重组IL-6和维甲酸诱导肾癌细胞凋亡的研究
作者：叶炯贤 蔡志明 叶红军
单位：518036 广东省深圳市中心医院泌尿外科
关键词：白细胞介素6；维甲酸；肾癌细胞；脱噬作用
实用医学杂志000807 摘 要 目的：探讨重组白细胞介素6(IL-6)在体外对肾癌细胞GRC-1(RCC GRC-1)凋亡的诱导作用。方法：在RCC GRC-1细胞培养体系中加入IL-6诱导，反式维甲酸(RA)作为对照药物，琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪观察IL-6和RA对细胞DNA电泳和细胞周期动力学的影响。结果：IL-6诱发肾癌细胞DNA出现典型的梯状改变，RA有轻度诱导肾癌细胞凋亡作用。流式细胞仪DNA直方图上IL-6诱导肾癌细胞凋亡率明显高于RA(P<0.05)。结论：提示IL-6促进RCC GRC-1凋亡的作用明显高于RA，且随着剂量加大和时间增加，诱发凋亡程度增高，但需进一步探讨IL-6治疗肾癌的可能性及其价值。
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细胞凋亡是基因控制的细胞自主性的死亡过程，凋亡受阻将导致细胞代谢的紊乱及肿瘤的发生和发展[1，2]。Song等[3]发现，肿瘤促进剂明显抑制细胞凋亡，从而证明细胞凋亡在肿瘤发生中的作用，提出以细胞凋亡为新目标来寻找治疗肿瘤的途径。本文探讨了白细胞介素(IL-6)诱导GRC-1肾癌细胞分化和凋亡作用，并用反式维甲酸(RA)作为对照药物以寻找治疗肾癌的新途径。
1 材料与方法
1.1 细胞和材料 采用GRC-1肾癌细胞株(日本东京大学医学院)，用含10%的胎牛血清1 640(GIBCO)传代培养，当细胞为对数生长期时使用。人重组IL-6(Lake Placid, New Yerk)，RA(Sigma)，蛋白酶K(Merke公司，德国)，RNA酶(Sigma)，EDTA(Serva公司，德国)，Triton X100(Serva，德国)。溴酚兰(华美公司)，λ-DNA/EcoRI+Hind Ⅲ Markers(Promega,美国)，琼脂糖(Promega,美国)。ELITE流式细胞仪(美国COULTER公司)。
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1.2 琼脂糖凝胶电泳分析 在RCC GRC-1细胞悬液(1×105/ml)中分别加入IL-6和RA，使其终浓度为IL-6100ng/ml，50ng/ml，RA10-4M/ml。另设细胞空白对照组，置37℃ CO2中培养24h和48h。收集细胞，用冰冷PBS洗涤2次，加入200μl细胞裂解液(50mmol/L Tris,10mmol/L EDTA,5%SDS,pH=8.0)，4℃裂解30min，RNA酶(50μl/ml)消化37℃30min，加蛋白酶K100μg，酚抽提，乙醇沉淀，100μg TE溶解DNA，每样品取10μg DNA在1.8%琼脂糖凝胶上电泳。
1.3 细胞周期动力学测定 收集经过不同浓度药物处理的RCC GRC-1，另设细胞空白对照组，每组测定两管。调节浓度为1×105/ml，继续培养24h和48h，按药物浓度分高、中、低3组(H，M，L)。收集细胞，ELITE流式细胞仪检测，记录各细胞周期各时相的比例，MULTICYCLE软件分析数据，并根据DNA含量组方图中出现AP区亚峰细胞百分率，计算凋亡细胞百分率。
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2 结果
2.1 DNA片段梯度电泳分析 见图1。图1显示条带1为RCC GRC-1细胞对照组，条带2和3分别为RA终浓度10-4M/ml作用24h和48h的DNA模糊梯状片段。条带4，5为IL-6终浓度100ng/ml 24h和48h的DNA梯状改变，条带6为IL-650ng/ml作用24h，条带7为DNA Marker。
图1 IL-6和RA作用RCC-RGC-1的DNA电泳
2.2 IL-6和RA对肾癌细胞细胞周期动力学的影响 见表1。表1显示随着IL-6和RA作用时间的延长和剂量的增大，RCC GRC-1的细胞S期和G2M期百分率明显降低，并引起细胞凋亡，在DNA组方图上出现G1期前的亚二倍体峰(细胞凋亡峰、AP峰)。以高浓度IL-6作用细胞48 h的凋亡细胞百分率高于RA，见图2～4。
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表1 IL-6和RA对肾癌细胞细胞周期动力学
的影响(
±s，%) 剂量时间
G1期
S期
G2M
AP
IL-6(ng/ml)
H-24h
62.2±3.8
13.8±2.7
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13.3±3.2
H-48h
64.0±3.6
8.4±0.1
10.3±3.1
37.2±4.0
M-24h
68.9±11.8
18.2±2.6
16.8±5.3
M-48h
55.2±9.7
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27.8±2.4
17.0±2.8
9.6±0.1
L-24h
61.6±4.2
22.4±3.5
16.8±2.4
L-48h
60.2±6.4
25.8±5.0
18.7±6.3
RA(mmol/ml)
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H-24h
59.1±9.9
16.0±3.2
27.5±4.8
H-48h
46.6±5.3
16.9±2.8
23.6±0.2
12.2±4.9
M-24h
58.5±7.8
20.8±3.6
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28.4±4.8
M-48h
60.3±10.3
19.7±5.3
28.7±6.9
7.4±1.3
L-24h
59.8±10.3
26.8±3.8
15.3±2.6
L-48h
68.6±7.5
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24.6±4.1
14.9±1.7
对照组
75.1±3.2
33.5±5.3
26.1±4.0
注：H为高浓度，M为中浓度，L为低浓度
图2 对照组RCC GRC-1细胞周期G1期
前无凋亡细胞峰(AP峰)
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图3 IL-6作用RCC GRC-1 48h细胞周期
图4 RA作用RCC GRC 24h细胞周期
3 讨论
IL-6是一种多功能细胞因子，在促进细胞生长和调节基因表达方面起重要作用，它还有抗病毒活性，促进B细胞分化，增强NK细胞杀伤功能等作用[4]。Progador等[5]将IL-6基因转染D122 Lewis肺癌细胞后，其在体外生长受抑制，经体外灭活转染株免疫后，同基因小鼠的CTL和巨噬细胞活性增强，并阻止再接种的该细胞在体内的生长和转移。肖冰等[6]通过转导外源性IL-6基因，使IL-6 mRNA的转录表达显著提高，分泌目的蛋白的量和活性均可达到产生效应的要求，为探讨IL-6在体内外生物学治疗的研究奠定基础。
, 百拇医药
本组结果显示IL-6对体外培养RCC RGC-1的细胞周期动力学的影响主要是在G1期，减少从G1期进入S期和G2M期的细胞数量。S期是细胞DNA合成期，G2M期是细胞的有丝分裂期，IL-6使细胞DNA合成及有丝分裂障碍，从而抑制肾癌细胞的生长增殖及代谢等过程，最终导致细胞凋亡。RA使肾癌细胞DNA合成障碍的改变与IL-6相似，但RA的凋亡细胞比例低于IL-6。
细胞凋亡最显著的生化特征，是钙、镁依赖的内源性核酸酶的激活，将核染色体从核小体间裂断，形成由大约180～200 bp或其多聚体组成的寡核苷酸片段，琼脂糖凝胶电泳可见特征性的梯状(Ladder)带。本文观察了IL-6对体外培养RCC GRC-1的作用，DNA电泳显示RA作用的肾癌细胞DNA片段，但因凋亡细胞较少，呈模糊梯状改变，IL-6 100 ng/ml可诱导细胞凋亡，呈多个典型的梯状片段，提示IL-6促进细胞凋亡作用较RA显著。
, 百拇医药
本研究表明IL-6较RA更有效地介导靶细胞的凋亡，抑制其DNA合成，且随着时间的增加和剂量的加大，诱发凋亡作用增强。可望在抗肿瘤治疗中发挥应有的潜力，且有必要进一步研究IL-6治疗肾癌的可能性及其价值。
4 参考文献
1，明学志，尹浩然，朱正纲，等. 细胞凋亡调控及其进展. 国外医学肿瘤学杂志，1998，25(6)：321～323.
2，Lippmen SM,Shin DM,Lee LJ,et al. P53 and retinoid chemoprovention of oral carcinogensis. Cancer Res,1995,55(1):16～20.
3，Song Q,Baxley GD,Kovass EM,et al. Inhibition of apotosis in human tumor cells by okadaic acid. J Cell Phisiol,1992,153(3):550～554.
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4，Progador A,Tzeheral E,Katz A,et al. Interleukin 6 gene transfection into lewis lung carcinoma cells suppresses the maliganant phenotype and conters immuno-therapeutic competene against parental cells. Cancer Res.1992,52(6):3677～3682.
5，Tsang KY,Kashmir SV,Qi Ce,et al. Tranfer of the IL-6 gene into a human coloretal carcinoma cell line and consequent enhacement of tumor antigen expression. Immnol Letter,1993，36(1)：179～182.
6，肖 冰，周殿元，姜 泊，等. IL-6基因转导大肠癌细胞的表达. 胃肠病学和肝病学杂志，1998，6(4)：30～32.
(收稿日期：2000-04-17), 百拇医药
单位：518036 广东省深圳市中心医院泌尿外科
关键词：白细胞介素6；维甲酸；肾癌细胞；脱噬作用
实用医学杂志000807 摘 要 目的：探讨重组白细胞介素6(IL-6)在体外对肾癌细胞GRC-1(RCC GRC-1)凋亡的诱导作用。方法：在RCC GRC-1细胞培养体系中加入IL-6诱导，反式维甲酸(RA)作为对照药物，琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪观察IL-6和RA对细胞DNA电泳和细胞周期动力学的影响。结果：IL-6诱发肾癌细胞DNA出现典型的梯状改变，RA有轻度诱导肾癌细胞凋亡作用。流式细胞仪DNA直方图上IL-6诱导肾癌细胞凋亡率明显高于RA(P<0.05)。结论：提示IL-6促进RCC GRC-1凋亡的作用明显高于RA，且随着剂量加大和时间增加，诱发凋亡程度增高，但需进一步探讨IL-6治疗肾癌的可能性及其价值。
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细胞凋亡是基因控制的细胞自主性的死亡过程，凋亡受阻将导致细胞代谢的紊乱及肿瘤的发生和发展[1，2]。Song等[3]发现，肿瘤促进剂明显抑制细胞凋亡，从而证明细胞凋亡在肿瘤发生中的作用，提出以细胞凋亡为新目标来寻找治疗肿瘤的途径。本文探讨了白细胞介素(IL-6)诱导GRC-1肾癌细胞分化和凋亡作用，并用反式维甲酸(RA)作为对照药物以寻找治疗肾癌的新途径。
1 材料与方法
1.1 细胞和材料 采用GRC-1肾癌细胞株(日本东京大学医学院)，用含10%的胎牛血清1 640(GIBCO)传代培养，当细胞为对数生长期时使用。人重组IL-6(Lake Placid, New Yerk)，RA(Sigma)，蛋白酶K(Merke公司，德国)，RNA酶(Sigma)，EDTA(Serva公司，德国)，Triton X100(Serva，德国)。溴酚兰(华美公司)，λ-DNA/EcoRI+Hind Ⅲ Markers(Promega,美国)，琼脂糖(Promega,美国)。ELITE流式细胞仪(美国COULTER公司)。
, 百拇医药
1.2 琼脂糖凝胶电泳分析 在RCC GRC-1细胞悬液(1×105/ml)中分别加入IL-6和RA，使其终浓度为IL-6100ng/ml，50ng/ml，RA10-4M/ml。另设细胞空白对照组，置37℃ CO2中培养24h和48h。收集细胞，用冰冷PBS洗涤2次，加入200μl细胞裂解液(50mmol/L Tris,10mmol/L EDTA,5%SDS,pH=8.0)，4℃裂解30min，RNA酶(50μl/ml)消化37℃30min，加蛋白酶K100μg，酚抽提，乙醇沉淀，100μg TE溶解DNA，每样品取10μg DNA在1.8%琼脂糖凝胶上电泳。
1.3 细胞周期动力学测定 收集经过不同浓度药物处理的RCC GRC-1，另设细胞空白对照组，每组测定两管。调节浓度为1×105/ml，继续培养24h和48h，按药物浓度分高、中、低3组(H，M，L)。收集细胞，ELITE流式细胞仪检测，记录各细胞周期各时相的比例，MULTICYCLE软件分析数据，并根据DNA含量组方图中出现AP区亚峰细胞百分率，计算凋亡细胞百分率。
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2 结果
2.1 DNA片段梯度电泳分析 见图1。图1显示条带1为RCC GRC-1细胞对照组，条带2和3分别为RA终浓度10-4M/ml作用24h和48h的DNA模糊梯状片段。条带4，5为IL-6终浓度100ng/ml 24h和48h的DNA梯状改变，条带6为IL-650ng/ml作用24h，条带7为DNA Marker。
图1 IL-6和RA作用RCC-RGC-1的DNA电泳
2.2 IL-6和RA对肾癌细胞细胞周期动力学的影响 见表1。表1显示随着IL-6和RA作用时间的延长和剂量的增大，RCC GRC-1的细胞S期和G2M期百分率明显降低，并引起细胞凋亡，在DNA组方图上出现G1期前的亚二倍体峰(细胞凋亡峰、AP峰)。以高浓度IL-6作用细胞48 h的凋亡细胞百分率高于RA，见图2～4。
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表1 IL-6和RA对肾癌细胞细胞周期动力学
的影响(
±s，%) 剂量时间G1期
S期
G2M
AP
IL-6(ng/ml)
H-24h
62.2±3.8
13.8±2.7
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13.3±3.2
H-48h
64.0±3.6
8.4±0.1
10.3±3.1
37.2±4.0
M-24h
68.9±11.8
18.2±2.6
16.8±5.3
M-48h
55.2±9.7
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27.8±2.4
17.0±2.8
9.6±0.1
L-24h
61.6±4.2
22.4±3.5
16.8±2.4
L-48h
60.2±6.4
25.8±5.0
18.7±6.3
RA(mmol/ml)
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H-24h
59.1±9.9
16.0±3.2
27.5±4.8
H-48h
46.6±5.3
16.9±2.8
23.6±0.2
12.2±4.9
M-24h
58.5±7.8
20.8±3.6
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M-48h
60.3±10.3
19.7±5.3
28.7±6.9
7.4±1.3
L-24h
59.8±10.3
26.8±3.8
15.3±2.6
L-48h
68.6±7.5
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24.6±4.1
14.9±1.7
对照组
75.1±3.2
33.5±5.3
26.1±4.0
注：H为高浓度，M为中浓度，L为低浓度
图2 对照组RCC GRC-1细胞周期G1期
前无凋亡细胞峰(AP峰)
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图3 IL-6作用RCC GRC-1 48h细胞周期
图4 RA作用RCC GRC 24h细胞周期
3 讨论
IL-6是一种多功能细胞因子，在促进细胞生长和调节基因表达方面起重要作用，它还有抗病毒活性，促进B细胞分化，增强NK细胞杀伤功能等作用[4]。Progador等[5]将IL-6基因转染D122 Lewis肺癌细胞后，其在体外生长受抑制，经体外灭活转染株免疫后，同基因小鼠的CTL和巨噬细胞活性增强，并阻止再接种的该细胞在体内的生长和转移。肖冰等[6]通过转导外源性IL-6基因，使IL-6 mRNA的转录表达显著提高，分泌目的蛋白的量和活性均可达到产生效应的要求，为探讨IL-6在体内外生物学治疗的研究奠定基础。
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本组结果显示IL-6对体外培养RCC RGC-1的细胞周期动力学的影响主要是在G1期，减少从G1期进入S期和G2M期的细胞数量。S期是细胞DNA合成期，G2M期是细胞的有丝分裂期，IL-6使细胞DNA合成及有丝分裂障碍，从而抑制肾癌细胞的生长增殖及代谢等过程，最终导致细胞凋亡。RA使肾癌细胞DNA合成障碍的改变与IL-6相似，但RA的凋亡细胞比例低于IL-6。
细胞凋亡最显著的生化特征，是钙、镁依赖的内源性核酸酶的激活，将核染色体从核小体间裂断，形成由大约180～200 bp或其多聚体组成的寡核苷酸片段，琼脂糖凝胶电泳可见特征性的梯状(Ladder)带。本文观察了IL-6对体外培养RCC GRC-1的作用，DNA电泳显示RA作用的肾癌细胞DNA片段，但因凋亡细胞较少，呈模糊梯状改变，IL-6 100 ng/ml可诱导细胞凋亡，呈多个典型的梯状片段，提示IL-6促进细胞凋亡作用较RA显著。
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本研究表明IL-6较RA更有效地介导靶细胞的凋亡，抑制其DNA合成，且随着时间的增加和剂量的加大，诱发凋亡作用增强。可望在抗肿瘤治疗中发挥应有的潜力，且有必要进一步研究IL-6治疗肾癌的可能性及其价值。
4 参考文献
1，明学志，尹浩然，朱正纲，等. 细胞凋亡调控及其进展. 国外医学肿瘤学杂志，1998，25(6)：321～323.
2，Lippmen SM,Shin DM,Lee LJ,et al. P53 and retinoid chemoprovention of oral carcinogensis. Cancer Res,1995,55(1):16～20.
3，Song Q,Baxley GD,Kovass EM,et al. Inhibition of apotosis in human tumor cells by okadaic acid. J Cell Phisiol,1992,153(3):550～554.
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4，Progador A,Tzeheral E,Katz A,et al. Interleukin 6 gene transfection into lewis lung carcinoma cells suppresses the maliganant phenotype and conters immuno-therapeutic competene against parental cells. Cancer Res.1992,52(6):3677～3682.
5，Tsang KY,Kashmir SV,Qi Ce,et al. Tranfer of the IL-6 gene into a human coloretal carcinoma cell line and consequent enhacement of tumor antigen expression. Immnol Letter,1993，36(1)：179～182.
6，肖 冰，周殿元，姜 泊，等. IL-6基因转导大肠癌细胞的表达. 胃肠病学和肝病学杂志，1998，6(4)：30～32.
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