去窦弓神经大鼠主动脉重建及机制探讨
作者：缪朝玉 陶霞 管云枫 杨友才 楚正绪 苏定冯
单位：缪朝玉(第二军医大学基础医学部药理学教研室，上海 200433.)；陶霞(第二军医大学基础医学部药理学教研室，上海 200433.)；管云枫(第二军医大学基础医学部药理学教研室，上海 200433.)；杨友才(第二军医大学基础医学部药理学教研室，上海 200433.)；楚正绪(第二军医大学基础医学部药理学教研室，上海 200433.)
关键词：血管重建；去窦弓神经；主动脉；血管紧张素Ⅱ；去甲肾上腺素；乙酰胆碱
第二军医大学学报000811 [摘要] 目的：观察去窦弓神经(SAD)大鼠主动脉重建及发生发展过程，初步探讨体液因素在其中的作用。方法：计算机图像分析测定主动脉形态；离体血管制备观察主动脉功能；放免法测定AngⅡ浓度。结果和结论：(1)主动脉结构重建在SAD后 4～16周时随时间延长而加重。从几何形态学和中膜显微结构改变来看，主动脉结构重建主要属血管肥厚型，且与平滑肌生长和胶原积聚有关。(2)主动脉对NE的收缩反应在SAD后 8～32周时进行性增强，对ACh的舒张反应在SAD后 8～32周时减弱。SAD后 32周时主动脉去内皮后对NE的收缩反应增强作用消失。提示血管功能改变与内皮和(或)内皮与平滑肌的相互作用改变有关。(3)SAD后 10周时，血浆AngⅡ浓度无明显改变，而主动脉AngⅡ浓度升高。提示组织RAS激活可能参与SAD引起的主动脉重建。
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[中图分类号] R 543.1 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)08-0734-05
Aortic remodeling in rats with chronic sinoaortic denervation
MIAO Chao-Yu TAO Xia GUAN Yun-Feng YANG You-Cai CHU Zheng-Xu SU Ding-Feng
(Department of Pharmacology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
[ABSTRACT] Objective: To study aortic remodeling produced by chronic sinoaortic denervation (SAD) and its time course, and to examine the role of humoral factor in the SAD-induced aortic remodeling. Methods: In rats with chronic SAD or sham operation, aortic structure was measured by computer image analysis, aortic function by isolated artery preparation, and angiotensinⅡ concentration by radioimmunoassay. Results and Conclusion: (1)The aortic structural remodeling developed progressively 4, 8, 16 and 32 weeks after SAD. Aortic structural remodeling after SAD expressed was mainly aortic hypertrophy due to SMC growth and collagen accumulation. (2)The aortic contraction elicited by norepinephrine (NE) was progressively increased at 8, 16 and 32 weeks after SAD. The aortic relaxation elicited by acetylcholine (ACh) was depressed at 8, 16 and 32 weeks after SAD. In addition, we found that in 32-week SAD rats the NE-induced contraction was not increased by endothelial denudation. These indicated that the increased contraction and depressed relaxation after SAD were related to the change of endothelium and/or the change of interaction between endothelium and SMC. (3)In 10-week SAD rats, plasma angiotensinⅡ concentration remained unchanged, whereas aortic angiotensinⅡ concentration was significantly increased, suggesting that activation of tissue renin-angiotensin system may be involved in SAD-induced aortic remodeling.
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[KEY WORDS] vascular remodeling; sinoaortic denervation; aorta; angiotensinⅡ; norepinephrine; acetylcholine
临床研究表明，高血压患者的血压波动性(blood pressure variability, BPV)显著高于正常人，其靶器官损伤程度除与血压相关外，还与BPV密切相关。我们还发现多种高血压动物的BPV显著升高，老年自发性高血压大鼠(SHR)靶器官损伤程度与BPV的相关性高于其与血压的相关性[1]，对SHR采用降BPV的抗高血压药尼群地平治疗能减轻靶器官损伤，而采用升BPV的抗高血压药肼屈嗪治疗却加重靶器官损伤[2]，提示血压不稳定(即BPV升高)是高血压靶器官损伤的危险因子。我们采用单纯血压波动性升高(不伴有持续性高血压)的长期去窦弓神经(sinoaortic denervation，SAD)大鼠模型进行了研究，发现大鼠SAD后16周其24 h血压均值保持不变，而BPV显著升高，同时伴有明显的心、肾等器官损伤，其程度与BPV密切相关[3]。本研究将着重观察长期SAD大鼠主动脉重建(结构和功能改变)及发生发展过程，并初步探讨肾素-血管紧张素系统(RAS)在主动脉重建中的可能作用。
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1 材料和方法
1.1 实验设计 在SAD术后4，8，16，32周大鼠及相应的假手术(sham operation, Sham)大鼠上，经SAD检验后，选为合格动物，进行离体胸主动脉的收缩、舒张功能测定和腹主动脉的形态学研究。在SAD术后10周大鼠及相应Sham大鼠上，测定血浆和主动脉的血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)浓度。
1.2 SAD大鼠的制备 将10周龄雄性Sprague-Dawley大鼠(上海SIPPR-BK实验动物有限公司提供)用盐酸氯胺酮(上海中西药业股份有限公司生产)50 mg/kg加地西泮(上海旭东海普药业有限公司生产)5 mg/kg ip麻醉。仰卧位，颈部正中切开后分离出双侧主动脉神经和喉上神经并切断。再暴露颈动脉窦区域，清除该区的神经支配，并用10%的苯酚溶液涂擦局部，最后缝合切口。对照组在同样条件下施行假手术。术后大鼠经随机分组，常规饲养4～32周。
1.3 SAD检验 SAD大鼠采用上述ip麻醉，行颈外静脉插管和经股动脉的低位腹主动脉插管，24 h后在清醒自由活动状态下iv去氧肾上腺素(上海禾丰制药有限公司生产)3～5 μg/kg，如果血压升高≥6.7 kPa，而心率减慢<20次/min，则认为SAD完全。SAD完全者进行下一步研究。Sham大鼠进行上述同样检验时，心率减慢为60～100次/min，全部用作对照研究。
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1.4 胸主动脉收缩和舒张功能的测定 大鼠称体质量后用上述药物ip麻醉，开胸，取位置相对固定的胸主动脉条，移入95%O2+5%CO2饱和的K-H液内(37℃)，剔除粘附于主动脉周围的脂肪，截取2～3 mm长的2～3个主动脉环，需要去内皮的则用机械法去内皮。随后用自制金属钩将动脉环悬置于含K-H液，95%O2+5%CO2，37℃的浴槽中，一端连接张力换能器(LWA-20，上海广和电子电器厂)和台式平衡记录仪(XMT-204，上海大华仪表厂)，调节静息张力为2 g(1 g=0.009 8 N)，稳定60 min，每隔15 min换液1次，然后在去甲肾上腺素(NE)1×10-7 mol/L预激动条件下，制作有内皮血管环对乙酰胆碱(ACh)的舒张反应的量-效曲线，再冲洗稳定30 min后，制作对NE的收缩反应的量-效曲线。去内皮血管环在NE 1×10-7 mol/L预激动条件下，用ACh 1×10-6 mol/L检验内皮去除是否完全，再冲洗稳定30 min后，制作对NE的收缩反应的量-效曲线。收缩反应以增加的张力(mg)表示，舒张反应以张力下降幅度与NE 1×10-7 mol/L预激动引起的张力升高幅度之比(%)表示。
, 百拇医药
1.5 腹主动脉形态学研究 (1)取材、组织切片和染色：大鼠胸主动脉取出用于功能测定后，结扎在体胸主动脉断端(近膈肌)，行腹主动脉远心端(尽可能远)向心方向插管，并采用10%中性甲醛液在12 kPa压力下灌注固定30 min，然后取肾动脉分支处以下的腹主动脉，置于装有上述固定液的瓶中继续固定24 h以上。常规石蜡包埋，连续切片，片厚5 μm。分别用H-E染平滑肌细胞核、维多利亚蓝(VB)染弹性纤维、苯胺蓝染胶原纤维、酸性茜素蓝染平滑肌。(2)计算机图像分析：采用中国科学院研制的通用颗粒计算机图像分析系统软件。选H-E染色切片测定血管的几何形态学指标，即内径、外径、壁厚、壁面积、壁厚/内径比，每例测4个血管切面后取均值。选酸性茜素蓝染色切片、苯胺蓝染色切片、VB染色切片和H-E染色切片分别测定中膜平滑肌、胶原纤维、弹性纤维的相对面积和相同视野的平滑肌细胞核个数，每个血管切面测定4个视野，每例测定4个血管切面，最后取均值。
1.6 Ang Ⅱ的测定 (1)标本采集：大鼠断头后，立即用预冷的Na2-EDTA抗凝管收集躯干部血液5 ml，摇匀，置冰浴中冷却。同时立即取全长主动脉，以预冷的生理盐水洗涤，仔细剔除脂肪组织，吸干后取60～80 mg腹主动脉放入预冷的冻存管，并冻存于液氮中。(2)标本处理：将冷却的全血在4℃下4 000 r/min离心15 min，取血浆1 ml，加试剂盒(北京中国原子能科学研究院生产)提供的酶抑制剂1和2各10和20 μl，摇匀，置-20℃待测血浆AngⅡ浓度。主动脉标本从液氮中取出后，融化，剪碎，放入预冷的含0.75 ml 0.5 mol/L乙酸的匀浆管中，在冰浴中充分匀浆，然后加 0.5 mol/L氢氧化钠0.75 ml，摇匀，在4℃下4 000 r/min离心20 min，取上清1 ml，加酶抑制剂1和2各10和20 μl，摇匀，置-20℃待测主动脉AngⅡ浓度。(3)AngⅡ的测定：采用放射免疫测定法，按试剂盒说明书操作。
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1.7 统计学处理 采用SAS软件进行统计处理。数据用
±s表示，除量-效曲线采用可重复测量的双因素方差分析以外，其余组间比较均采用非配对t检验。
2 结 果
2.1 SAD对主动脉形态结构的影响 与Sham大鼠比较，SAD大鼠体质量明显下降。腹主动脉形态结构改变在SAD后 4周时已经出现，8，16，32周时进行性加重。几何形态学改变(表1)表现为壁厚、壁面积、壁厚/内径比增加(SAD后 4～32周时)及内、外径扩大(SAD后 8～32周时)。中膜显微结构成分改变(图1)，表现为胶原纤维相对面积增加(SAD后 4～32周时)、平滑肌相对面积增加(SAD后 8～32周时)、弹性纤维相对面积减小(SAD后 8～32周时)，而同一视野的平滑肌细胞核个数无明显变化(SAD后 4～32周时)。
表 1 SAD大鼠腹主动脉几何形态学改变
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Tab 1 Geometric morphological changes of the abdominal aortas in rats after sinoaortic denervation(±s) Group
n
BM(m/g)
ID(l/mm)
ED(l/mm)
WT(l/m)
WA(A/mm2)
WT/ID(%)
, 百拇医药 Sham(t/week)
4
10
341± 5
1.52±0.25
1.66±0.27
74.9±11.0
0.38±0.11
4.96±0.32
8
10
410±21
, 百拇医药 1.53±0.13
1.69±0.14
77.5± 7.7
0.40±0.08
5.05±0.23
16
10
508±27
1.65±0.06
1.81±0.07
82.6± 5.8
0.45±0.04
, 百拇医药
5.01±0.34
32
10
564±35
1.81±0.18
1.98±0.18
87.4± 5.9
0.52±0.08
4.86±0.42
SAD(t/week)
4
9
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303±10**
1.59±0.11
1.78±0.13
99.2±12.7**
0.53±0.10**
6.20±0.57**
8
9
374±22**
1.75±0.16**
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1.97±0.17**
110.1±10.2**
0.67±0.14**
6.32±0.42**
16
9
457±22**
1.87±0.14**
2.09±0.15**
114.0±8.8**
, 百拇医药
0.71±0.10**
6.11±0.39**
32
7
489±26**
1.99±0.09*
2.24±0.10**
122.4±7.4**
0.82±0.08**
6.14±0.37**
, 百拇医药
Sham: Sham operation; SAD: Sinoaortic denervation; BM: Body mass; ID: Internal diameter; ED: External diameter; WT: Wall thickness; WA: Wall area; * P<0.05, ** P<0.01 vs time-matched Sham
图 1 SAD大鼠腹主动脉中膜显微结构成分的改变
Fig 1 Changes in medial microstructural components of the
abdominal aortas in rats after sinoaortic denervation
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Sham: Sham operation; SAD: Sinoaortic denervation; SMC: Smooth muscle cell; ○: SMC in sham group; ●: SMC in SAD group; △: Collagen in sham group; ▲: Collagen in SAD group; □: Elastin in sham group; ■: Elastin in SAD group;*P<0.05, ** P<0.01 vs time-matched Sham； n is indicated in Tab 1
2.2 SAD对主动脉收缩和舒张功能的影响
2.2.1 胸主动脉对NE的收缩反应 与相应Sham组比较，SAD后胸主动脉对NE的收缩反应在4周时无明显改变(P＝0.438)，在8，16，32周时明显增强(P<0.01)。比较术后不同时间血管的NE收缩反应，Sham组不同时间的血管收缩反应无明显变化，而SAD组不同时间的血管收缩反应却随时间增加而增强(图2)。比较术后32周血管内皮完整时与内皮去除时的NE收缩反应(图3)，可见Sham组血管去除内皮后NE收缩反应明显增强，而SAD组血管去除内皮后NE收缩反应与内皮完整时没有明显差别，且出现下降趋势，这使得去内皮血管的NE收缩反应在Sham与SAD两组间无明显差别。
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图 2 SAD大鼠胸主动脉收缩反应的改变
Fig 2 Changes in thoracic aortic contraction
induced by norepinephrine in rats after
sinoaortic denervation
●: SAD 4 week; ■: SAD 8 week; ▲: SAD 16 week;
◆: SAD 32 week; ** P<0.01 vs SAD 4 week;
△△ P<0.01 vs SAD 8 week; n=6
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图 3 去内皮对SAD和Sham大鼠胸主动脉收缩反应的影响
Fig 3 Effects of endothelial denudation on thoracic
aortic contraction induced by norepinephrine in
32-week SAD and Sham rats
E(+): Aorta with endothelium; E(-): Aorta without endothelium;○: Sham E(+); ●: SAD E(+); □: Sham E(-); ■: SAD E(-); ** P<0.01 SAD vs Sham; △△ P<0.01 E(-) vs E(+); n=6
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2.2.2 胸主动脉对ACh的舒张反应 与相应Sham组比较，SAD后胸主动脉对ACh的舒张反应在4周时无明显改变(P=0.1165)，在8，16，32周时明显下降(P<0.01)。比较术后不同时间血管的ACh舒张反应，Sham组不同时间的血管舒张反应无明显变化，而SAD组不同时间的血管舒张反应却随时间增加而降低(图4)，但SAD后后16，32周时血管舒张反应无进一步下降(与SAD后 8周时比较)。
图 4 SAD大鼠胸主动脉舒张反应的改变
Fig 4 Changes in thoracic aortic relaxation induced by
acetylcholine in rats after of sinoaortic denervation
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●: SAD 4 week; ■: SAD 8 week; ▲: SAD 16 week;
◆: SAD 32 week；** P<0.01 vs SAD 4 week; n=6
2.3 SAD大鼠血浆和主动脉AngⅡ浓度的改变 大鼠SAD后10周时，血浆AngⅡ浓度为(73±80) pg/ml(n=8),与Sham组[(54±26) pg/ml，n=5]比较无显著改变；而主动脉组织AngⅡ浓度为(340±163) pg/g,较对照组[(141±100) pg/g]显著升高(P<0.05)。
3 讨 论
3.1 SAD大鼠主动脉结构重建 目前认为，血管结构重建有两种不同类型[4]：一种是血管重排，其管壁增厚由原有管壁细胞和基质围绕缩小的管腔内径重新排列所引起，此时管壁面积不变、内径和外径均减小；另一种是血管肥厚，其管壁增厚主要由管壁生长反应所引起，此时管壁面积增加、内径不变或减小、外径不变或增加。根据这一概念分析SAD大鼠腹主动脉的几何形态学参数改变，可知SAD后主动脉的结构重建主要属血管肥厚类型。从时间上来看，SAD后4周时主动脉的结构重建已出现，以后随着时间的延长在8，16，32周时进一步加重。而且中膜显微结构成分研究结果进一步提示这种血管肥厚至少与SMC生长和胶原积聚有关。SMC生长包括肥大(体积增加)和(或)增生(数量增加)。本实验结果表明，SAD后腹主动脉SMC肥大，因为SMC相对面积增加时细胞核个数不变。Lacolley等[5]曾经报道SAD后6周大鼠腹主动脉中膜面积和胶原纤维增加，而SMC和弹性纤维变化不明显，这一结果与本实验SAD后4周时的结果一致。
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3.2 SAD大鼠胸主动脉收缩和舒张功能的改变 血管重建不但表现为血管形态结构的变化，而且也表现为血管功能的变化[6]。本研究结果表明，SAD后4周时胸主动脉的收缩和舒张功能无明显改变，SAD后8，16，32周时血管的收缩反应进行性增强，舒张反应减弱，但舒张反应在SAD后8周以后无进一步减弱。测试术后32周血管去内皮后NE的收缩反应，发现Sham与SAD两组间无明显差别，说明SAD后胸主动脉平滑肌对NE的反应性没有改变，其内皮完整时NE收缩反应增强与内皮和(或)内皮与平滑肌的相互作用改变有关。ACh引起的血管平滑肌舒张反应依赖于血管内皮[7]，因此，SAD后ACh舒张反应减弱也与内皮和(或)内皮与平滑肌的相互作用改变有关。结合形态学研究结果，SAD后4周时胸主动脉SMC无明显改变，NE收缩反应和ACh舒张反应也无明显改变，SAD后8，16，32周时胸主动脉SMC出现肥大，NE收缩反应和ACh舒张反应也出现改变，故推测SMC改变与血管NE收缩反应和ACh舒张反应改变有关。
3.3 SAD大鼠主动脉重建的可能机制 有关长期SAD大鼠器官损伤机制，以往研究主要关注血流动力学改变在其中的作用，认为长期SAD大鼠单纯BPV升高(不伴持续性高血压)与器官损伤有关[3，8]。本研究首次报道了长期SAD大鼠AngⅡ改变。研究证实，RAS对正常血管结构和功能起重要的调节作用，RAS激活可致血管重建[4，9]。本实验结果表明，长期SAD大鼠血浆AngⅡ浓度无明显改变，但主动脉AngⅡ浓度明显升高，提示局部组织RAS(而非循环RAS)激活可能参与长期SAD引起的主动脉重建。
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注：本文曾在第三届中法药理学学术交流大会上英文报告(1998.12)
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(39670831).
[作者简介] 缪朝玉(1965-)，女(汉族)，博士，讲师.
苏定冯(第二军医大学基础医学部药理学教研室，上海 200433.)
[参 考 文 献]
[1] 张黎明，程 勇，刘建华，等. 老年自发性高血压大鼠血压波动性与靶器官损伤[J]. 高血压杂志，1996，4(1)：7-10.
[2] 刘建国，龚 侃，程 勇，等. 改变血压波动性对靶器官损伤的影响[J]. 第二军医大学学报，1998，19(6)：515-518.
, 百拇医药
[3] 龚 侃，刘建国，程 勇，等. 血压波动性增高引起的器官损伤[J]. 第二军医大学学报，1997，18(5)：462-464.
[4] Dzau VJ, Gibbons GH. Vascular remodeling: mechanisms and implications[J]. J Cardiovasc Pharmacol, 1993, 21(Suppl 1): S1-S5.
[5] Lacolley P, Bezie Y, Girerd X, et al. Aortic distensibility and structural changes in sinoaortic-denervated rats[J]. Hypertension, 1995, 26(2): 337-340.
[6] Gohlke P, Lamberty V, Kuwer I, et al. Vascular remodeling in systemic hypertension[J]. Am J Cardiol, 1993, 71(17): 2E-7E.
, 百拇医药
[7] Furchgott RF, Zawadzki JV. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine[J]. Nature, 1980, 288(5789): 373-376.
[8] van Vliet BN, Chafe LL, Montani JP. Contribution of baroreceptors and chemoreceptors to ventricular hypertrophy produced by sino-aortic denervation in rats[J]. J Physiol, 1999, 516(3): 885-895.
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[收稿日期] 2000-01-24
[修回日期] 2000-05-15, 百拇医药
单位：缪朝玉(第二军医大学基础医学部药理学教研室，上海 200433.)；陶霞(第二军医大学基础医学部药理学教研室，上海 200433.)；管云枫(第二军医大学基础医学部药理学教研室，上海 200433.)；杨友才(第二军医大学基础医学部药理学教研室，上海 200433.)；楚正绪(第二军医大学基础医学部药理学教研室，上海 200433.)
关键词：血管重建；去窦弓神经；主动脉；血管紧张素Ⅱ；去甲肾上腺素；乙酰胆碱
第二军医大学学报000811 [摘要] 目的：观察去窦弓神经(SAD)大鼠主动脉重建及发生发展过程，初步探讨体液因素在其中的作用。方法：计算机图像分析测定主动脉形态；离体血管制备观察主动脉功能；放免法测定AngⅡ浓度。结果和结论：(1)主动脉结构重建在SAD后 4～16周时随时间延长而加重。从几何形态学和中膜显微结构改变来看，主动脉结构重建主要属血管肥厚型，且与平滑肌生长和胶原积聚有关。(2)主动脉对NE的收缩反应在SAD后 8～32周时进行性增强，对ACh的舒张反应在SAD后 8～32周时减弱。SAD后 32周时主动脉去内皮后对NE的收缩反应增强作用消失。提示血管功能改变与内皮和(或)内皮与平滑肌的相互作用改变有关。(3)SAD后 10周时，血浆AngⅡ浓度无明显改变，而主动脉AngⅡ浓度升高。提示组织RAS激活可能参与SAD引起的主动脉重建。
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[中图分类号] R 543.1 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)08-0734-05
Aortic remodeling in rats with chronic sinoaortic denervation
MIAO Chao-Yu TAO Xia GUAN Yun-Feng YANG You-Cai CHU Zheng-Xu SU Ding-Feng
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[ABSTRACT] Objective: To study aortic remodeling produced by chronic sinoaortic denervation (SAD) and its time course, and to examine the role of humoral factor in the SAD-induced aortic remodeling. Methods: In rats with chronic SAD or sham operation, aortic structure was measured by computer image analysis, aortic function by isolated artery preparation, and angiotensinⅡ concentration by radioimmunoassay. Results and Conclusion: (1)The aortic structural remodeling developed progressively 4, 8, 16 and 32 weeks after SAD. Aortic structural remodeling after SAD expressed was mainly aortic hypertrophy due to SMC growth and collagen accumulation. (2)The aortic contraction elicited by norepinephrine (NE) was progressively increased at 8, 16 and 32 weeks after SAD. The aortic relaxation elicited by acetylcholine (ACh) was depressed at 8, 16 and 32 weeks after SAD. In addition, we found that in 32-week SAD rats the NE-induced contraction was not increased by endothelial denudation. These indicated that the increased contraction and depressed relaxation after SAD were related to the change of endothelium and/or the change of interaction between endothelium and SMC. (3)In 10-week SAD rats, plasma angiotensinⅡ concentration remained unchanged, whereas aortic angiotensinⅡ concentration was significantly increased, suggesting that activation of tissue renin-angiotensin system may be involved in SAD-induced aortic remodeling.
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[KEY WORDS] vascular remodeling; sinoaortic denervation; aorta; angiotensinⅡ; norepinephrine; acetylcholine
临床研究表明，高血压患者的血压波动性(blood pressure variability, BPV)显著高于正常人，其靶器官损伤程度除与血压相关外，还与BPV密切相关。我们还发现多种高血压动物的BPV显著升高，老年自发性高血压大鼠(SHR)靶器官损伤程度与BPV的相关性高于其与血压的相关性[1]，对SHR采用降BPV的抗高血压药尼群地平治疗能减轻靶器官损伤，而采用升BPV的抗高血压药肼屈嗪治疗却加重靶器官损伤[2]，提示血压不稳定(即BPV升高)是高血压靶器官损伤的危险因子。我们采用单纯血压波动性升高(不伴有持续性高血压)的长期去窦弓神经(sinoaortic denervation，SAD)大鼠模型进行了研究，发现大鼠SAD后16周其24 h血压均值保持不变，而BPV显著升高，同时伴有明显的心、肾等器官损伤，其程度与BPV密切相关[3]。本研究将着重观察长期SAD大鼠主动脉重建(结构和功能改变)及发生发展过程，并初步探讨肾素-血管紧张素系统(RAS)在主动脉重建中的可能作用。
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1 材料和方法
1.1 实验设计 在SAD术后4，8，16，32周大鼠及相应的假手术(sham operation, Sham)大鼠上，经SAD检验后，选为合格动物，进行离体胸主动脉的收缩、舒张功能测定和腹主动脉的形态学研究。在SAD术后10周大鼠及相应Sham大鼠上，测定血浆和主动脉的血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)浓度。
1.2 SAD大鼠的制备 将10周龄雄性Sprague-Dawley大鼠(上海SIPPR-BK实验动物有限公司提供)用盐酸氯胺酮(上海中西药业股份有限公司生产)50 mg/kg加地西泮(上海旭东海普药业有限公司生产)5 mg/kg ip麻醉。仰卧位，颈部正中切开后分离出双侧主动脉神经和喉上神经并切断。再暴露颈动脉窦区域，清除该区的神经支配，并用10%的苯酚溶液涂擦局部，最后缝合切口。对照组在同样条件下施行假手术。术后大鼠经随机分组，常规饲养4～32周。
1.3 SAD检验 SAD大鼠采用上述ip麻醉，行颈外静脉插管和经股动脉的低位腹主动脉插管，24 h后在清醒自由活动状态下iv去氧肾上腺素(上海禾丰制药有限公司生产)3～5 μg/kg，如果血压升高≥6.7 kPa，而心率减慢<20次/min，则认为SAD完全。SAD完全者进行下一步研究。Sham大鼠进行上述同样检验时，心率减慢为60～100次/min，全部用作对照研究。
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1.4 胸主动脉收缩和舒张功能的测定 大鼠称体质量后用上述药物ip麻醉，开胸，取位置相对固定的胸主动脉条，移入95%O2+5%CO2饱和的K-H液内(37℃)，剔除粘附于主动脉周围的脂肪，截取2～3 mm长的2～3个主动脉环，需要去内皮的则用机械法去内皮。随后用自制金属钩将动脉环悬置于含K-H液，95%O2+5%CO2，37℃的浴槽中，一端连接张力换能器(LWA-20，上海广和电子电器厂)和台式平衡记录仪(XMT-204，上海大华仪表厂)，调节静息张力为2 g(1 g=0.009 8 N)，稳定60 min，每隔15 min换液1次，然后在去甲肾上腺素(NE)1×10-7 mol/L预激动条件下，制作有内皮血管环对乙酰胆碱(ACh)的舒张反应的量-效曲线，再冲洗稳定30 min后，制作对NE的收缩反应的量-效曲线。去内皮血管环在NE 1×10-7 mol/L预激动条件下，用ACh 1×10-6 mol/L检验内皮去除是否完全，再冲洗稳定30 min后，制作对NE的收缩反应的量-效曲线。收缩反应以增加的张力(mg)表示，舒张反应以张力下降幅度与NE 1×10-7 mol/L预激动引起的张力升高幅度之比(%)表示。
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1.5 腹主动脉形态学研究 (1)取材、组织切片和染色：大鼠胸主动脉取出用于功能测定后，结扎在体胸主动脉断端(近膈肌)，行腹主动脉远心端(尽可能远)向心方向插管，并采用10%中性甲醛液在12 kPa压力下灌注固定30 min，然后取肾动脉分支处以下的腹主动脉，置于装有上述固定液的瓶中继续固定24 h以上。常规石蜡包埋，连续切片，片厚5 μm。分别用H-E染平滑肌细胞核、维多利亚蓝(VB)染弹性纤维、苯胺蓝染胶原纤维、酸性茜素蓝染平滑肌。(2)计算机图像分析：采用中国科学院研制的通用颗粒计算机图像分析系统软件。选H-E染色切片测定血管的几何形态学指标，即内径、外径、壁厚、壁面积、壁厚/内径比，每例测4个血管切面后取均值。选酸性茜素蓝染色切片、苯胺蓝染色切片、VB染色切片和H-E染色切片分别测定中膜平滑肌、胶原纤维、弹性纤维的相对面积和相同视野的平滑肌细胞核个数，每个血管切面测定4个视野，每例测定4个血管切面，最后取均值。
1.6 Ang Ⅱ的测定 (1)标本采集：大鼠断头后，立即用预冷的Na2-EDTA抗凝管收集躯干部血液5 ml，摇匀，置冰浴中冷却。同时立即取全长主动脉，以预冷的生理盐水洗涤，仔细剔除脂肪组织，吸干后取60～80 mg腹主动脉放入预冷的冻存管，并冻存于液氮中。(2)标本处理：将冷却的全血在4℃下4 000 r/min离心15 min，取血浆1 ml，加试剂盒(北京中国原子能科学研究院生产)提供的酶抑制剂1和2各10和20 μl，摇匀，置-20℃待测血浆AngⅡ浓度。主动脉标本从液氮中取出后，融化，剪碎，放入预冷的含0.75 ml 0.5 mol/L乙酸的匀浆管中，在冰浴中充分匀浆，然后加 0.5 mol/L氢氧化钠0.75 ml，摇匀，在4℃下4 000 r/min离心20 min，取上清1 ml，加酶抑制剂1和2各10和20 μl，摇匀，置-20℃待测主动脉AngⅡ浓度。(3)AngⅡ的测定：采用放射免疫测定法，按试剂盒说明书操作。
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1.7 统计学处理 采用SAS软件进行统计处理。数据用
±s表示，除量-效曲线采用可重复测量的双因素方差分析以外，其余组间比较均采用非配对t检验。2 结 果
2.1 SAD对主动脉形态结构的影响 与Sham大鼠比较，SAD大鼠体质量明显下降。腹主动脉形态结构改变在SAD后 4周时已经出现，8，16，32周时进行性加重。几何形态学改变(表1)表现为壁厚、壁面积、壁厚/内径比增加(SAD后 4～32周时)及内、外径扩大(SAD后 8～32周时)。中膜显微结构成分改变(图1)，表现为胶原纤维相对面积增加(SAD后 4～32周时)、平滑肌相对面积增加(SAD后 8～32周时)、弹性纤维相对面积减小(SAD后 8～32周时)，而同一视野的平滑肌细胞核个数无明显变化(SAD后 4～32周时)。
表 1 SAD大鼠腹主动脉几何形态学改变
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Tab 1 Geometric morphological changes of the abdominal aortas in rats after sinoaortic denervation(
±s) Groupn
BM(m/g)
ID(l/mm)
ED(l/mm)
WT(l/m)
WA(A/mm2)
WT/ID(%)
, 百拇医药 Sham(t/week)
4
10
341± 5
1.52±0.25
1.66±0.27
74.9±11.0
0.38±0.11
4.96±0.32
8
10
410±21
, 百拇医药 1.53±0.13
1.69±0.14
77.5± 7.7
0.40±0.08
5.05±0.23
16
10
508±27
1.65±0.06
1.81±0.07
82.6± 5.8
0.45±0.04
, 百拇医药
5.01±0.34
32
10
564±35
1.81±0.18
1.98±0.18
87.4± 5.9
0.52±0.08
4.86±0.42
SAD(t/week)
4
9
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303±10**
1.59±0.11
1.78±0.13
99.2±12.7**
0.53±0.10**
6.20±0.57**
8
9
374±22**
1.75±0.16**
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1.97±0.17**
110.1±10.2**
0.67±0.14**
6.32±0.42**
16
9
457±22**
1.87±0.14**
2.09±0.15**
114.0±8.8**
, 百拇医药
0.71±0.10**
6.11±0.39**
32
7
489±26**
1.99±0.09*
2.24±0.10**
122.4±7.4**
0.82±0.08**
6.14±0.37**
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Sham: Sham operation; SAD: Sinoaortic denervation; BM: Body mass; ID: Internal diameter; ED: External diameter; WT: Wall thickness; WA: Wall area; * P<0.05, ** P<0.01 vs time-matched Sham
图 1 SAD大鼠腹主动脉中膜显微结构成分的改变
Fig 1 Changes in medial microstructural components of the
abdominal aortas in rats after sinoaortic denervation
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Sham: Sham operation; SAD: Sinoaortic denervation; SMC: Smooth muscle cell; ○: SMC in sham group; ●: SMC in SAD group; △: Collagen in sham group; ▲: Collagen in SAD group; □: Elastin in sham group; ■: Elastin in SAD group;*P<0.05, ** P<0.01 vs time-matched Sham； n is indicated in Tab 1
2.2 SAD对主动脉收缩和舒张功能的影响
2.2.1 胸主动脉对NE的收缩反应 与相应Sham组比较，SAD后胸主动脉对NE的收缩反应在4周时无明显改变(P＝0.438)，在8，16，32周时明显增强(P<0.01)。比较术后不同时间血管的NE收缩反应，Sham组不同时间的血管收缩反应无明显变化，而SAD组不同时间的血管收缩反应却随时间增加而增强(图2)。比较术后32周血管内皮完整时与内皮去除时的NE收缩反应(图3)，可见Sham组血管去除内皮后NE收缩反应明显增强，而SAD组血管去除内皮后NE收缩反应与内皮完整时没有明显差别，且出现下降趋势，这使得去内皮血管的NE收缩反应在Sham与SAD两组间无明显差别。
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图 2 SAD大鼠胸主动脉收缩反应的改变
Fig 2 Changes in thoracic aortic contraction
induced by norepinephrine in rats after
sinoaortic denervation
●: SAD 4 week; ■: SAD 8 week; ▲: SAD 16 week;
◆: SAD 32 week; ** P<0.01 vs SAD 4 week;
△△ P<0.01 vs SAD 8 week; n=6
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图 3 去内皮对SAD和Sham大鼠胸主动脉收缩反应的影响
Fig 3 Effects of endothelial denudation on thoracic
aortic contraction induced by norepinephrine in
32-week SAD and Sham rats
E(+): Aorta with endothelium; E(-): Aorta without endothelium;○: Sham E(+); ●: SAD E(+); □: Sham E(-); ■: SAD E(-); ** P<0.01 SAD vs Sham; △△ P<0.01 E(-) vs E(+); n=6
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2.2.2 胸主动脉对ACh的舒张反应 与相应Sham组比较，SAD后胸主动脉对ACh的舒张反应在4周时无明显改变(P=0.1165)，在8，16，32周时明显下降(P<0.01)。比较术后不同时间血管的ACh舒张反应，Sham组不同时间的血管舒张反应无明显变化，而SAD组不同时间的血管舒张反应却随时间增加而降低(图4)，但SAD后后16，32周时血管舒张反应无进一步下降(与SAD后 8周时比较)。
图 4 SAD大鼠胸主动脉舒张反应的改变
Fig 4 Changes in thoracic aortic relaxation induced by
acetylcholine in rats after of sinoaortic denervation
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●: SAD 4 week; ■: SAD 8 week; ▲: SAD 16 week;
◆: SAD 32 week；** P<0.01 vs SAD 4 week; n=6
2.3 SAD大鼠血浆和主动脉AngⅡ浓度的改变 大鼠SAD后10周时，血浆AngⅡ浓度为(73±80) pg/ml(n=8),与Sham组[(54±26) pg/ml，n=5]比较无显著改变；而主动脉组织AngⅡ浓度为(340±163) pg/g,较对照组[(141±100) pg/g]显著升高(P<0.05)。
3 讨 论
3.1 SAD大鼠主动脉结构重建 目前认为，血管结构重建有两种不同类型[4]：一种是血管重排，其管壁增厚由原有管壁细胞和基质围绕缩小的管腔内径重新排列所引起，此时管壁面积不变、内径和外径均减小；另一种是血管肥厚，其管壁增厚主要由管壁生长反应所引起，此时管壁面积增加、内径不变或减小、外径不变或增加。根据这一概念分析SAD大鼠腹主动脉的几何形态学参数改变，可知SAD后主动脉的结构重建主要属血管肥厚类型。从时间上来看，SAD后4周时主动脉的结构重建已出现，以后随着时间的延长在8，16，32周时进一步加重。而且中膜显微结构成分研究结果进一步提示这种血管肥厚至少与SMC生长和胶原积聚有关。SMC生长包括肥大(体积增加)和(或)增生(数量增加)。本实验结果表明，SAD后腹主动脉SMC肥大，因为SMC相对面积增加时细胞核个数不变。Lacolley等[5]曾经报道SAD后6周大鼠腹主动脉中膜面积和胶原纤维增加，而SMC和弹性纤维变化不明显，这一结果与本实验SAD后4周时的结果一致。
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3.2 SAD大鼠胸主动脉收缩和舒张功能的改变 血管重建不但表现为血管形态结构的变化，而且也表现为血管功能的变化[6]。本研究结果表明，SAD后4周时胸主动脉的收缩和舒张功能无明显改变，SAD后8，16，32周时血管的收缩反应进行性增强，舒张反应减弱，但舒张反应在SAD后8周以后无进一步减弱。测试术后32周血管去内皮后NE的收缩反应，发现Sham与SAD两组间无明显差别，说明SAD后胸主动脉平滑肌对NE的反应性没有改变，其内皮完整时NE收缩反应增强与内皮和(或)内皮与平滑肌的相互作用改变有关。ACh引起的血管平滑肌舒张反应依赖于血管内皮[7]，因此，SAD后ACh舒张反应减弱也与内皮和(或)内皮与平滑肌的相互作用改变有关。结合形态学研究结果，SAD后4周时胸主动脉SMC无明显改变，NE收缩反应和ACh舒张反应也无明显改变，SAD后8，16，32周时胸主动脉SMC出现肥大，NE收缩反应和ACh舒张反应也出现改变，故推测SMC改变与血管NE收缩反应和ACh舒张反应改变有关。
3.3 SAD大鼠主动脉重建的可能机制 有关长期SAD大鼠器官损伤机制，以往研究主要关注血流动力学改变在其中的作用，认为长期SAD大鼠单纯BPV升高(不伴持续性高血压)与器官损伤有关[3，8]。本研究首次报道了长期SAD大鼠AngⅡ改变。研究证实，RAS对正常血管结构和功能起重要的调节作用，RAS激活可致血管重建[4，9]。本实验结果表明，长期SAD大鼠血浆AngⅡ浓度无明显改变，但主动脉AngⅡ浓度明显升高，提示局部组织RAS(而非循环RAS)激活可能参与长期SAD引起的主动脉重建。
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注：本文曾在第三届中法药理学学术交流大会上英文报告(1998.12)
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(39670831).
[作者简介] 缪朝玉(1965-)，女(汉族)，博士，讲师.
苏定冯(第二军医大学基础医学部药理学教研室，上海 200433.)
[参 考 文 献]
[1] 张黎明，程 勇，刘建华，等. 老年自发性高血压大鼠血压波动性与靶器官损伤[J]. 高血压杂志，1996，4(1)：7-10.
[2] 刘建国，龚 侃，程 勇，等. 改变血压波动性对靶器官损伤的影响[J]. 第二军医大学学报，1998，19(6)：515-518.
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[3] 龚 侃，刘建国，程 勇，等. 血压波动性增高引起的器官损伤[J]. 第二军医大学学报，1997，18(5)：462-464.
[4] Dzau VJ, Gibbons GH. Vascular remodeling: mechanisms and implications[J]. J Cardiovasc Pharmacol, 1993, 21(Suppl 1): S1-S5.
[5] Lacolley P, Bezie Y, Girerd X, et al. Aortic distensibility and structural changes in sinoaortic-denervated rats[J]. Hypertension, 1995, 26(2): 337-340.
[6] Gohlke P, Lamberty V, Kuwer I, et al. Vascular remodeling in systemic hypertension[J]. Am J Cardiol, 1993, 71(17): 2E-7E.
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[7] Furchgott RF, Zawadzki JV. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine[J]. Nature, 1980, 288(5789): 373-376.
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[收稿日期] 2000-01-24
[修回日期] 2000-05-15, 百拇医药