及血浆Fn变化 组别
例数
荧光偏振度(P)
微粘度(η)
Fn
吞噬率%
杀菌率%
对照组
19
0.287±0.012
2.921±0.302
201.2±10.92
, 百拇医药
50.90±8.21
26.70±6.85
感染组
51
0.312±0.010＃
3.296±0.401＃
139.6±10.25＃＃
41.70±10.0＃＃
17.21±7.95＃＃
败血症
, 百拇医药 28
0.342±0.015*
3.896±0.401*
120.6±11.93△
39.65±10.1△
14.72±9.25△
肺 炎
23
0.301±0.013*
3.101±0.287*
, 百拇医药
158.7±8.95△
43.69±9.97△
19.56±6.89△
与对照组比较＃P<0.05，＃＃P<0.01；*两组比较P<0.05；△两组比较P<0.05讨 论
一、外周血PMN是宿主抵抗感染的主要防御细胞，具有趋化、吞噬、氧自由基产生及脱颗粒等功能，这些功能的启动首先取决于PMN膜受体及其特异性结合位点。细胞膜由类脂双分子和膜蛋白镶嵌而成，在正常生理条件下，膜呈液晶态，膜内物质正常地流动以保持生理生化功能正常进行。膜流动性是指细胞膜象液体那样可以流动的一种物理量，膜中脂质和蛋白质分子处于不停息的运动状态，从而使膜具有一种动态结构，在不同条件下，膜流动性有所不同，合适的膜流动性是维持细胞功能正常的必要前提，膜流动性改变将影响其功能，如膜上酶的活性、膜的转运功能、膜受体的功能表达等[5]。对膜流动性的研究，将使我们从分子水平进一步了解膜的结构与功能。
, 百拇医药
我们的研究结果表明，感染新生儿外周血PMN膜流动性显著低于正常对照组，且降低的程度与疾病的严重性密切相关，即病情越严重，膜流动性改变越明显。提示膜流动性降低可能是新生儿易发感染的重要原因之一。
二、PMN吞噬、杀菌功能在感染性疾病的发生与发展过程中发挥了重要的作用，本研究结果证明，感染新生儿PMN吞噬、杀菌率均较对照组低，肺炎组PMN吞噬、杀菌率在数值上有高于败血症的趋势，但统计学上无显著差异；相关分析结果表明，PMN膜微粘度与吞噬率、杀菌率呈负相关，r分别为-0.301(P<0.05)、-0.256(P<0.05)，说明吞噬、杀菌功能降低与膜流动性密切相关，膜流动性降低是引起PMN吞噬、杀菌功能降低的重要原因之一。PMN在吞噬过程中，首先细胞发生主动变形，将异物包裹，然后进行吞噬、杀菌，细胞膜流动性降低，也就意味着其变形能力下降，继而引起吞噬率降低。另外，PMN吞噬、杀菌过程中，产生呼吸爆发，释放大量氧自由基，不仅可以破坏靶细胞，也可以造成自身细胞过氧化损伤，细胞膜的过氧化，可使膜上巯基破坏，膜支架蛋白交联，膜变硬，从而使膜流动性降低[5]，因而形成恶性循环，加重病情的发展。
, 百拇医药
三、血浆纤维连接蛋白(Fibronectin，Fn)是近年来受到重视的一种糖蛋白，广泛存在于细胞表面和血浆中，具有重要的生理功能[6]，Fn对细胞的吞噬功能有重要的调控作用。官培龙等[7]报道，临床上通过输入Fn可提高患者抗感染免疫功能。我们的研究结果表明，感染新生儿血浆Fn水平显著降低，且降低的程度与疾病的严重程度呈正相关，即病情越严重，Fn降低越明显，与国内外报道[6，8，9]相一致；相关分析结果表明，感染新生儿血浆Fn水平与PMN微粘度呈负相关，表明血浆Fn越低，PMN流动性越低，提示血浆Fn对PMN膜流动性具有一定的调控作用。
参 考 文 献
1，Klein RB，Fischer Ts，Gard SE，et al.Decreased mononuclear and polymorphonuclear phagocyte chemotaxis in newborn.Pediatrics，1977，60：467-472.
, 百拇医药
2，Shigeoke AO，Charette RP，Wyman ML，et al.Defective oxidative metabolic responses of neutrophils from stressed.J Pediatr，1981，98：392-398.
3，Measuda M，Komiyama Y，Nishikada H，et al.Change of membrane fluidity of rat neutrophils accompanying escherichia coli inoculation.J Leuko Bio，1989，46：169-174.
4，叶应妩，王毓三.全国临床检验操作规程.第2版.南京：南京东南大学出版社，1997，353.
5，Howard L，Bleich MD.Abnormalities of cell-membrane fluidity in the pathogensis of disease.N Engl J Med，1977，18：370.
, 百拇医药
6，Jeffrey S，Gerdes MD，Mervin C，et al.Decreased plasma fibronectin in neonatal sepsis.Pediatr，1983，72：877.
7，官培龙，汪伟业，徐振武，等.慢性活动性重型肝炎患者纤维联结蛋白分子状态研究及其检测的临床意义.中华传染病杂志，1990，8：72-76.
8，王玉亭，沈惟堂，高玉娥.新生儿感染时血浆纤维结合蛋白变化的观察.中华儿科杂志，1988，26：27-28.
9，敖黎明，王愚珍，李云珠.新生儿感染、败血症时血浆纤维结合蛋白的检测.临床儿科杂志，1989，7：46-47.
收稿：1999-08-02 修回：2000-03-21, 百拇医药
单位：陈晶 许东琳 李珊(222002 连云港市第一人民医院儿科)；吴惠毅 梁文学(临床医学实验研究中心)
关键词：婴儿，新生；败血症；肺炎；中性粒细胞膜流动性
江苏医药000820 【摘要】 目的 探讨新生儿感染时外周血中性粒细胞(PMN)功能异常的膜分子机制。方法 应用DPH荧光探针标记PMN膜，荧光偏振法测定51例感染新生儿(其中败血症28例、肺炎23例)、19例健康新生儿PMN膜流动性。结果 感染新生儿PMN流动性较对照组比较显著降低(P<0.01)，尤以败血症更为明显；相关分析结果表明，PMN膜微粘度(η)与吞噬、杀菌率呈负相关，相关系数(γ)分别为-0.301(P<0.05)、-0.256(P<0.05)。结论 PMN膜流动性降低是造成感染新生儿PMN吞噬、杀菌功能降低的重要原因。
, http://www.100md.com
为了探讨新生儿感染外周血PMN功能异常的膜分子机制，我们应用荧光探针标记技术研究了膜流动性变化及其与吞噬、杀菌功能的关系，现报道如下。
对象和方法
一、对象
19例健康新生儿来自我院产房婴儿室，51例感染新生儿来自我院儿科新生儿病房，病种分布为败血症28例(血培养均阳性，其中金黄色葡萄球菌14例；表皮葡萄球菌7例；克雷伯氏肺炎杆菌2例；溶血性链球菌3例，埃希氏大肠杆菌2例)；肺炎23例，诊断标准按1987年上海会议制定的诊断标准。
二、方法
健康新生儿采集股静脉血2 ml，感染新生儿均于入院治疗前取静脉血2 ml，EDTA-Na2抗凝，标本采集后立即送院中心实验室。将EDTA-Na2抗凝血叠加于淋巴细胞分离液(中科院上海化学试剂厂生产)上，3 000 r/min离心20分钟，取沉淀细胞加等量3%Dextran-500(T500，Pharmacia产品)混匀，37℃直立放置30 min，然后取富含PMN层，低渗法溶解残存的红细胞，用1640培养液(Sigma公司产品)洗涤细胞3次，配成2×106/ml浓度，涂片鉴定PMN纯度>95%，台盼蓝拒染法计算活力为99%。
, 百拇医药
1.PMN膜流动性测定：应用DPH(1，6-Diphenyl-1，3，5 hexatriene Sigma公司产品)作为荧光探针标记PMN，荧光偏振法[3]测定PMN膜流动性，取新鲜制备的PMN(2×106/ml)2 ml，加2×10-6mol/LDPH液2 ml，30℃放置30 min，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，用HitachiF-4010荧光分光光度计附加荧光偏振片(日本日立制造)分别测定溶液垂直和水平时的荧光强度并计算出荧光偏振度(P)，P值越大，微粘度越大，流动性越小；P值越小，微粘度越小，流动性越大。
2.PMN吞噬、杀菌功能测定：按照全国临床检验操作规程[4]进行。
3.血浆纤维连接蛋白(Fn)含量测定：应用免疫比浊法测定Fn浓度，试剂盒由华美生物工程公司提供。
三、统计学处理
, http://www.100md.com
所有数据均经计算机采用Minitab统计软件包进行方差分析、t检验和直线相关分析。
结 果
一、感染新生儿外周血PMN膜流动性、吞噬、杀菌率及血浆Fn含量变化见表1
从表1中可以看出，感染新生儿外周血PMN荧光偏振度、微粘度高于对照组，差别有显著性意义(P<0.05)，表明流动性显著降低，尤以败血症患儿下降更为显著(P<0.01)。感染组新生儿血浆Fn含量、PMN吞噬率、杀菌率较对照组显著降低(P<0.05)。
二、PMN膜流动性与血浆Fn、外周血PMN吞噬、杀菌功能之间的关系
应用直接相关分析法分析了感染新生儿PMN膜流动性与吞噬、杀菌率以及血浆Fn含量之间的关系，结果表明，PMN微粘度(η)与吞噬、杀菌率及血浆Fn含量呈负相关，γ分别为-0.301(P<0.05)、-0.256(P<0.05)、-0.387(P<0.01)。
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表1 感染新生儿外周血PMN膜流动性、吞噬、杀菌率及血浆Fn变化 组别
例数
荧光偏振度(P)
微粘度(η)
Fn
吞噬率%
杀菌率%
对照组
19
0.287±0.012
2.921±0.302
201.2±10.92
, 百拇医药
50.90±8.21
26.70±6.85
感染组
51
0.312±0.010＃
3.296±0.401＃
139.6±10.25＃＃
41.70±10.0＃＃
17.21±7.95＃＃
败血症
, 百拇医药 28
0.342±0.015*
3.896±0.401*
120.6±11.93△
39.65±10.1△
14.72±9.25△
肺 炎
23
0.301±0.013*
3.101±0.287*
, 百拇医药
158.7±8.95△
43.69±9.97△
19.56±6.89△
与对照组比较＃P<0.05，＃＃P<0.01；*两组比较P<0.05；△两组比较P<0.05讨 论
一、外周血PMN是宿主抵抗感染的主要防御细胞，具有趋化、吞噬、氧自由基产生及脱颗粒等功能，这些功能的启动首先取决于PMN膜受体及其特异性结合位点。细胞膜由类脂双分子和膜蛋白镶嵌而成，在正常生理条件下，膜呈液晶态，膜内物质正常地流动以保持生理生化功能正常进行。膜流动性是指细胞膜象液体那样可以流动的一种物理量，膜中脂质和蛋白质分子处于不停息的运动状态，从而使膜具有一种动态结构，在不同条件下，膜流动性有所不同，合适的膜流动性是维持细胞功能正常的必要前提，膜流动性改变将影响其功能，如膜上酶的活性、膜的转运功能、膜受体的功能表达等[5]。对膜流动性的研究，将使我们从分子水平进一步了解膜的结构与功能。
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我们的研究结果表明，感染新生儿外周血PMN膜流动性显著低于正常对照组，且降低的程度与疾病的严重性密切相关，即病情越严重，膜流动性改变越明显。提示膜流动性降低可能是新生儿易发感染的重要原因之一。
二、PMN吞噬、杀菌功能在感染性疾病的发生与发展过程中发挥了重要的作用，本研究结果证明，感染新生儿PMN吞噬、杀菌率均较对照组低，肺炎组PMN吞噬、杀菌率在数值上有高于败血症的趋势，但统计学上无显著差异；相关分析结果表明，PMN膜微粘度与吞噬率、杀菌率呈负相关，r分别为-0.301(P<0.05)、-0.256(P<0.05)，说明吞噬、杀菌功能降低与膜流动性密切相关，膜流动性降低是引起PMN吞噬、杀菌功能降低的重要原因之一。PMN在吞噬过程中，首先细胞发生主动变形，将异物包裹，然后进行吞噬、杀菌，细胞膜流动性降低，也就意味着其变形能力下降，继而引起吞噬率降低。另外，PMN吞噬、杀菌过程中，产生呼吸爆发，释放大量氧自由基，不仅可以破坏靶细胞，也可以造成自身细胞过氧化损伤，细胞膜的过氧化，可使膜上巯基破坏，膜支架蛋白交联，膜变硬，从而使膜流动性降低[5]，因而形成恶性循环，加重病情的发展。
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三、血浆纤维连接蛋白(Fibronectin，Fn)是近年来受到重视的一种糖蛋白，广泛存在于细胞表面和血浆中，具有重要的生理功能[6]，Fn对细胞的吞噬功能有重要的调控作用。官培龙等[7]报道，临床上通过输入Fn可提高患者抗感染免疫功能。我们的研究结果表明，感染新生儿血浆Fn水平显著降低，且降低的程度与疾病的严重程度呈正相关，即病情越严重，Fn降低越明显，与国内外报道[6，8，9]相一致；相关分析结果表明，感染新生儿血浆Fn水平与PMN微粘度呈负相关，表明血浆Fn越低，PMN流动性越低，提示血浆Fn对PMN膜流动性具有一定的调控作用。
参 考 文 献
1，Klein RB，Fischer Ts，Gard SE，et al.Decreased mononuclear and polymorphonuclear phagocyte chemotaxis in newborn.Pediatrics，1977，60：467-472.
, 百拇医药
2，Shigeoke AO，Charette RP，Wyman ML，et al.Defective oxidative metabolic responses of neutrophils from stressed.J Pediatr，1981，98：392-398.
3，Measuda M，Komiyama Y，Nishikada H，et al.Change of membrane fluidity of rat neutrophils accompanying escherichia coli inoculation.J Leuko Bio，1989，46：169-174.
4，叶应妩，王毓三.全国临床检验操作规程.第2版.南京：南京东南大学出版社，1997，353.
5，Howard L，Bleich MD.Abnormalities of cell-membrane fluidity in the pathogensis of disease.N Engl J Med，1977，18：370.
, 百拇医药
6，Jeffrey S，Gerdes MD，Mervin C，et al.Decreased plasma fibronectin in neonatal sepsis.Pediatr，1983，72：877.
7，官培龙，汪伟业，徐振武，等.慢性活动性重型肝炎患者纤维联结蛋白分子状态研究及其检测的临床意义.中华传染病杂志，1990，8：72-76.
8，王玉亭，沈惟堂，高玉娥.新生儿感染时血浆纤维结合蛋白变化的观察.中华儿科杂志，1988，26：27-28.
9，敖黎明，王愚珍，李云珠.新生儿感染、败血症时血浆纤维结合蛋白的检测.临床儿科杂志，1989，7：46-47.
收稿：1999-08-02 修回：2000-03-21, 百拇医药