二磷酸盐对人工关节松动影响的实验研究
作者：范卫民 马益民 王青
单位：(210029 南京医科大学第一附属医院骨科)
关键词：二磷酸盐；人工关节；假体失败；骨溶解
江苏医药000815 【摘要】 目的 探讨二磷酸盐对人工关节松动的影响。方法 随机选择准备行人工髋关节置换术患者17例。采集外周血，分离单核细胞，每例标本分成5份。A组：仅单核细胞，为对照组；B组：单核细胞+骨水泥微粒；C组：单核细胞+骨水泥微粒+阿可达(5 μg/ml)；D组：单核细胞+骨水泥微粒+阿可达(10 μg/ml)；E组：单核细胞+骨水泥微粒+阿可达(20 μg/ml)。培养48小时后，放免法测定细胞上清液中肿瘤坏死因子(TNF)含量。结果 单核细胞+骨水泥微粒组的TNF含量均明显高于对照组(P<0.01)；单核细胞+骨水泥微粒+阿可达组的TNF含量明显低于单核细胞+骨水泥微粒组(P<0.01)。说明骨水泥微粒可刺激单核细胞分泌TNF，而二磷酸盐能有效地抑制单核细胞分泌TNF。结论 二磷酸盐能防治人工关节置换术后由TNF等溶骨性因子引起的假体周围的骨溶解，因此二磷酸盐有望成为防治人工关节松动的有效药物。
, 百拇医药
A study of the effects of bisphosphonate on aseptic loosening of prothesis in vitro
FAN Weimin，MA Yimin，WANG Qing.
(Department of Orthopaedics, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029)
【Abstract】 Objective To explore the effects of bisphosphonate on aseptic loosening of prothesis.Methods From 17 patients，blood samples were taken，whose mononuclear cells were isolated and then divided into five groups.Group A：only mononuclear cells，which was control group；group B：mononuclear cells+PMMA particles；group C：mononuclear cells+PMMA particles+Pamidronate(5μg/ml)；group D：mononuclear cells+PMMA particles(10μg/ml)；group E：mononuclear cells+PMMA particles(20μg/ml).They were co-cultured for 48 hours，and then the TNF was determined.Results The levels of TNF were much higher in group B than in group A，C，D and E(P<0.01).But there were no significant difference in group C，D and E(P>0.05).It shows the PMMA particles could stimulate mononuclear cells to excrete TNF，which can be inhibited by bisphosphonates.Conclusion By inhibiting bone resorption associated with the particles and TNF，Pamidronte and other bisphosphonates may have clinical utility in the prevention and treatment of aseptic loosening of prothesis.
, 百拇医药
【Key words】Bisphosphonate Prosthesis Prothesis failure Osteolysis
人工关节无菌性松动是人工关节置换术远期失败的主要原因。人工关节无菌性松动的病因可分为机械性因素和生物性因素两类。在生物性因素方面，目前认为，人工关节长期磨损后产生大量磨损微粒，巨噬细胞吞噬微粒后被激活，并分泌大量TNF、白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)、前列腺素E2(PGE2)等溶骨性因子，后者刺激破骨细胞，产生骨溶解，最终导致人工关节无菌性松动。目前，对人工关节无菌性松动只能采用人工关节翻修术，但该手术创伤大、费用昂贵。作者通过单核细胞、骨水泥和二磷酸盐类药物-阿可达混合培养，间接探讨二磷酸盐防治人工关节无菌性松动的可能性。
材料和方法
一、样本采集：随机选择股骨颈骨折患者准备行人工髋关节置换术17例。其中男10例，女7例。平均年龄51(40～69)岁。每例患者采集外周血8 ml，肝素抗凝。
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二、主要试剂和器材：二磷酸盐类药物阿可达(帕米磷酸钠，瑞士诺华有限公司制造)。未聚合的骨水泥粉末(美国Zimmer公司制造，微粒直径为2～3 μm)，RPMI1640培养液(丹麦GIBCO)，聚蔗糖-泛影葡胺分层液(FICOLL，上海试剂厂)。小牛血清(特级，杭州四季青生物制品研究所)，六孔细胞培养板(丹麦GIBCO)。肿瘤坏死因子(TNF)放免药盒(北京东亚免疫技术研究所，最小检测浓度<0.3 ng)。CO2细胞培养箱(LB-7，东京池本理化工业株式会社制造)。
三、实验方法：无菌采集外周血以HANK′S液稀释一倍，FICOLL分离液梯度离心法分离出单核细胞。洗涤三次，加含10%小牛血清的RPMI 1640培养液制成细胞悬液，细胞记数，调整细胞至4×105 /ml，台盼蓝排除法检测细胞活力。向六孔培养板中滴加细胞悬液，每孔加3 ml，最后一孔空置。置37℃、5%CO2恒温恒湿培养箱培育4小时，使细胞贴壁，利用单核细胞的贴壁性，洗去非贴壁细胞，留下单核细胞。每板第一孔加入含10%小牛血清的PRMI 1640培养液3 ml，余四孔中加入含10 mg/ml骨水泥的RPMI 1640培养液3 ml，并于第三、第四和第五孔中分别加入15 μg、30 μg、60 μg阿可达，使其浓度分别为5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml。即第一孔为仅有单核细胞的对照组，第二孔为单核细胞+骨水泥组，第三孔为单核细胞+骨水泥+阿可达5 μg/ml组，第四孔为单核细胞+骨水泥+阿可达10 μg/ml组，第五孔为单核细胞+骨水泥+阿可达20 μg/ml组。混匀，同条件培养48小时，取上清液，离心后放免法测定上清中TNF的量。
, 百拇医药
四、数据处理：数据以均数±标准差(
±s)表示，采用方差分析q检验法检测不同处理组之间TNF含量的差异有无统计学意义。
结 果
五种不同处理组TNF的含量如图1所示。结果显示，对照组为0.737±0.337 ng；单核细胞+骨水泥组为1.200±0.661 ng；单核细胞+骨水泥+阿可达(5 μg/ml)为0.859±0.689 ng；单核细胞+骨水泥+阿可达(10 μg/ml)为0.815±0.427 ng；单核细胞+骨水泥+阿可达(20 μg/ml)组为0.658±0.371 ng(见图1)。
图1 五种处理组TNF含量(均数)
, 百拇医药
A：单核细胞
B：单核细胞+骨水泥
C：单核细胞+骨水泥+阿可达(5 μg/ml)
D：单核细胞+骨水泥+阿可达(10 μg/ml)
E：单核细胞+骨水泥+阿可达(20 μg/ml)
方差分析提示，五组细胞上清液中TNF含量有显著差异(P<0.01)。两两比较显示，单核细胞+骨水泥组的TNF含量明显高于对照组(P<0.01)。单核细胞+骨水泥+阿可达组的TNF含量均明显低于单核细胞+骨水泥组(P<0.01)。而三种不同浓度阿可达组中的TNF含量无明显差异(P>0.05)。
讨 论
人工关节置换历经30年的发展和改进，长期保留了病变关节的功能，明显提高了患者的工作能力和生活质量。随着人工关节使用年限的延长，人工关节无菌性松动这一问题逐渐显得重要起来。虽然随着第二、三代骨水泥技术和生物式固定技术的发展，人工关节无菌性松动的发生率有所下降，但这一问题仍未得到彻底解决，而且已成为人工关节置换术远期失败的最主要原因，并严重妨碍了人工关节的发展和推广运用。
, 百拇医药
目前认为，人工关节磨损后产生大量磨损微粒，巨噬细胞吞噬微粒后被激活，并分泌大量TNF、IL-1、IL-6、PGE2等溶骨性因子，后者刺激破骨细胞，产生骨溶解，最终导致人工关节无菌性松动[1，2]。目前，对人工关节无菌性松动只能采用人工关节翻修术，但该手术创伤大、费用昂贵。
二磷酸盐是一种人工合成的化合物，它能稳定地结合于骨小梁表面，使破骨细胞的骨溶解作用难以实现，并可抑制破骨细胞的移动和成熟过程[3，4]。因此，人们利用二磷酸盐治疗骨质疏松症和肿瘤性骨溶解。Coleman等[5]应用二磷酸盐类药物-阿可达治疗骨转移性肿瘤86例，平均随访6个月，X线片上25%患者的骨转移性病灶明显缩小。人工关节无菌性松动的发病机理与肿瘤性骨溶解和骨质疏松有相似之处。既然二磷酸盐可治疗肿瘤性骨溶解和骨质疏松症，那么二磷酸盐能否防治人工关节无菌性松动呢?
1995年Pennanen等[6]将二磷酸盐加入巨噬细胞raw264培养液中，经过培养后，发现二磷酸盐能明显抑制巨噬细胞分泌TNF、IL-1和 IL-6等溶骨性因子。单核细胞与巨噬细胞为同一来源，在功能上有相同之处。很多学者以单核细胞代替巨噬细胞进行人工关节无菌性松动的病因研究。Herman发现，骨水泥能刺激单核细胞分泌大量的溶骨性因子，并能使小鼠体内骨吸收增加[7]。本研究通过人体外周血单核细胞与骨水泥混合培养发现，骨水泥微粒可刺激单核细胞分泌大量的TNF，再次说明微粒在人工关节无菌性松动中起着重要作用。但当单核细胞、骨水泥微粒及阿可达混合培养48小时，结果发现上清液中的TNF含量明显下降。说明，二磷酸盐类药物—阿可达能显著抑制单核细胞分泌TNF等溶骨性因子，抑制这些溶骨性因子引起的破骨细胞介导的骨溶解，从而能够阻断人工关节无菌性松动的发展过程。
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同时本实验以5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml三种不同浓度的阿可达观察其对单核细胞分泌TNF的抑制作用。结果发现，虽然三组之间的差异无统计学意义，但可以看出，随着阿可达浓度的增高，单核细胞分泌TNF的量逐渐减少。进一步说明二磷酸盐类药物—阿可达可明显抑制单核细胞分泌TNF等溶骨性因子，从而防治人工关节无菌性松动。
我们认为，二磷酸盐防治人工关节无菌性松动的机理主要是，①可稳定地结合于骨小梁表面，使破骨细胞的骨溶解作用难以发挥。②可抑制破骨细胞的移动和成熟。③能有效地抑制磨损微粒引起的巨噬细胞分泌TNF等溶骨性因子，从而阻止由溶骨性因子介导的破骨细胞活性增强，从而间接抑制骨溶解。
当然，本实验仅是体外的初步研究，还有待进一步的动物实验和临床研究证实。但我们相信，二磷酸盐类药物有望成为临床上防治人工关节无菌性松动的有效药物。
参 考 文 献
, 百拇医药
1，范卫民，王青，陶松年，等.人工关节松动病因的研究.中华骨科杂志，1998，18：518-521.
2，范卫民，陶松年，王道新，等.人工关节无菌性松动的研究.江苏医药，1998，1：9-10.
3，Fitton A，Mc Tavish D.Pamidronate：A review of its pharmacological properties and therapeutic efficacy in resorptive bone disease.Drugs，1991，41：289-318.
4，Reitsma PH，Teitelbaum SL，Bihvoet OLM，et al.Differential action of the bisphosphonates (3-amino-1-hydroxy-proptlidene)-1，1-bisphonate (APD) and disodium dichlolmethylidene bisphosphonate(Cl2MDP) on rat macrophage-mediated bone resorption in vitro.J Bone Invest，1982，70：927-933.
, 百拇医药
5，Coleman RE，Woll PJ，Miles M，et al.Treatment of bone metastases from breast cancer with 3-amino-1-hydroxypropylidene-1，1-bispho-sphonate.Br J Cancer，1988，58：621-625.
6，Pennanen N，Lapinjoki S，Urtti A，et al.Effect of liposomal and biphosphonates on the IL-1 beta，IL-6 and TNF alpha secretion from RAW 264 cells in vitro.Pharm Res，1995 Jun，12：916-920.
7，Herman JH.Polymethylmethacrylate induced release of bone resorbing facters.J Bone Joint Surg(Am)，1989，71：1530-1535.
收稿：1999-06-08 修回：1999-08-04, http://www.100md.com
单位：(210029 南京医科大学第一附属医院骨科)
关键词：二磷酸盐；人工关节；假体失败；骨溶解
江苏医药000815 【摘要】 目的 探讨二磷酸盐对人工关节松动的影响。方法 随机选择准备行人工髋关节置换术患者17例。采集外周血，分离单核细胞，每例标本分成5份。A组：仅单核细胞，为对照组；B组：单核细胞+骨水泥微粒；C组：单核细胞+骨水泥微粒+阿可达(5 μg/ml)；D组：单核细胞+骨水泥微粒+阿可达(10 μg/ml)；E组：单核细胞+骨水泥微粒+阿可达(20 μg/ml)。培养48小时后，放免法测定细胞上清液中肿瘤坏死因子(TNF)含量。结果 单核细胞+骨水泥微粒组的TNF含量均明显高于对照组(P<0.01)；单核细胞+骨水泥微粒+阿可达组的TNF含量明显低于单核细胞+骨水泥微粒组(P<0.01)。说明骨水泥微粒可刺激单核细胞分泌TNF，而二磷酸盐能有效地抑制单核细胞分泌TNF。结论 二磷酸盐能防治人工关节置换术后由TNF等溶骨性因子引起的假体周围的骨溶解，因此二磷酸盐有望成为防治人工关节松动的有效药物。
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A study of the effects of bisphosphonate on aseptic loosening of prothesis in vitro
FAN Weimin，MA Yimin，WANG Qing.
(Department of Orthopaedics, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029)
【Abstract】 Objective To explore the effects of bisphosphonate on aseptic loosening of prothesis.Methods From 17 patients，blood samples were taken，whose mononuclear cells were isolated and then divided into five groups.Group A：only mononuclear cells，which was control group；group B：mononuclear cells+PMMA particles；group C：mononuclear cells+PMMA particles+Pamidronate(5μg/ml)；group D：mononuclear cells+PMMA particles(10μg/ml)；group E：mononuclear cells+PMMA particles(20μg/ml).They were co-cultured for 48 hours，and then the TNF was determined.Results The levels of TNF were much higher in group B than in group A，C，D and E(P<0.01).But there were no significant difference in group C，D and E(P>0.05).It shows the PMMA particles could stimulate mononuclear cells to excrete TNF，which can be inhibited by bisphosphonates.Conclusion By inhibiting bone resorption associated with the particles and TNF，Pamidronte and other bisphosphonates may have clinical utility in the prevention and treatment of aseptic loosening of prothesis.
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【Key words】Bisphosphonate Prosthesis Prothesis failure Osteolysis
人工关节无菌性松动是人工关节置换术远期失败的主要原因。人工关节无菌性松动的病因可分为机械性因素和生物性因素两类。在生物性因素方面，目前认为，人工关节长期磨损后产生大量磨损微粒，巨噬细胞吞噬微粒后被激活，并分泌大量TNF、白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)、前列腺素E2(PGE2)等溶骨性因子，后者刺激破骨细胞，产生骨溶解，最终导致人工关节无菌性松动。目前，对人工关节无菌性松动只能采用人工关节翻修术，但该手术创伤大、费用昂贵。作者通过单核细胞、骨水泥和二磷酸盐类药物-阿可达混合培养，间接探讨二磷酸盐防治人工关节无菌性松动的可能性。
材料和方法
一、样本采集：随机选择股骨颈骨折患者准备行人工髋关节置换术17例。其中男10例，女7例。平均年龄51(40～69)岁。每例患者采集外周血8 ml，肝素抗凝。
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二、主要试剂和器材：二磷酸盐类药物阿可达(帕米磷酸钠，瑞士诺华有限公司制造)。未聚合的骨水泥粉末(美国Zimmer公司制造，微粒直径为2～3 μm)，RPMI1640培养液(丹麦GIBCO)，聚蔗糖-泛影葡胺分层液(FICOLL，上海试剂厂)。小牛血清(特级，杭州四季青生物制品研究所)，六孔细胞培养板(丹麦GIBCO)。肿瘤坏死因子(TNF)放免药盒(北京东亚免疫技术研究所，最小检测浓度<0.3 ng)。CO2细胞培养箱(LB-7，东京池本理化工业株式会社制造)。
三、实验方法：无菌采集外周血以HANK′S液稀释一倍，FICOLL分离液梯度离心法分离出单核细胞。洗涤三次，加含10%小牛血清的RPMI 1640培养液制成细胞悬液，细胞记数，调整细胞至4×105 /ml，台盼蓝排除法检测细胞活力。向六孔培养板中滴加细胞悬液，每孔加3 ml，最后一孔空置。置37℃、5%CO2恒温恒湿培养箱培育4小时，使细胞贴壁，利用单核细胞的贴壁性，洗去非贴壁细胞，留下单核细胞。每板第一孔加入含10%小牛血清的PRMI 1640培养液3 ml，余四孔中加入含10 mg/ml骨水泥的RPMI 1640培养液3 ml，并于第三、第四和第五孔中分别加入15 μg、30 μg、60 μg阿可达，使其浓度分别为5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml。即第一孔为仅有单核细胞的对照组，第二孔为单核细胞+骨水泥组，第三孔为单核细胞+骨水泥+阿可达5 μg/ml组，第四孔为单核细胞+骨水泥+阿可达10 μg/ml组，第五孔为单核细胞+骨水泥+阿可达20 μg/ml组。混匀，同条件培养48小时，取上清液，离心后放免法测定上清中TNF的量。
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四、数据处理：数据以均数±标准差(
±s)表示，采用方差分析q检验法检测不同处理组之间TNF含量的差异有无统计学意义。结 果
五种不同处理组TNF的含量如图1所示。结果显示，对照组为0.737±0.337 ng；单核细胞+骨水泥组为1.200±0.661 ng；单核细胞+骨水泥+阿可达(5 μg/ml)为0.859±0.689 ng；单核细胞+骨水泥+阿可达(10 μg/ml)为0.815±0.427 ng；单核细胞+骨水泥+阿可达(20 μg/ml)组为0.658±0.371 ng(见图1)。
图1 五种处理组TNF含量(均数)
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A：单核细胞
B：单核细胞+骨水泥
C：单核细胞+骨水泥+阿可达(5 μg/ml)
D：单核细胞+骨水泥+阿可达(10 μg/ml)
E：单核细胞+骨水泥+阿可达(20 μg/ml)
方差分析提示，五组细胞上清液中TNF含量有显著差异(P<0.01)。两两比较显示，单核细胞+骨水泥组的TNF含量明显高于对照组(P<0.01)。单核细胞+骨水泥+阿可达组的TNF含量均明显低于单核细胞+骨水泥组(P<0.01)。而三种不同浓度阿可达组中的TNF含量无明显差异(P>0.05)。
讨 论
人工关节置换历经30年的发展和改进，长期保留了病变关节的功能，明显提高了患者的工作能力和生活质量。随着人工关节使用年限的延长，人工关节无菌性松动这一问题逐渐显得重要起来。虽然随着第二、三代骨水泥技术和生物式固定技术的发展，人工关节无菌性松动的发生率有所下降，但这一问题仍未得到彻底解决，而且已成为人工关节置换术远期失败的最主要原因，并严重妨碍了人工关节的发展和推广运用。
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目前认为，人工关节磨损后产生大量磨损微粒，巨噬细胞吞噬微粒后被激活，并分泌大量TNF、IL-1、IL-6、PGE2等溶骨性因子，后者刺激破骨细胞，产生骨溶解，最终导致人工关节无菌性松动[1，2]。目前，对人工关节无菌性松动只能采用人工关节翻修术，但该手术创伤大、费用昂贵。
二磷酸盐是一种人工合成的化合物，它能稳定地结合于骨小梁表面，使破骨细胞的骨溶解作用难以实现，并可抑制破骨细胞的移动和成熟过程[3，4]。因此，人们利用二磷酸盐治疗骨质疏松症和肿瘤性骨溶解。Coleman等[5]应用二磷酸盐类药物-阿可达治疗骨转移性肿瘤86例，平均随访6个月，X线片上25%患者的骨转移性病灶明显缩小。人工关节无菌性松动的发病机理与肿瘤性骨溶解和骨质疏松有相似之处。既然二磷酸盐可治疗肿瘤性骨溶解和骨质疏松症，那么二磷酸盐能否防治人工关节无菌性松动呢?
1995年Pennanen等[6]将二磷酸盐加入巨噬细胞raw264培养液中，经过培养后，发现二磷酸盐能明显抑制巨噬细胞分泌TNF、IL-1和 IL-6等溶骨性因子。单核细胞与巨噬细胞为同一来源，在功能上有相同之处。很多学者以单核细胞代替巨噬细胞进行人工关节无菌性松动的病因研究。Herman发现，骨水泥能刺激单核细胞分泌大量的溶骨性因子，并能使小鼠体内骨吸收增加[7]。本研究通过人体外周血单核细胞与骨水泥混合培养发现，骨水泥微粒可刺激单核细胞分泌大量的TNF，再次说明微粒在人工关节无菌性松动中起着重要作用。但当单核细胞、骨水泥微粒及阿可达混合培养48小时，结果发现上清液中的TNF含量明显下降。说明，二磷酸盐类药物—阿可达能显著抑制单核细胞分泌TNF等溶骨性因子，抑制这些溶骨性因子引起的破骨细胞介导的骨溶解，从而能够阻断人工关节无菌性松动的发展过程。
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同时本实验以5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml三种不同浓度的阿可达观察其对单核细胞分泌TNF的抑制作用。结果发现，虽然三组之间的差异无统计学意义，但可以看出，随着阿可达浓度的增高，单核细胞分泌TNF的量逐渐减少。进一步说明二磷酸盐类药物—阿可达可明显抑制单核细胞分泌TNF等溶骨性因子，从而防治人工关节无菌性松动。
我们认为，二磷酸盐防治人工关节无菌性松动的机理主要是，①可稳定地结合于骨小梁表面，使破骨细胞的骨溶解作用难以发挥。②可抑制破骨细胞的移动和成熟。③能有效地抑制磨损微粒引起的巨噬细胞分泌TNF等溶骨性因子，从而阻止由溶骨性因子介导的破骨细胞活性增强，从而间接抑制骨溶解。
当然，本实验仅是体外的初步研究，还有待进一步的动物实验和临床研究证实。但我们相信，二磷酸盐类药物有望成为临床上防治人工关节无菌性松动的有效药物。
参 考 文 献
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1，范卫民，王青，陶松年，等.人工关节松动病因的研究.中华骨科杂志，1998，18：518-521.
2，范卫民，陶松年，王道新，等.人工关节无菌性松动的研究.江苏医药，1998，1：9-10.
3，Fitton A，Mc Tavish D.Pamidronate：A review of its pharmacological properties and therapeutic efficacy in resorptive bone disease.Drugs，1991，41：289-318.
4，Reitsma PH，Teitelbaum SL，Bihvoet OLM，et al.Differential action of the bisphosphonates (3-amino-1-hydroxy-proptlidene)-1，1-bisphonate (APD) and disodium dichlolmethylidene bisphosphonate(Cl2MDP) on rat macrophage-mediated bone resorption in vitro.J Bone Invest，1982，70：927-933.
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5，Coleman RE，Woll PJ，Miles M，et al.Treatment of bone metastases from breast cancer with 3-amino-1-hydroxypropylidene-1，1-bispho-sphonate.Br J Cancer，1988，58：621-625.
6，Pennanen N，Lapinjoki S，Urtti A，et al.Effect of liposomal and biphosphonates on the IL-1 beta，IL-6 and TNF alpha secretion from RAW 264 cells in vitro.Pharm Res，1995 Jun，12：916-920.
7，Herman JH.Polymethylmethacrylate induced release of bone resorbing facters.J Bone Joint Surg(Am)，1989，71：1530-1535.
收稿：1999-06-08 修回：1999-08-04, http://www.100md.com