神经母细胞瘤细胞遗传学研究进展
作者：赵建平
单位：221006 江苏省徐州市儿童医院外科
关键词：
实用医学杂志000846 神经母细胞瘤(NB)与细胞遗传物质的关系，作为其病因学研究的一个方面越来越引起重视。正常细胞的生物学特性主要取决于细胞的遗传物质，其染色体结构是相对稳定的，而染色体是基因及DNA的载体。随着分子生物学的发展，NB的一些基因改变逐渐被认识，它们的研究对明确NB的发病机制、遗传倾向、预后及化疗有重要意义。
1 N-myc基因扩增
N-myc基因是Kohl[1]首先从NB的细胞中分离出神经外胚层专一的原癌基因(proto-oncogene)，通常表现为单拷贝，并定位于人类第二对染色体短臂远端(2P23～2P25)。近年来应用分子杂交技术对NB细胞系统及瘤组织N-myc基因进行检测，结果显示N-myc基因扩增(amplification)是NB迅速发展和预后不良的指标。N-myc基因的检测目前国内外常用原位分子杂交(insituhybridization)及Southen核酸杂交技术。原位杂交是用标记DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定的DNA或RNA序列，它不仅有高度敏感性、特异性，而且不经接酸提取，不破坏组织形态结构、能精细定位。Taylar[2]用荧光原位杂交(FISH)对NB进行检测，表明FISH快速，简便优于Southen杂交。国外的报道中，NB的N-myc扩增检出率约20%～38%，N-myc基因在发生肿瘤时从正常位点移至较活跃的位点，摆脱了所受的控制而扩增[3]。Hiyama[4]报道20例NB，其中低分化型有32%检测出N-myc扩增，而分化好的瘤体中有5.3%N-myc扩增。国内有学者利用差示聚合酶链式反应对17例骨髓转移的NB进行检测，结果12例证实有N-myc扩增，且N-myc扩增与肿瘤的分期及预后显著相关，有N-myc扩增者预后差，且扩增倍数越高则预后越差[5]。N-myc扩增是肿瘤本身所固有的，不受外界因素干扰，而临床分期却受就诊时间、诊断水平等因素干扰，影响其提示预后的准确性，但基因扩增则能排除人为因素，更独立、更明确的提示预后。大多数学者的研究提示N-myc扩增常见于1岁以上，进展期，低分化型的NB。没有N-myc扩增的NB预后相对较好，但无N-myc扩增的Ⅳ期NB仍预后不良，这也说明N-myc扩增不是决定NB预后的唯一指标。
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2 DNA含量及倍体分布
恶性肿瘤通常表现为异常增殖，这必然导致肿瘤细胞内DNA含量的变化，且肿瘤细胞DNA含量增高与肿瘤的恶性程度成正比，DNA倍体与临床预后密切相关。DNA的测量多采用图像细胞分析仪对细胞核DNA分光密度值进行测定得出DNA含量，一般认为DNA含量指数(DI)在0.9～1.1范围内为二倍体，DI>1.3时为异倍体，DI于1.1～1.3之间时为近异倍体。近年来对NB中DNA含量及倍体分布的分析表明，随着DNA指数的增高病死率明显增高，提示DI显著增高者预后不良。Woods[6]对32例NB的研究表明异倍体肿瘤存活率(71.4%)，显著高于二倍体(10%)。对异倍体NB预后良好的解释为：(1)异倍体肿瘤对化疗敏感；(2)二倍体肿瘤含有较多S期细胞，具有较高的增殖活性；(3)N-myc产物可与相应的DNA序列结合，激活生长相关基因，抑制分化相关基因，使细胞处于生长旺盛的低分化状态。
3 1号染色体短臂缺失
, 百拇医药
Brodeur于1977年在进展期的NB细胞株中发现了1P缺失，并指出这可能是进展期NB的特征之一。Schwab[8]认为1P缺失部位上可能存在NB的抑癌基因。由于1P缺失，其基因调节序列或编码发生改变或该基因完全丢失，从而失去抗癌作用。通常认为1P缺失的部位在1P 32末端或1P 36上。利用聚合酶链反应——杂合性缺失(PCR-LOH)方法检测1P有较高敏感性，PCR是一种体外扩增DNA技术，通过PCR扩增DNA等多态位点来确定该位点的缺失。武君等[9]对8例NB进行检测，结果Ⅳ期病例5例均有1P缺失，Ⅲ期3例中有1例1P缺失。说明Ⅲ、Ⅳ期肿瘤1P缺失频率较高，对评估肿瘤的预后有重要价值。
4 Bcl-2基因
Bcl-2基因最早是从B细胞淋巴瘤染色体14和18异位断裂点七中分离出来的，与Bcl-2相关的蛋白由279个氨基酸构成，Bcl-2含有3个外显子，它的蛋白表达产物定位于线粒体膜，核膜和内层网。Bcl-2能抑制许多因素引起的细胞凋亡(apoptosis)，通过阻止细胞程序死亡而达到促进肿瘤恶性生长的作用。关于NB中Bcl-2表达的研究资料显示，其表达频率在40%～100%之间[10～11]。Krajewski[12]研究表明Bcl-2在部分幼稚NB细胞中表达可以阴性，而在分化成熟的节细胞中表达为阳性。Ikada[11]对49例NB进行检测，其中40例测出Bcl-2，他认为NB细胞凋亡受到Bcl-2癌基因的调控和抑制，Bcl-2基因表达可促使癌细胞生存，而Bcl-2的过渡表达还可抑制多种化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡，使细胞产生耐药[13]。
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5 P53基因
P53基因是肿瘤抑制基因，位于17号染色体短臂，全长约20 kb，有11个外显子和10个内含子，编码一个53 kb的核酸蛋白，它的主要生物学功能为引起细胞周期阻滞，诱导凋亡和促进分化[14]。正常的P53基因即野生型P53基因具有促进细胞凋亡，对肿瘤的发生起抑制作用，而突变型P53基因有抑制细胞凋亡作用，促进恶性肿瘤的活性转化[15]。P53基因的突变引起突变型P53蛋白的含量在肿瘤中增高，且突变型P53蛋白的含量与肿瘤细胞的分化程度、浸润转移预后有关。Imamura[16]的研究表明Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ-S期NB无P53基因突变，但Ⅲ、Ⅳ期和复发的患儿均有P53基因突变，提示P53蛋白的高度表达与肿瘤分期有关，是肿瘤处于进展期和预后不良的一个重要指标。但国内有人用ABC免疫组化法对32例NB进行P53蛋白表达检测，结果显示均为阴性，即P53表达缺乏，他们认为P53基因在NB中可能不发生突变，不起重要作用[17]。
, 百拇医药
6 参考文献
1，Kohl NE,Kanda N,Sohreclc RR,et al. Transposition and amplification of oncogene related sequence in human neuroblastoma. Cell,1983,35(2 pt 1):359～367.
2，Taylor CP,Mcguckin AG,Bown NP,et al.
Rapid detection of prognostic genetic in situ hybridization on tumour imprints and bone narrow smears. Br J Cancer,1994,69(3):445～451.
3，Schwab M. Amplification of N-myc as a prognostic marder for patients with neuroblastoma. Semin Cancer Biol,1993,4(1):13～18.
, http://www.100md.com
4，Hiyama E. Immynohistoohemical analysis of N-myc protein expression in neuroblastoma:correction with prognosis of patients. J Pediatr Surg，1991，26(7)：838～843.
5，杨朝辉，张锦华，杨学忠，等. 差示聚合酶链式反应检测骨髓转移的神经母细胞瘤N-myc扩增的临床意义. 中华小儿外科杂志，1996，17(4)：195～198.
6，Woods WG. Neuroblastoma represents distinct clinical biologic entities:a review and rerspective from quebec neurblastoma sereening project. Pediatrics,1992,89(1):114～118.
, http://www.100md.com
7，周鹏飞，周蓉儿. 神经母细胞瘤S-100蛋白质免疫组化研究及图象分析DNA倍体的预后价值. 中华小儿外科杂志，1995，10(5)：273～275.
8，Schwab M. Is there a neuroblastoma anti-oncogene? Progr Clin Bio Res，1991，366(1)：1～9.
9，武 君，王慧贞，吉士俊. PCR-LOH检测神经母细胞瘤1号染色体短臂缺失. 中华小儿外科杂志，1995，16(5)：260～261.
10，Ramani P, Lu QL. Expression of Bcl-2 gene product in neuroblastoma. J Pathol,1994,172(3):273～278.
11，Ikeda H,Hirato J,Akami M,et al. Bcl-2 oncoprotein expression and apoptosis in neurblastoma. J Pediatr Surg,1995,30(6):805.
, 百拇医药
12，Krajewski S,Chatten J,Hanada M,et al. Immunohistochemical analysis of the Bcl-2 oncoprotein in human nueroblastomas. Lab Invest,1995,72(1):42～54.
13，Dole M,Nunez G,Merohaut AK,et al. Bcl-2 inhibits chemotherapy-induced apoptosis in neuroblastoma. Cancer Res,1994,54(12):3253～3259.
14，Gottlied TM,Oren M. P53 in growth control and neoplasia. Biochem Biophys Acta,1996,1287(2～3):77～102.
15，Hinds P,Finlny C,Levine AJ,et al. Mutation in required to activate the P53 gene for cooperation with the ras oncogene and transformation. J Virol,1989,63(2):739～746.
16，Imamura J,Bartram CR. Berthold F,et al. Mutation of the P53 gene if neuroblastoma and relationship with N-myc amplification. Cancer Res，1993，53(17)：4053～4058.
17，步星耀，沈兆忠，金百祥. 肾母细胞瘤和神经母细胞瘤P53蛋白表达研究. 中华外科杂志，1997，35(4)：220～222.
(收稿日期：1999-12-15), 百拇医药
单位：221006 江苏省徐州市儿童医院外科
关键词：
实用医学杂志000846 神经母细胞瘤(NB)与细胞遗传物质的关系，作为其病因学研究的一个方面越来越引起重视。正常细胞的生物学特性主要取决于细胞的遗传物质，其染色体结构是相对稳定的，而染色体是基因及DNA的载体。随着分子生物学的发展，NB的一些基因改变逐渐被认识，它们的研究对明确NB的发病机制、遗传倾向、预后及化疗有重要意义。
1 N-myc基因扩增
N-myc基因是Kohl[1]首先从NB的细胞中分离出神经外胚层专一的原癌基因(proto-oncogene)，通常表现为单拷贝，并定位于人类第二对染色体短臂远端(2P23～2P25)。近年来应用分子杂交技术对NB细胞系统及瘤组织N-myc基因进行检测，结果显示N-myc基因扩增(amplification)是NB迅速发展和预后不良的指标。N-myc基因的检测目前国内外常用原位分子杂交(insituhybridization)及Southen核酸杂交技术。原位杂交是用标记DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定的DNA或RNA序列，它不仅有高度敏感性、特异性，而且不经接酸提取，不破坏组织形态结构、能精细定位。Taylar[2]用荧光原位杂交(FISH)对NB进行检测，表明FISH快速，简便优于Southen杂交。国外的报道中，NB的N-myc扩增检出率约20%～38%，N-myc基因在发生肿瘤时从正常位点移至较活跃的位点，摆脱了所受的控制而扩增[3]。Hiyama[4]报道20例NB，其中低分化型有32%检测出N-myc扩增，而分化好的瘤体中有5.3%N-myc扩增。国内有学者利用差示聚合酶链式反应对17例骨髓转移的NB进行检测，结果12例证实有N-myc扩增，且N-myc扩增与肿瘤的分期及预后显著相关，有N-myc扩增者预后差，且扩增倍数越高则预后越差[5]。N-myc扩增是肿瘤本身所固有的，不受外界因素干扰，而临床分期却受就诊时间、诊断水平等因素干扰，影响其提示预后的准确性，但基因扩增则能排除人为因素，更独立、更明确的提示预后。大多数学者的研究提示N-myc扩增常见于1岁以上，进展期，低分化型的NB。没有N-myc扩增的NB预后相对较好，但无N-myc扩增的Ⅳ期NB仍预后不良，这也说明N-myc扩增不是决定NB预后的唯一指标。
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2 DNA含量及倍体分布
恶性肿瘤通常表现为异常增殖，这必然导致肿瘤细胞内DNA含量的变化，且肿瘤细胞DNA含量增高与肿瘤的恶性程度成正比，DNA倍体与临床预后密切相关。DNA的测量多采用图像细胞分析仪对细胞核DNA分光密度值进行测定得出DNA含量，一般认为DNA含量指数(DI)在0.9～1.1范围内为二倍体，DI>1.3时为异倍体，DI于1.1～1.3之间时为近异倍体。近年来对NB中DNA含量及倍体分布的分析表明，随着DNA指数的增高病死率明显增高，提示DI显著增高者预后不良。Woods[6]对32例NB的研究表明异倍体肿瘤存活率(71.4%)，显著高于二倍体(10%)。对异倍体NB预后良好的解释为：(1)异倍体肿瘤对化疗敏感；(2)二倍体肿瘤含有较多S期细胞，具有较高的增殖活性；(3)N-myc产物可与相应的DNA序列结合，激活生长相关基因，抑制分化相关基因，使细胞处于生长旺盛的低分化状态。
3 1号染色体短臂缺失
, 百拇医药
Brodeur于1977年在进展期的NB细胞株中发现了1P缺失，并指出这可能是进展期NB的特征之一。Schwab[8]认为1P缺失部位上可能存在NB的抑癌基因。由于1P缺失，其基因调节序列或编码发生改变或该基因完全丢失，从而失去抗癌作用。通常认为1P缺失的部位在1P 32末端或1P 36上。利用聚合酶链反应——杂合性缺失(PCR-LOH)方法检测1P有较高敏感性，PCR是一种体外扩增DNA技术，通过PCR扩增DNA等多态位点来确定该位点的缺失。武君等[9]对8例NB进行检测，结果Ⅳ期病例5例均有1P缺失，Ⅲ期3例中有1例1P缺失。说明Ⅲ、Ⅳ期肿瘤1P缺失频率较高，对评估肿瘤的预后有重要价值。
4 Bcl-2基因
Bcl-2基因最早是从B细胞淋巴瘤染色体14和18异位断裂点七中分离出来的，与Bcl-2相关的蛋白由279个氨基酸构成，Bcl-2含有3个外显子，它的蛋白表达产物定位于线粒体膜，核膜和内层网。Bcl-2能抑制许多因素引起的细胞凋亡(apoptosis)，通过阻止细胞程序死亡而达到促进肿瘤恶性生长的作用。关于NB中Bcl-2表达的研究资料显示，其表达频率在40%～100%之间[10～11]。Krajewski[12]研究表明Bcl-2在部分幼稚NB细胞中表达可以阴性，而在分化成熟的节细胞中表达为阳性。Ikada[11]对49例NB进行检测，其中40例测出Bcl-2，他认为NB细胞凋亡受到Bcl-2癌基因的调控和抑制，Bcl-2基因表达可促使癌细胞生存，而Bcl-2的过渡表达还可抑制多种化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡，使细胞产生耐药[13]。
, http://www.100md.com
5 P53基因
P53基因是肿瘤抑制基因，位于17号染色体短臂，全长约20 kb，有11个外显子和10个内含子，编码一个53 kb的核酸蛋白，它的主要生物学功能为引起细胞周期阻滞，诱导凋亡和促进分化[14]。正常的P53基因即野生型P53基因具有促进细胞凋亡，对肿瘤的发生起抑制作用，而突变型P53基因有抑制细胞凋亡作用，促进恶性肿瘤的活性转化[15]。P53基因的突变引起突变型P53蛋白的含量在肿瘤中增高，且突变型P53蛋白的含量与肿瘤细胞的分化程度、浸润转移预后有关。Imamura[16]的研究表明Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ-S期NB无P53基因突变，但Ⅲ、Ⅳ期和复发的患儿均有P53基因突变，提示P53蛋白的高度表达与肿瘤分期有关，是肿瘤处于进展期和预后不良的一个重要指标。但国内有人用ABC免疫组化法对32例NB进行P53蛋白表达检测，结果显示均为阴性，即P53表达缺乏，他们认为P53基因在NB中可能不发生突变，不起重要作用[17]。
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6 参考文献
1，Kohl NE,Kanda N,Sohreclc RR,et al. Transposition and amplification of oncogene related sequence in human neuroblastoma. Cell,1983,35(2 pt 1):359～367.
2，Taylor CP,Mcguckin AG,Bown NP,et al.
Rapid detection of prognostic genetic in situ hybridization on tumour imprints and bone narrow smears. Br J Cancer,1994,69(3):445～451.
3，Schwab M. Amplification of N-myc as a prognostic marder for patients with neuroblastoma. Semin Cancer Biol,1993,4(1):13～18.
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4，Hiyama E. Immynohistoohemical analysis of N-myc protein expression in neuroblastoma:correction with prognosis of patients. J Pediatr Surg，1991，26(7)：838～843.
5，杨朝辉，张锦华，杨学忠，等. 差示聚合酶链式反应检测骨髓转移的神经母细胞瘤N-myc扩增的临床意义. 中华小儿外科杂志，1996，17(4)：195～198.
6，Woods WG. Neuroblastoma represents distinct clinical biologic entities:a review and rerspective from quebec neurblastoma sereening project. Pediatrics,1992,89(1):114～118.
, http://www.100md.com
7，周鹏飞，周蓉儿. 神经母细胞瘤S-100蛋白质免疫组化研究及图象分析DNA倍体的预后价值. 中华小儿外科杂志，1995，10(5)：273～275.
8，Schwab M. Is there a neuroblastoma anti-oncogene? Progr Clin Bio Res，1991，366(1)：1～9.
9，武 君，王慧贞，吉士俊. PCR-LOH检测神经母细胞瘤1号染色体短臂缺失. 中华小儿外科杂志，1995，16(5)：260～261.
10，Ramani P, Lu QL. Expression of Bcl-2 gene product in neuroblastoma. J Pathol,1994,172(3):273～278.
11，Ikeda H,Hirato J,Akami M,et al. Bcl-2 oncoprotein expression and apoptosis in neurblastoma. J Pediatr Surg,1995,30(6):805.
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12，Krajewski S,Chatten J,Hanada M,et al. Immunohistochemical analysis of the Bcl-2 oncoprotein in human nueroblastomas. Lab Invest,1995,72(1):42～54.
13，Dole M,Nunez G,Merohaut AK,et al. Bcl-2 inhibits chemotherapy-induced apoptosis in neuroblastoma. Cancer Res,1994,54(12):3253～3259.
14，Gottlied TM,Oren M. P53 in growth control and neoplasia. Biochem Biophys Acta,1996,1287(2～3):77～102.
15，Hinds P,Finlny C,Levine AJ,et al. Mutation in required to activate the P53 gene for cooperation with the ras oncogene and transformation. J Virol,1989,63(2):739～746.
16，Imamura J,Bartram CR. Berthold F,et al. Mutation of the P53 gene if neuroblastoma and relationship with N-myc amplification. Cancer Res，1993，53(17)：4053～4058.
17，步星耀，沈兆忠，金百祥. 肾母细胞瘤和神经母细胞瘤P53蛋白表达研究. 中华外科杂志，1997，35(4)：220～222.
(收稿日期：1999-12-15), 百拇医药