猪外周血淋巴细胞与心肌细胞Βar的相关性研究
作者：黄子通 王彤 邱嘉民 马中富
单位：黄子通 王彤 邱嘉民(中山医科大学孙逸仙纪念医院急诊科，广州 510120)；马中富(中山医科大学第一附属医院急诊科)
关键词：β肾上腺素能受体；淋巴细胞；心肌细胞
中国急救医学000802 [摘 要] 目的 对猪外周血淋巴细胞膜上βAR与心肌细胞膜上βAR的定量检测，研究两者之间的相关性。方法 对17例7月龄的猪，取外周血及心肌组织，用3H-DNA放射配基法测定其βAR密度。结果 猪外周血淋巴细胞膜上βAR与 心肌细胞膜上βAR呈显著相关(r=0.0956，P<0.001)。结论 对猪外周血淋巴细胞膜上βAR的检测，可间接反映其心肌细胞膜上βAR的变化。因而可应用于实验性急救药物研究。
[中图分类号] R 392.31 [文献标识码] A [文章编号] 1002-1949(2000)08-0448-03
, http://www.100md.com
βAR relating study of porcine circulating lymphocytes and myocardial tissue
HUANG Zi-tong,WANG Tong,QIU Jia-min,et al.Department of Emergency Medicine,Sun (Yat-Sen Memorial Hospital,Sun Yat-Sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510120,China)
[Abstract] Objective To study βAR relation between porcine myocardial tissue and circulating lymphocyte beta-adrenoceptor density.Method βAR density were measured in the myocardial tissue and circulating lymphocyte of 17 pigs.βAR density were determined by 3H-dihydroalpneold as ligand.Result βAR density were important relation between myocardial tissue and circulating lymphocyte(r=0.9056，P<0.001).Conclusion βAR density of circulating lymphocyte can reflect the alterations of myocardial tissue.Therefore,makes it possible to study drug-induced βAR changes.
, 百拇医药
[Key words] Beta-adrenoceptor; Lymphocyte; Myocardial tissue
β肾上腺素能受体(β-adrenergic receptor,βAR)能被体内各种各样的激素、药物及病理生理状况所动态调节。最近的研究表明，心肌细胞βAR与心功能密切相关。在一般情况下，不可能直接获取心肌组织去检测其βAR密度。我科对17例猪取外周血之淋巴细胞并取其心肌组织进行βAR检测，以研究两者的相关性，为进一步研究心肺复苏中肾上腺素用量与βAR的相关性提供理论基础和实验方法。
1 材料与方法
1.1 动物准备 取一批同龄(约7月大，75 kg重)的生猪17头，在屠宰时取猪外周血约5 ml入抗凝管中，冰壶内保存。同时取猪心脏左心室处心肌组织约500 mg，放入液氮罐内冷冻保存。留取标本后于4小时内送检。
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1.2 试剂准备 RPMI-1640培养液(美国，GIBCO公司)；淋巴细胞提取液(上海试剂二厂)；3H-DHA标记物(北京原子能研究所，SA=45 ci/mmol，纯度>98%)；dl-心得安(广东汕头制药厂)；闪烁液(0.7%ppo，0.25%popop)。
1.3 外周血淋巴细胞的处理 ①预先每份血标本准备三支5 ml普通玻璃试管(要编好号)，每支管内加淋巴细胞提取液2.5 ml；然后将每份5 ml的血标本用PBS(磷酸缓冲液)稀释成7.5 ml，将其分成三份，每份2.5 ml用吸管沿管壁缓慢加入上述备用试管内，使血液浮在淋巴细胞提取液面上。不能摇匀。②将经过上述处理后的试管放在低温高速离心机内750×g离心30分钟。③将每份血标本所对应的三管内淋巴细胞(中间层)，用吸管吸成一管。④每份样本用PBS悬浮，750×g离心10分钟，弃上清，重复三次。⑤洗涤完毕后，用RPMI-1640液稀释成(1～2)×106/ml，制成细胞悬液。可4℃下保存备用。⑥按下表加样：⑦混匀后冰育10分钟。⑧每管加5 ml PBS液，将9999型玻璃纤维滤墨置于多头细胞收集器内，分离结合与游离部分。⑨滤膜以80℃红外线灯烘干15分钟，置于闪烁杯中(含5 ml闪烁液)。⑩用FJ-2107P液闪仪测量，控制测量误差<5%。
计算βAR结合量SB=TB-NSB。
, 百拇医药
细胞悬液
3H-DHA
dl-pr
RPMI-1640
TB(复管)
100 μl
100 μl
-
50 μl
NSB(复管)
100 μl
100 μl
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50 μl
-
1.4 心肌组织的处理 ①取出心肌组织4℃下解冻，称重(约500 mg)，剪碎，加PBS(W/V 1∶8)。②用多头细胞分散器匀浆，4 000 rpm离心20秒钟，间隔10秒钟，重复三次。③1 000×g 4℃离心15分钟，弃上清，27 000×g 4℃离心40分钟，弃上清。④将沉淀以PBS悬浮成胞膜液，Lowry’s法测定蛋白，调整蛋白浓度1～2 mg/ml，4℃保存备用。⑤重复上面⑥～步骤。
1.5 统计学处理 ①描记外周血淋巴细胞位点/细胞与心肌组织fmol/mg.pro之间的散点图。②计量资料以均数±标准差表示。③计算外周血淋巴细胞位点/细胞与心肌组织fmol/mg.pro之间的相关系数，并进行P检验。P<0.05有显著性差异。④计算外周血淋巴细胞位点/细胞与心肌组织fmol/mg.pro之间的直线回归方程。
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2 结果
2.1 外周血淋巴细胞位点/细胞与心肌组织fmol/mg.pro的实验数据(见附表)。
附表 淋巴细胞βAR及心肌组织βAR数值
1
2
3
4
5
6
7
8
9
, 百拇医药
10
11
12
13
14
15
16
17
淋巴细胞
(fmol/
106cell)
11.23
7.57
, http://www.100md.com
12.01
11.71
12.34
18.86
5.47
8.09
6.32
10.41
16.18
15.00
12639
13.27
9.56
, 百拇医药
11.78
9.85
淋巴细胞
(site/
cell)
6764
4559
7234
7053
7433
11360
3295
4873
, http://www.100md.com
3807
6270
9745
9035
7463
7993
5758
7095
5933
心肌组织
(fmol/
mg.pro)
15.72
, 百拇医药
10.69
13.00
12.74
15.27
30.21
8.27
13.80
10.02
14.89
26.31
24.69
21.03
23.40
, 百拇医药
16.31
15.62
17.35
2.2 外周血淋巴细胞位点/细胞数量为
X+Sx=6804.1176±2079.1012
心肌组织(fmol/mg.pro)数量为
Y+Sy=17.0188±6.1147
2.3 外周血淋巴细胞βAR与心肌组织βAR的相关系数为r=0.9056(P<0.001)
显示外周血淋巴细胞与心肌细胞βAR呈显著相关的关系。
, 百拇医药
2.4 淋巴细胞与心肌组织的直线回归方程为
Y=0.00266X-1.103
说明外周血淋巴细胞与心肌细胞βAR之间呈线性相关。
2.5 淋巴细胞与心肌组织的散点图见附图。
附图 淋巴细胞与心肌组织的散点图
3 讨论
最近的研究表明，心肌细胞βAR与心功能密切相关。Gibert[1]等认为βAR变化可反映心肌收缩性及心肌功能异常程度。在轻度心衰时βAR密度开始下降，严重心衰时其数目可降至不能介导β肾上腺素能反应的低水平。Ditchey[2]的研究提示非选择性βAR阻滞剂能改善心肌氧供和心肌氧耗之间的平衡。
, 百拇医药
由于放射性同位素的发展，使我们可以直接鉴定细胞膜上的βAR，无论是外周血淋巴细胞或是心肌组织。但作为人类，尤其是心脏骤停的病人，不可能即时获得心脏组织来检测其βAR，因而寻找其它易于获取标本来检测其βAR，用于间接反映心肌细胞膜上βAR的功能变化，是我们临床上需要解决的问题。
有学者认为[3，4]，外周血淋巴细胞膜上主要存在β2AR，而心脏组织β1AR占多数，其外周血淋巴细胞膜β2AR仅仅是心肌细胞膜β2AR的映射，而不是β1AR的映射，因而外周血βAR变化不能反映心肌组织的变化。但有很多学者则发现[5，6]，淋巴细胞既有β2AR，也有β1AR，心肌细胞β1AR占多数，但也有较多的β2AR，且β1AR与β2AR有同源性。实验结果也证实[7，8]无论是动物或者人类，其外周血淋巴细胞与心肌细胞βAR密度间有良好的正相关性。淋巴细胞膜上虽然存在的是β2AR，但其密度同样受循环儿茶酚胺水平的调节，其对异丙肾上腺素的反应性与心肌细胞的反应性呈正相关[8，9]，因而外周血淋巴细胞密度可反映心肌细胞密度的变化。只要我们在随后的研究中，不涉及选择性β1AR激动剂或拮抗剂时，我们可以得到比较肯定的结论：外周血淋巴细胞与心肌细胞膜βAR具有显著的线性关系，并可用外周血淋巴细胞来监测心肌细胞的功能。国内在这一方面的研究还少有人涉及，为了证实国外的研究观点并开展关于βAR方面的研究，我们对猪外周血淋巴细胞及心肌组织的βAR进行密度的检测，结果发现得出了非常满意的结论。①从外周血淋巴细胞与心肌组织的数据所描绘的散点图可看出，散点基本上是沿一定的斜率呈直线状分布。就连个别极端值亦分布在该直线附近。这反映了外周血淋巴细胞βAR密度与心肌组织βAR密度大致成一直线关系。②从上述的实验数据可计算出外周血淋巴细胞βAR与心肌组织βAR密度间的相关系数r=0.9056(P<0.001)。表明外周血淋巴细胞βAR与心肌组织间βAR具有显著相关性。③外周血淋巴细胞与心肌细胞的βAR的相关关系可用一直线方程来描述，Y=0.00266X-1.103，从上述结论中我们可以得出与国外研究者相一致的结果。
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因而对外周血淋巴细胞βAR的检测可以反映心肌组织βAR密度的变化。故我们可用外周血淋巴细胞βAR的检测来监测药物所诱导的心肌细胞βAR的变化。在心跳骤停过程中探讨心肌细胞βAR的数目及功能的变化，以及探讨肾上腺素剂量的选择，从而对我们改进药物治疗的有效性大有帮助，特别是对肾上腺素在心肺复苏的作用的进一步研究中，打下了良好的基础。
[参考文献]
[1]Gibert EM,Olsen SL,Renland OG,et al.Beta-adrenergic receptor regulation and left ventricular function in idiopathic dilated cardiomyopathy[J].Am J Cardiol,1993,71:23c.
[2]Ditchey RV,Rubio-Perez A,Slinker BK.Beta-adrenergic blockade reduces myocardial injury during experimental CPR[J].J Am Coll Cardiol,1994,24:804.
, http://www.100md.com
[3]Michell MC,Beckeringh JJ,Ikezono K,et al.Lymphocyte β2-adrenoceptors mirror precisely β2-adrenoceptor,but poorly β1-adrenoceptors changes in the Human heart[J].J Hypertens,1986,4(Suppl 6)：215.
[4]Brodde OE,Michel MC,Gordon EP et al.Beta-adrenoceptor regulation in the human heart:can it be monitored in circulation lymphocytes[J]?Eur Heart J,1989,10(Suppl):2.
[5]姜红，戴国柱，冯宗忱.心力衰竭患者心脏β受体系统调控在左心室重塑中的作用[J].中华医学杂志，1997，77(4)：249.
, 百拇医药
[6]Sbirrazzuoli V,Lapalus P.Human lymphocyte and myocardial beta-adrenoceptors:up and down regulation[J].Biomed Pharmacother,1989,43(5):369.
[7]Birstow MR.The adrenergic receptor configuration,regulation,mechanism of action[J].Postgrad Med,1988,2:19.
[8]Brodde OE,Kretsch R,Ikezono K,et al.Human beta-adrenoceptors relation between myocardial and lymphoctye beta-adrenoceptor density[J].Science,1986,231:1584.
[9]Maisel AS,Zieglar MG,Cartor S,et al.In vivo regulation of beta-adrenergic receptors on mononuclear leukocytes and heart[J].J Clin Invest,1988,82:2038.
[收稿：1999-10-18，修回：2000-04-23], http://www.100md.com
单位：黄子通 王彤 邱嘉民(中山医科大学孙逸仙纪念医院急诊科，广州 510120)；马中富(中山医科大学第一附属医院急诊科)
关键词：β肾上腺素能受体；淋巴细胞；心肌细胞
中国急救医学000802 [摘 要] 目的 对猪外周血淋巴细胞膜上βAR与心肌细胞膜上βAR的定量检测，研究两者之间的相关性。方法 对17例7月龄的猪，取外周血及心肌组织，用3H-DNA放射配基法测定其βAR密度。结果 猪外周血淋巴细胞膜上βAR与 心肌细胞膜上βAR呈显著相关(r=0.0956，P<0.001)。结论 对猪外周血淋巴细胞膜上βAR的检测，可间接反映其心肌细胞膜上βAR的变化。因而可应用于实验性急救药物研究。
[中图分类号] R 392.31 [文献标识码] A [文章编号] 1002-1949(2000)08-0448-03
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βAR relating study of porcine circulating lymphocytes and myocardial tissue
HUANG Zi-tong,WANG Tong,QIU Jia-min,et al.Department of Emergency Medicine,Sun (Yat-Sen Memorial Hospital,Sun Yat-Sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510120,China)
[Abstract] Objective To study βAR relation between porcine myocardial tissue and circulating lymphocyte beta-adrenoceptor density.Method βAR density were measured in the myocardial tissue and circulating lymphocyte of 17 pigs.βAR density were determined by 3H-dihydroalpneold as ligand.Result βAR density were important relation between myocardial tissue and circulating lymphocyte(r=0.9056，P<0.001).Conclusion βAR density of circulating lymphocyte can reflect the alterations of myocardial tissue.Therefore,makes it possible to study drug-induced βAR changes.
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[Key words] Beta-adrenoceptor; Lymphocyte; Myocardial tissue
β肾上腺素能受体(β-adrenergic receptor,βAR)能被体内各种各样的激素、药物及病理生理状况所动态调节。最近的研究表明，心肌细胞βAR与心功能密切相关。在一般情况下，不可能直接获取心肌组织去检测其βAR密度。我科对17例猪取外周血之淋巴细胞并取其心肌组织进行βAR检测，以研究两者的相关性，为进一步研究心肺复苏中肾上腺素用量与βAR的相关性提供理论基础和实验方法。
1 材料与方法
1.1 动物准备 取一批同龄(约7月大，75 kg重)的生猪17头，在屠宰时取猪外周血约5 ml入抗凝管中，冰壶内保存。同时取猪心脏左心室处心肌组织约500 mg，放入液氮罐内冷冻保存。留取标本后于4小时内送检。
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1.2 试剂准备 RPMI-1640培养液(美国，GIBCO公司)；淋巴细胞提取液(上海试剂二厂)；3H-DHA标记物(北京原子能研究所，SA=45 ci/mmol，纯度>98%)；dl-心得安(广东汕头制药厂)；闪烁液(0.7%ppo，0.25%popop)。
1.3 外周血淋巴细胞的处理 ①预先每份血标本准备三支5 ml普通玻璃试管(要编好号)，每支管内加淋巴细胞提取液2.5 ml；然后将每份5 ml的血标本用PBS(磷酸缓冲液)稀释成7.5 ml，将其分成三份，每份2.5 ml用吸管沿管壁缓慢加入上述备用试管内，使血液浮在淋巴细胞提取液面上。不能摇匀。②将经过上述处理后的试管放在低温高速离心机内750×g离心30分钟。③将每份血标本所对应的三管内淋巴细胞(中间层)，用吸管吸成一管。④每份样本用PBS悬浮，750×g离心10分钟，弃上清，重复三次。⑤洗涤完毕后，用RPMI-1640液稀释成(1～2)×106/ml，制成细胞悬液。可4℃下保存备用。⑥按下表加样：⑦混匀后冰育10分钟。⑧每管加5 ml PBS液，将9999型玻璃纤维滤墨置于多头细胞收集器内，分离结合与游离部分。⑨滤膜以80℃红外线灯烘干15分钟，置于闪烁杯中(含5 ml闪烁液)。⑩用FJ-2107P液闪仪测量，控制测量误差<5%。
计算βAR结合量SB=TB-NSB。, 百拇医药
细胞悬液
3H-DHA
dl-pr
RPMI-1640
TB(复管)
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NSB(复管)
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100 μl
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1.4 心肌组织的处理 ①取出心肌组织4℃下解冻，称重(约500 mg)，剪碎，加PBS(W/V 1∶8)。②用多头细胞分散器匀浆，4 000 rpm离心20秒钟，间隔10秒钟，重复三次。③1 000×g 4℃离心15分钟，弃上清，27 000×g 4℃离心40分钟，弃上清。④将沉淀以PBS悬浮成胞膜液，Lowry’s法测定蛋白，调整蛋白浓度1～2 mg/ml，4℃保存备用。⑤重复上面⑥～
步骤。1.5 统计学处理 ①描记外周血淋巴细胞位点/细胞与心肌组织fmol/mg.pro之间的散点图。②计量资料以均数±标准差表示。③计算外周血淋巴细胞位点/细胞与心肌组织fmol/mg.pro之间的相关系数，并进行P检验。P<0.05有显著性差异。④计算外周血淋巴细胞位点/细胞与心肌组织fmol/mg.pro之间的直线回归方程。
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2 结果
2.1 外周血淋巴细胞位点/细胞与心肌组织fmol/mg.pro的实验数据(见附表)。
附表 淋巴细胞βAR及心肌组织βAR数值
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淋巴细胞
(fmol/
106cell)
11.23
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12.01
11.71
12.34
18.86
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6.32
10.41
16.18
15.00
12639
13.27
9.56
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11.78
9.85
淋巴细胞
(site/
cell)
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4559
7234
7053
7433
11360
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心肌组织
(fmol/
mg.pro)
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26.31
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21.03
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2.2 外周血淋巴细胞位点/细胞数量为
X+Sx=6804.1176±2079.1012
心肌组织(fmol/mg.pro)数量为
Y+Sy=17.0188±6.1147
2.3 外周血淋巴细胞βAR与心肌组织βAR的相关系数为r=0.9056(P<0.001)
显示外周血淋巴细胞与心肌细胞βAR呈显著相关的关系。
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2.4 淋巴细胞与心肌组织的直线回归方程为
Y=0.00266X-1.103
说明外周血淋巴细胞与心肌细胞βAR之间呈线性相关。
2.5 淋巴细胞与心肌组织的散点图见附图。
附图 淋巴细胞与心肌组织的散点图
3 讨论
最近的研究表明，心肌细胞βAR与心功能密切相关。Gibert[1]等认为βAR变化可反映心肌收缩性及心肌功能异常程度。在轻度心衰时βAR密度开始下降，严重心衰时其数目可降至不能介导β肾上腺素能反应的低水平。Ditchey[2]的研究提示非选择性βAR阻滞剂能改善心肌氧供和心肌氧耗之间的平衡。
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由于放射性同位素的发展，使我们可以直接鉴定细胞膜上的βAR，无论是外周血淋巴细胞或是心肌组织。但作为人类，尤其是心脏骤停的病人，不可能即时获得心脏组织来检测其βAR，因而寻找其它易于获取标本来检测其βAR，用于间接反映心肌细胞膜上βAR的功能变化，是我们临床上需要解决的问题。
有学者认为[3，4]，外周血淋巴细胞膜上主要存在β2AR，而心脏组织β1AR占多数，其外周血淋巴细胞膜β2AR仅仅是心肌细胞膜β2AR的映射，而不是β1AR的映射，因而外周血βAR变化不能反映心肌组织的变化。但有很多学者则发现[5，6]，淋巴细胞既有β2AR，也有β1AR，心肌细胞β1AR占多数，但也有较多的β2AR，且β1AR与β2AR有同源性。实验结果也证实[7，8]无论是动物或者人类，其外周血淋巴细胞与心肌细胞βAR密度间有良好的正相关性。淋巴细胞膜上虽然存在的是β2AR，但其密度同样受循环儿茶酚胺水平的调节，其对异丙肾上腺素的反应性与心肌细胞的反应性呈正相关[8，9]，因而外周血淋巴细胞密度可反映心肌细胞密度的变化。只要我们在随后的研究中，不涉及选择性β1AR激动剂或拮抗剂时，我们可以得到比较肯定的结论：外周血淋巴细胞与心肌细胞膜βAR具有显著的线性关系，并可用外周血淋巴细胞来监测心肌细胞的功能。国内在这一方面的研究还少有人涉及，为了证实国外的研究观点并开展关于βAR方面的研究，我们对猪外周血淋巴细胞及心肌组织的βAR进行密度的检测，结果发现得出了非常满意的结论。①从外周血淋巴细胞与心肌组织的数据所描绘的散点图可看出，散点基本上是沿一定的斜率呈直线状分布。就连个别极端值亦分布在该直线附近。这反映了外周血淋巴细胞βAR密度与心肌组织βAR密度大致成一直线关系。②从上述的实验数据可计算出外周血淋巴细胞βAR与心肌组织βAR密度间的相关系数r=0.9056(P<0.001)。表明外周血淋巴细胞βAR与心肌组织间βAR具有显著相关性。③外周血淋巴细胞与心肌细胞的βAR的相关关系可用一直线方程来描述，Y=0.00266X-1.103，从上述结论中我们可以得出与国外研究者相一致的结果。
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因而对外周血淋巴细胞βAR的检测可以反映心肌组织βAR密度的变化。故我们可用外周血淋巴细胞βAR的检测来监测药物所诱导的心肌细胞βAR的变化。在心跳骤停过程中探讨心肌细胞βAR的数目及功能的变化，以及探讨肾上腺素剂量的选择，从而对我们改进药物治疗的有效性大有帮助，特别是对肾上腺素在心肺复苏的作用的进一步研究中，打下了良好的基础。
[参考文献]
[1]Gibert EM,Olsen SL,Renland OG,et al.Beta-adrenergic receptor regulation and left ventricular function in idiopathic dilated cardiomyopathy[J].Am J Cardiol,1993,71:23c.
[2]Ditchey RV,Rubio-Perez A,Slinker BK.Beta-adrenergic blockade reduces myocardial injury during experimental CPR[J].J Am Coll Cardiol,1994,24:804.
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[3]Michell MC,Beckeringh JJ,Ikezono K,et al.Lymphocyte β2-adrenoceptors mirror precisely β2-adrenoceptor,but poorly β1-adrenoceptors changes in the Human heart[J].J Hypertens,1986,4(Suppl 6)：215.
[4]Brodde OE,Michel MC,Gordon EP et al.Beta-adrenoceptor regulation in the human heart:can it be monitored in circulation lymphocytes[J]?Eur Heart J,1989,10(Suppl):2.
[5]姜红，戴国柱，冯宗忱.心力衰竭患者心脏β受体系统调控在左心室重塑中的作用[J].中华医学杂志，1997，77(4)：249.
, 百拇医药
[6]Sbirrazzuoli V,Lapalus P.Human lymphocyte and myocardial beta-adrenoceptors:up and down regulation[J].Biomed Pharmacother,1989,43(5):369.
[7]Birstow MR.The adrenergic receptor configuration,regulation,mechanism of action[J].Postgrad Med,1988,2:19.
[8]Brodde OE,Kretsch R,Ikezono K,et al.Human beta-adrenoceptors relation between myocardial and lymphoctye beta-adrenoceptor density[J].Science,1986,231:1584.
[9]Maisel AS,Zieglar MG,Cartor S,et al.In vivo regulation of beta-adrenergic receptors on mononuclear leukocytes and heart[J].J Clin Invest,1988,82:2038.
[收稿：1999-10-18，修回：2000-04-23], http://www.100md.com