超氧阴离子自由基致NIH3T3细胞DNA损伤与c-myc基因表达

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     超氧阴离子自由基致NIH3T3细胞DNA损伤与c-myc基因表达

    余斌 李芸 盛齐 廖钢陵 吴元德

    摘 要 目的 研究超氧阴离子自由基( alt="14.gif (125 字节)"> alt="14.gif (125 字节)">)对NIH3T3细胞DNA的损伤及其脂质过氧化作用和对c-myc基因表达的影响。方法 用黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶(X-XO)系统产生 alt="14.gif (125 字节)">；测定DNA-溴乙锭结合物荧光强度变化确定DNA损伤程度；以硫代巴比妥酸法测定脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量；以细胞原位杂交法检测c-myc基因表达。 结果 高剂量 alt="14.gif (125 字节)">能直接引起DNA断裂损伤。 alt="14.gif (125 字节)">作用于完整细胞，MDA含量及DNA断裂损伤显著增加，过氧化氢酶能明显抑制此效应。中、高剂量 alt="14.gif (125 字节)">能引起明显的c-myc基因表达。结论 alt="14.gif (125 字节)">引起细胞DNA 损伤与过氧化氢的形成有关，其损伤的途径可能是通过膜脂质过氧化； alt="14.gif (125 字节)">诱导NIH3T3细胞c-myc基因表达与剂量密切相关。
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    关键词：超氧阴离子自由基 活性氧 DNA损伤 脂质过氧化 基因表达

    氧化应激损伤DNA导致细胞突变与肿瘤的发生、发展密切相关。已有研究证明，许多种类的活性氧引发脂质过氧化后的产物可与提取的DNA反应并导致损伤^[1～3]。但是对体内活性氧的重要来源超氧阴离子()与DNA损伤的关系，作用于完整细胞，引发膜脂质过氧化，损伤细胞内基因组DNA，影响细胞功能的研究尚鲜见报道。本研究采用黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶(X-XO)反应系统产生的，以溴乙锭(EB)作为荧光探针，检测DNA断裂损伤程度，并在完整NIH3T3细胞水平，研究致膜脂质过氧化、诱导基因组DNA损伤及其对细胞c-myc基因表达的影响。
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    材料和方法

    材料与仪器 NIH3T3 细胞由本所细胞生物室惠赠。X、EB、过氧化氢酶(CAT)、硫代巴比妥酸(TBA)为Sigma公司产品；XO、地高辛标记检测试剂盒为Boehringer Mannbeim公司产品；四乙氧基丙烷为Fluka公司产品；其余试剂均为国产分析纯级。荧光分光光度计为日本Hitachi MPF-4型；紫外分光光度计为Shimadz uv-1206型；高速分散器为上海XHF-1型；双光束薄层扫描仪为日本Shimadzu CS-910型。

    细胞培养 NIH3T3细胞在37 ℃、含5% CO₂的孵箱中培养，培养基为DMEM(含10%灭活小牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素， pH 7.2～7.4)。的产生 用D-Hank′s液配制浓度为0.2%的X液，以NaOH促溶；XO用D-Hank′s液制备成l U/ml母液备用；以化学发光法确定一定量的发光值，检测每次实验产生的均一性。
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    DNA提取和测定 采用酚-氯仿抽提法^[4]。测定波长为260、280 nm处光密度值，然后计算DNA纯度和浓度。

    测定损伤NIH3T3细胞中提取的DNA 直接作用于提取的细胞DNA，实验分成6组，每组取20 μg DNA,溶入总体积为200 μl的0.2 mol/L PBS(pH 7.0)中，分别加入：(1)正常对照，未加任何作用物；(2)低剂量(由加入0.4 μg X,4×10^-5U XO产生)；(3)高剂量(由加入20 μg X,2×10^-3 U XO产生)；(4)高剂量+20 U超氧化物歧化酶(SOD)+0.1 mmol/L FeSO₄；(5)0.1 mmol/L FeSO₄；(6)高剂量+20 U SOD+0.1 mmol/L FeSO₄+50 μl大鼠肝微粒体，该组DNA改为最后加入。各组在37 ℃温育120 min后加入10 μg EB，再温育15 min，以0.1×SSC(pH 6.8)溶液稀释至2.0 ml，以520 nm为激发波长，测定600 nm时的DNA-EB结合物的相对荧光强度。作用于完整的NIH3T3细胞后MDA含量及DNA损伤的测定 实验分成7组，在含有10⁷个细胞的l ml 培养基中，各组分别加入：(1)正常对照，未加任何作用物：(2)低剂量；(3)高剂量；(4)高剂量+20 U SOD+0.1 mmol/L FeSO₄;(5)0.1 mmol/L FeSO₄;(6)高剂量+0.1 mg/ml CAT;(7)高剂量+0.1 mmol/L FeSO₄+0.1 mg/ml CAT。各组在37 ℃温育5 h后，以高速分散器(2000 r/min,10 s,3次)分散细胞，以TBA法测定MDA含量^[5]。DNA损伤测定实验分组及处理过程同上。各组在37 ℃温育5 h后，提取细胞基因组DNA，直接在含有20 μg DNA的200 μl 0.2 mol/L PBS(pH7.0)中加入10 μg EB，温育15 min。荧光测定方法同前述。
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    X作用于完整的NIH3T3细胞检测c-myc基因表达 在含有10⁷个细胞的l ml培养基中分别加入高、中(由加入4 μg X,4×10^-4U XO产生)、低剂量X，37 ℃温育不同时间后以地高辛配基标记的c-myc基因探针进行原位杂交^[6]，并对杂交显色斑点结果进行薄层扫描分析。

    统计学处理 数据以平均值±标准差(X±s)表示，组间差异的显著性采用t检验分析。

    结 果对NIH3T3细胞中提取的DNA的损伤作用 加入高剂量及同时加入SOD、FeSO₄和SOD、FeSO₄、微粒体3组，DNA-EB结合物荧光强度较未经作用的对照组显著降低，低剂量及采用FeSO₄作用组DNA-EB结合物荧光强度虽比对照组降低但差异无显著性(表1)。作用于完整NIH3T3细胞后测定MDA含量及DNA损伤 低剂量及单独FeSO₄作用组MDA 含量及DNA-EB结合物荧光强度与对照组相比无显著差异。高剂量作用后MDA含量显著增加，DNA-EB结合物荧光强度则显著降低，高剂量+SOD+FeSO₄作用组，上述变化更为剧烈。在高剂量+CAT作用组，MDA含量与对照组相比差异无显著性，但DNA-EB结合物荧光强度仍有显著降低(表2)。
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    c-myc 基因的表达 低剂量作用15和60 min,c-myc基因基本无表达；中剂量作用60 min,有明显表达；而高剂量作用15 min后即有明显表达，60 min后表达甚微(图1，2)。

    表1 各种反应物作用后DNA-EB结合

    物相对荧光强度值变化

    Table 1 Relative fluorescence intensity value of EB combined with isolated NIH3T3 cell DNA reacted with various substances (x±s，n=4)
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    Group

    Relative

    fluorescence

    intensity

    Control

    41.2±1.8

    0.4 μg X+4×10^-5 U XO

    39.3±1.5

    20 μg X+2×10^-3 U XO

    37.5±1.4^*

    20 μg X+2×10^-3 U XO+SOD+FeSO₄
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    17.8±1.2^**

    FeSO₄

    39.3±1.2

    20 μg X+2×10^-3 U XO+SOD

    +FeSO₄+microsome

    20.3±1.4^**

    *P<0.05,**P<0.01 compared with the control group;SOD:superoxide dismutase,20 U/ml;FeSO₄：0.1mmol/L;Microsome:50 μl;X:xanthine; XO:xanthine oxidase
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    图 1 地高辛配基标记的c-myc基因探针与低浓度作用的NIH3T3细胞原位杂交RNA斑点扫描吸收分析

    Fig 1 Absorbance of screening the dot blot of situ RNA hybridization with digoxigenin-labled c-myc oncogene probes in the NIH3T3 cell pretreated with of low concentration

    1.control;2.cell treated with of low concentration after sixty minutes;3.cell treated with of low concentration after fifteen minutes
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    图 2 地高辛配基标记的c-myc 基因探 针与不同浓度作用的NIH3T3细胞原位杂交RNA斑点扫描吸收分析

    Fig 2 Absorbance of screening the dot blot of situ RNA hybridization with digoxigenin-labled c-myc oncogene probes in the NIH3T3 cell pretreated with of various concentrations

    1.control;4.cell treated with of middle concentration after sixty minutes;5.cell treated with of middle concentration after fifteen minutes;6.cell treated with of high concentration after sixty minutes;7.cell treated with of high concentration after fifteen minutes
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    表2 各种反应物作用后细胞MDA含量及DNA-EB 结合物相对荧光强度值

    Table 2 MDA content and relative fluorescence

    intensity value of EB combined with DNA

    which were isolated from whole NIH3T3 cell pretreated by

    various substances(x±s，n=4)

    Group

    MDA content (nmol/10⁷ cells)

    Relative fluorescence intensity
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    Control

    0.0424±0.0043

    41.1±1.1

    0.4 μg X+4×10^-5 U XO

    0.0428±0.0039

    39.8±1.8

    20 μg X+2×10^-3 U XO

    0.0800±0.0043^**

    29.4±3.3

    20 μg X+2×10^-3 U XO +SOD+FeSO₄
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    0.1012±0.0067^**

    25.3±2.3^**

    FeSO₄

    0.0428±0.0058

    40.2±3.7

    20 μg X+2×10^-3 U XO+CAT

    0.0459±0.0049

    37.0±1.6^*

    20 μg X+2×10^-3 U XO+FeSO₄+CAT
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    0.0430±0.0050

    37.6±1.8^*

    *P<0.05,**P<0.01 compared with the control group;SOD:20U/ml;FeSO₄:0.1 mmol/L;CAT:catalase(0.1 mg/ml)讨 论

    一些实验表明 和H₂O₂不能与DNA发生反应^[7]。但本实验结果显示高剂量 直接作用于DNA时，DNA-EB结合物荧光强度显著低于对照组，这可能是细胞染色体上存在铜离子^[8]促使 歧化生成的H₂O₂经过Fenton反应生成羟自由基(^.OH)后引起的DNA断裂所致。在有一定量的SOD和亚铁离子条件下，^.OH产生的更多，引起DNA断裂损伤更为显著。高剂量的 经过SOD歧化及由Fenton反应作用肝微粒体诱发脂质过氧化的产物也能造成DNA明显的断裂损伤。
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    高剂量 作用于完整的NIH3T3细胞后MDA含量显著增加，DNA-EB结合物荧光强度明显下降，提示细胞膜受到脂质过氧化损伤，及细胞内DNA链发生损伤断裂。Fe²⁺加重这种作用及足量的CAT可以明显抑制这种损伤效应，说明 歧化生成的H₂O₂经Fenton反应产生的^.OH与细胞膜及胞内DNA的损伤密切相关。在CAT抑制效应中，出现MDA含量维持在正常水平，而DNA-EB结合物荧光强度显著降低，表明DNA仍有一定的断裂损伤。提示 对细胞内DNA的损伤除与反应生成^.OH造成细胞膜的氧化损伤密切相关外，可能还存在着其它的作用途径，如影响细胞信号转导系统^[9]。
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    小剂量 作用于NIH3T3细胞，未能观察到c-myc基因表达，但在本室以往的研究中发现，小剂量 作用于NIH3T3细胞一定时间后，细胞可出现恶性转化^[10]，提示一次小剂量 作用于细胞不足以引起c-myc基因过度表达，而反复多次的作用则可能会引起c-myc基因的过度表达，调控细胞转化。一次中剂量或高剂量 作用于NIH3T3细胞，均能在不同时间观察到c-myc基因的高表达。本室另有研究发现，该剂量 可促使NIH3T3细胞凋亡^[11]。有学者认为c-myc基因起双向作用，既调控细胞增殖又调控细胞凋亡^[12]，故本研究中、高剂量 引起c-myc基因高表达可能与调控细胞凋亡有关。
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    国家自然科学基金(39670196)资助

    余斌(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所生物物理室，北京 100005)

    李芸(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所生物物理室，北京 100005)

    盛齐(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所生物物理室，北京 100005)

    廖钢陵(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所生物物理室，北京 100005)

    吴元德(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所生物物理室，北京 100005)

    参考文献

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    百拇医药网 http://www.100md.com/html/analecta/2000/09/01/05/555.htm