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编号:10222794
己酮可可碱对肺缺血再灌注后粘附分子表达的影响
http://www.100md.com 《第三军医大学学报》 2000年第8期
     作者:牛会军 范士志 蒋耀光 陈建民 李志平 向明章

    单位:牛会军(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所胸心外科,重庆 400042);范士志(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所胸心外科,重庆 400042);蒋耀光(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所胸心外科,重庆 400042);陈建民(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所胸心外科,重庆 400042);李志平(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所胸心外科,重庆 400042)

    关键词:缺血再灌注;肺损伤;己酮可可碱;中性粒细胞;CD18;ICAM-1

    第三军医大学学报000808

    提 要: 目的 探讨己酮可可碱对肺缺血再灌注损伤后中性粒细胞(PMN)表面CD18、肺组织ICAM-1表达的影响。方法 72只大鼠随机化方法分为假手术组、缺血再灌注组、PTX组。采用肺在体温缺血再灌注损伤模型,于缺血45 min、再灌注1、2、4 h测定肺组织含水量、支气管肺泡灌洗液(BALF)白蛋白含量、肺组织及BALF髓过氧化物酶(MPO)活性、流式细胞仪测定CD18-FITC标记的PMN阳性细胞百分率,肺组织ICAM-1免疫组化染色,并进行图像分析。结果 缺血再灌注组再灌注后各时相点肺含水量、BALF白蛋白含量、左肺组织及BALF MPO活性及CD18、ICAM-1表达均有非常显著的升高(P<0.01),PTX则可以明显抑制这种变化。结论 PTX可能通过降低肺缺血再灌注引起的CD11/CD18及ICAM-1的表达,而减轻PMN在肺内的聚集、活化,从而防治肺缺血再灌注损伤。
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    中图法分类号: R967;R619.9 文献标识码: A

    文章编号:1000-5404(2000)08-0737-03

    Effects of pentoxifylline on adhesion molecules expression in lung ischemia-reperfusion injury in rats

    NIU Hui-jun, FAN Shi-zhi, JIANG Yao-guang, CHEN Jian-min, LI Zhi-ping, XIANG Ming-zhang

    (Department of Thoracic Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042,China)
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    Abstract: Objective To study the effect of pentoxifylline on the expression of the CD18 and ICAM-1 after lung ischemia/reperfusion injury in rats. Methods The rat model of lung ischemia was estaleished with occlusion of left pulmonary hilus for 45 min. Seventy-two rats were divided into 3 groups: ① Sham operation group (GroupⅠ, n=24); ②Ischemia-reperfusion injury group (GroupⅡ,n=24); ③Pentoxifylline treatment group (GroupⅢ,n=24). Pentoxifylline was injected intravenously 5 min before and 45 min after normothermic ischemia. The changes of water content of lung, MPO and BALF albumin were studied 1 h, 2 h, 4 h during reperfusion after 45 min pulmonary ischemia. Flow cytometric analysis and immunohistochemistry were used to assess the expression of the CD18 on the polymorphonuclear neutrophil(PMN) and ICAM-1 on lung tissue. Results In groupⅡ, water content of lung, MPO and BALF albumin were increased evidently (P<0.05), the expression of CD18 and ICAM-1 were up-regulated. In groupⅢ, the changes were ameliorated as compared with groupⅡ. Conclusion Pentoxifylline can reduce the aggregation and activation of PMNs in the lungs through its effect to inhibit the expression of CD11/CD18 and ICAM-1 after pulmonary ischemia-reperfusion. Consequently pulmonary ischemia-repefusion injury is prevented.
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    Key words: ischemia-reperfusion; lung injury; neutrophil; pentoxifylline; CD18; ICAM-17

    中性粒细胞(Polymorphonuclear neutrophil,PMN)在肺内聚积是肺缺血再灌注损伤的重要特征之一,PMN在肺缺血再灌注损伤中起着至关重要的作用,白细胞粘附于血管内皮细胞是其发挥损伤作用关键步骤[1]。白细胞粘附有赖于白细胞和内皮细胞膜上粘附分子的介导。最近国外研究报道[2]己酮可可碱(Pentoxifylline,PTX)可以减轻肺缺血再灌注损伤,但具体机制尚不明确,PTX对肺缺血再灌注中粘附分子表达的影响尚未见报道。本研究采用在体大鼠肺缺血再灌注损伤模型,借助流式细胞仪和免疫组织化学技术,观察分析了PTX对肺缺血再灌注损伤后PMN表面CD18、肺组织ICAM-1表达的影响,并对其意义进行初步探讨。

    1 材料与方法
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    1.1 动物及分组

    雄性Wistar大鼠72只,体重200~250g,随机分为:Ⅰ组:假手术组,仅行开胸,未行缺血及再灌注处理;Ⅱ组:缺血再灌注组,行左肺缺血和再灌注处理;Ⅲ组:PTX组,行左肺缺血和再灌注处理,且于缺血前5min颈静脉注射PTX20mg/kg,并以6mg.kg-1.h-1维持(Ⅰ组和Ⅱ组给予等量生理盐水)。

    1.2 试剂

    鼠ICAM-1单克隆抗体(R&D公司,美国),鼠CD18-FITC单克隆抗体(Sigma公司,美国),Percoll细胞分离液(Pharmacia公司,瑞典)

    1.3 实验方法

    1.3.1 动物模型复制
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    3%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉,气管内插管连接DH-140B型动物人工呼吸机控制呼吸;右侧颈动脉插管,用于采集标本、监测动脉血压;右侧颈静脉插管,微量注射泵持续补液,补液速度为4ml.kg-1.h-1。经左第5肋间进入胸腔,游离左侧肺门,Ⅱ及Ⅲ组采用Okada等大鼠肺缺血再灌注损伤模型,静脉注射50U肝素5min后,肺充气状态下用无损伤动脉钳夹闭左侧肺门,阻断45min后松开动脉夹,形成再灌注。各组分别于缺血45min、再灌注1、2、4h动脉放血处死动物(n=6)、留取标本。

    1.3.2 检测指标和方法 肺组织含水量用干湿重法测定,支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolarlavagefluid,BALF)白蛋白含量用常规法检测,肺组织、BALF髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)活性参照罗武生等[3]方法测定;Percoll液分离大鼠血PMN,流式细胞仪测定CD18-FITC标记的PMN阳性细胞百分率,代表CD11/CD18的表达水平;肺组织ICAM-1免疫组织化学采用S-P法,并进行图像分析。
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    1.3.3 统计学分析 数据以±s表示,采用t检验。

    2 结果

    Ⅱ组再灌注后各时相点肺含水量、BALF白蛋白含量、左肺组织及BALF MPO活性均较Ⅰ组有非常显著的升高(P<0.01),Ⅲ组则显著(P<0.05)或非常显著(P<0.01)低于Ⅱ组,见表1。缺血后Ⅱ组及Ⅲ组PMN表达CD18差异不明显,再灌注1 h后Ⅱ组CD18表达率非常显著地高于Ⅰ组(P<0.01);Ⅲ组虽仍显著地高于Ⅰ组,但较Ⅱ组以有非常显著的下调(P<0.01),见表2。ICAM-1免疫组织化学显示Ⅰ组肺部组织仅见少数血管内皮棕褐色的阳性着色分布,且染色较浅淡;Ⅱ组再灌注2 h以后阳性着色明显增多,分布区域也更为广泛,各级血管的内皮细胞、肺泡上皮细胞及支气管粘膜层均可见较多的棕褐色分布,染色较深,再灌注4 h变化更为明显,图像分析证明再灌注2 h及4 h积分光密度非常显著升高(P<0.01);Ⅲ组再灌注2、4 h阳性着色较Ⅱ 组对应的时相点有所下降,图像分析积分光密度非常显著降低(P<0.01),见表2。
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    表1 左肺含水量、BALF白蛋白、左肺组织及BALF MPO活性的变化(n=6)

    Tab 1 Changes of water content, MPO of left lung and BALF albumin, BALF MPO of lung tissues(n=6)

    Left lung water content(ml/g)

    BALF albumin(mg/ml)

    Left lung MPO(U/g)

    BALF MPO(U/ml)

    GroupⅠ

    3.29±0.17
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    2.52±0.31

    6.14±1.14

    0.35±0.091

    1 h during reperfusion

    3.75±0.21* *

    3.57±0.56* *

    10.67±1.29* *

    1.01±0.13* *

    GroupⅡ 2 h during reperfusion

    4.08±0.29* *
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    3.96±0.62* *

    13.67±2.15* *

    1.57±0.44* *

    4 h during reperfusion

    4.13±0.29* *

    4.08±0.41* *

    13.69±1.89* *

    2.23±0.56* *

    1 h during reperfusion
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    3.38±0.16#

    2.82±0.45#

    6.57±0.83# #

    0.51±0.12# #

    GroupⅢ 2 h during reperfusion

    3.54±0.26#

    2.86±0.50#

    8.44±2.03# #

    0.54±0.10* # #
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    4 h during reperfusion

    3.61±0.27* #

    3.04±0.42#

    8.56±1.85

    0.62±0.09* * # #

    *:P<0.05,* *:P<0.01 vs groupⅠ;# :P<0.05,# #:P<0.01 vs group Ⅱ

    表2 PMN CD18荧光阳性标记率和左肺ICAM-1免疫组化积分光密度变化

    Tab 2 Changes of fluorescent positive rate of PMN CD18 and integral immunohistochemical optical density of ICAM-1
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    Fluorescent positive rate of PMN CD18

    Integral optical density of ICAM-1

    Group Ⅰ

    Group Ⅱ

    Group Ⅲ

    Group Ⅰ

    Group Ⅱ

    Group Ⅲ

    Ischemia 45 min

    16.13±3.93

    18.26±2.10
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    17.99±4.11

    0.27±0.05

    0.35±0.05

    0.28±0.08

    1 h during reperfusion

    17.02±3.23

    47.55±6.16* *

    31.11±6.50* * # #

    0.27±0.05

    1.27±0.4* *
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    0.92±0.33* *

    2 h during reperfusion

    17.06±2.37

    66.03±8.56* *

    48.52±5.22* * # #

    0.27±0.05

    8.43±1.11* *

    3.22±1.48* * # #

    4 h during reperfusion
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    19.32±3.57

    56.02±9.45* *

    40.26±5.84* * # #

    0.27±0.05

    11.93±2.42* *

    6.8 ±1.43* * # #

    * *:P<0.01 vs groupⅠ;# #:P<0.01 vs group Ⅱ

    3 讨论

    PMN是炎性反应的早期现象,也是机体防御反应极为重要的组成部分。PMN膜上的整合素CD11/CD18和内皮细胞上的ICAM-1是介导PMN与内皮细胞粘附的主要粘附分子。肺缺血再灌注后外周血PMN CD18和内皮细胞ICAM-1明显增高,造成PMN大量肺内聚积,造成血管内皮、组织损伤[4]
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    PTX是甲基黄嘌呤衍生物,是一种非选择性磷酸二脂酶抑制剂。作为血管扩张剂,曾广泛地应用于治疗周围性血管疾病。因发现其具有显著的抗炎作用,因而用于治疗急性肺损伤。最近也有了用于治疗肺缺血再灌注损伤的报道[2,5],但其作用机制尚未完全阐明。PMN在肺缺血再灌注损伤中起着关键性作用,CD11/CD18在PMN粘附及其功能发挥中起着至关重要的作用[6]。本实验结果表明,PTX可以有效地防治肺微血管通透性的增加,减轻肺水肿的形成。

    Ⅲ组各时相点肺组织匀浆和血浆中MDA含量均显著地低于Ⅱ 组,说明PTX减轻了肺组织乃至整个动物体内的脂质过氧化。肺缺血再灌注后Ⅱ 组肺组织及BALF内MPO活性显著升高,Ⅲ组MPO活性非常显著地降低,表明PTX明显减轻了肺组织内PMN聚集及渗出。

    本研究发现缺血再灌注后各时相点CD11/CD18的表达量均明显高于Ⅰ组,肺缺血再灌注后ICAM-1的表达增强。CD11/CD18的表达量升高与组织MPO升高一致,表明肺内PMN聚集可能与CD11/CD18表达增多有关。CD11/CD18的配体是免疫球蛋白超家族的ICAM-1、ICAM-2,PMN细胞膜上CD11/CD18与ICAM相互作用促使PMN牢固地粘附于内皮细胞表面,进而在IL-8的介导下游出,释放毒性物质,发挥其损伤作用[7]。但在正常情况下,ICAM-1呈低表达,在细胞因子如白细胞介素-1、TFN-γ、INF-α、PAF等作用下,其表达可快速、大量增加[8]。实验结果表明,Ⅲ 组肺缺血再灌注后PMN表面CD18及肺组织ICAM-1表达均较Ⅱ 组明显下调。PTX抑制粘附分子表达上调的机制尚不清楚,既可能由PTX直接引起[9]也是可能通过细胞因子作用如TNFα等完成的[10,11]。肺缺血再灌注后,IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、TNFα、IFNγ等细胞因子生成增多[8],PTX可以抑制这些细胞因子生成而抑制PMN表面的CD11/CD18[10]、内皮细胞表面ICAM-1[11]表达上调。
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    因此,作者推测PTX可能通过降低肺缺血再灌注引起的CD11/CD18及ICAM-1的上调,而减少PMN在肺内的聚集、活化,而减轻肺缺血再灌注损伤。

    作者简介:牛会军(1969-),男,天津市宁河县人,硕士,医师,主要从事肺缺血再灌注损伤方面的研究。电话:(023)68757081

    作者单位:向明章(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所胸心外科,重庆 400042)

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    收稿日期:2000-01-12;修回日期:2000-05-24, http://www.100md.com