反义寡核苷酸对内毒素刺激的巨噬细胞血栓素A2合成的影响
反义寡核苷酸对内毒素刺激的巨噬细胞血栓素A2合成的影响
魏泽兰 王迪浔
摘 要 目的 筛选有效抑制内毒素刺激的巨噬细胞血栓素合酶基因表达和血栓素A2生成的反义寡脱氧核苷酸片段。方法 人工合成的3条反义寡核苷酸片段(ODNⅠ、ODNⅡ、ODNⅢ)和内毒素刺激的大鼠腹腔巨噬细胞共温育24 h，以放射免疫方法检测血栓素A2的稳定代谢产物血栓素B2的含量；以分子杂交技术检测血栓素合酶mRNA的表达水平。 结果 ODNⅠ组血栓素B2的含量为(69.7±10.9) pg/μg细胞蛋白，明显低于对照组的(100.6±28.6) pg/μg细胞蛋白(P<0.05)；且血栓素合酶mRNA水平也明显低于对照组。ODNⅡ组、ODNⅢ组血栓素B2水平和血栓素合酶mRNA水平均与对照组无明显差异。结论 ODNⅠ能有效抑制内毒素刺激的巨噬细胞血栓素A2的合成。
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关键词：反义核酸 血栓素合酶 血栓素A2 内毒素
在内毒素性休克，弥散性血管内凝血等病理过程中，血栓素A2(TXA2)水平的增高是引起组织损伤的重要因素，已有研究证明人工合成的反义寡核苷酸(ODNs)对血栓素合酶基因表达及TXA2生成有抑制作用[1]，若反义ODNs能减少TXA2在病变过程中的过量生成，就有可能减轻内毒素血症对机体的危害。本实验旨在探讨反义ODNs对内毒素刺激的巨噬细胞合成分泌TXA2的影响。
材料和方法
材料 DMEM培养基， 胎牛血清， TrizolTM试剂盒购自Gibco公司。 限制性内切酶Xba Ⅰ, Xho Ⅰ，随机引物标记系统为Promega公司产品。 α-32P-dATP购自中国原子能同位素公司。 TXB2放免试剂盒购自北京东亚免疫技术研究所。 TXS cDNA质粒为美国德克萨斯州立大学Wang教授惠赠。 本实验所用内毒素购自Sigma公司，成分为脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)。其它试剂均为进口或国产分析纯级产品。
, 百拇医药
大鼠腹腔巨噬细胞的培养 按常规方法收集、培养SD雄性大鼠腹腔巨噬细胞。按每孔(2～4)×106个细胞数接种于12孔培养板中，于37 ℃,5% CO2条件下温育3 h后，用DMEM洗去未贴壁的细胞，继续培养24 h后，用于实验。
反义寡核苷酸的设计、合成与修饰 针对大鼠血栓素合酶(TXS) cDNA设计了3条反义ODNs片段：ODN Ⅰ 与大鼠TXS cDNA第5位至第22位的碱基互补，序列为5′-TGAGAAGCCCCAACACTT-3′；ODNⅡ与大鼠TXS cDNA第65位至第86位的碱基互补，序列为5′-TTCAGGAGGGCCAAGAGAGC- CA-3′。ODNⅢ与大鼠TXS cDNA第833位至第852位碱基互补，序列为5-′ATCCAGCACCATCTG- CAGGA-3′。从病毒基因库中随机选出1个非特异性片段(non-specific ODN)作为对照，序列为5′-ATAAGCTCGACC- GTCGCT-3′，与TXS基因比较，无结合的可能性。ODNⅠ的错义ODN(missense ODN),序列为5′-CTTACACCAGCCGAATGA-3′。以上片段经亚磷酰胺法全硫代修饰，PAGE纯化，紫外分光光度法定量。
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TXA2测定 以放射免疫方法检测巨噬细胞培养液中TXA2的稳定代谢产物TXB2的含量。首先，检测大鼠腹腔巨噬细胞在不同浓度内毒素作用下(0、10、20 ng/ml DMEM)细胞培养上清中TXB2的含量；以20 ng/ml DMEM内毒素为刺激浓度，取3条反义ODNs和非特异性ODN与巨噬细胞共温育24 h(各组ODN均取0、4、8、12 μmol/L 4个浓度)，检测细胞培养上清中TXB2的含量；取12 μmol/L的ODN Ⅰ与ODN Ⅰ的错义ODN，与20 ng/ml DMEM内毒素刺激的巨噬细胞温育24 h后，检测细胞培养上清中TXB2的含量。
TXS cDNA探针制备与标记 质粒经转化，鉴定，扩增，Xba Ⅰ,Xho Ⅰ酶切电泳，回收的0.5 kb片段即为TXS cDNA探针，按随机引物法以32P标记探针，同时标记β-actin探针。
, 百拇医药
斑点杂交法检测巨噬细胞TXS mRNA的表达 取上述实验后各组大鼠腹腔巨噬细胞，按TrizolTM试剂盒说明操作，提取细胞总RNA。甲醛变性凝胶电泳鉴定RNA的完整性，紫外分光光度法测定RNA的量。每组用15 μg总RNA点膜，按文献[1]的方法以TXS cDNA和β-actin探针进行杂交，洗膜。在-70 ℃进行放射自显影，定影。斑点用Kodak图象分析系统分析处理，斑点灰度以相对积分吸光度值进行半定量。共进行3次独立的斑点杂交重复实验，取其中一次结果进行分析。
统计学处理 数据以均值±标准差(x±s)表示，组间差异显著性采用t检验。
结 果
内毒素刺激大鼠巨噬细胞分泌TXA2的作用 当内毒素浓度为0，10，20 ng/ml DMEM时，TXB2的含量分别为50，102，127 pg/μg细胞蛋白。
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反义ODNs对内毒素刺激的巨噬细胞生成TXA2的影响 ODNⅠ组TXB2的含量在3个浓度点分别为(75.4±17.7)，(72.8±17.3)，(69.7±10.9) pg/μg细胞蛋白，均低于对照组的(90.6±12.7)，(99.1±15.4)，(93.5±6.1) pg/μg细胞蛋白，当ODN浓度为12 μmol/L时，差异有显著性(P<0.05，图1)。另有实验显示，12 μmol/L ODN时，ODN Ⅰ组TXB2含量(70.1±11.3) pg/μg细胞蛋白较对照组(100.1±10.3) pg/μg细胞蛋白有显著下降(P<0.05)，而同浓度的错义ODN组TXB2含量(101.3±8.4) pg/μg细胞蛋白与对照组无明显差异，说明ODN Ⅰ抑制作用有序列特异性。
图 1 反义与非特异性ODN对内毒素刺激的巨噬细胞生成TXB2的影响
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Fig 1 Effect of ODNs on the levels of TXB2 from macrophages stimulated by endotoxin (x±s)
*P<0.05 compared with non-specific ODN
图 2 反义ODNs与非特异性ODN对内毒素刺激的巨噬细胞TXS mRNA表达水平的影响
Fig 2 Effects of ODNs on the expression of TXS mRNA from macrophages stimulated by endotoxin
, 百拇医药
图 3 反义ODN Ⅰ与错义ODN对内毒素刺激的巨噬细胞TXS mRNA表达水平的影响
Fig 3 Effect of ODN Ⅰ and mis-ODN on the expression of TXS mRNA from macrophages stimulated by endotoxin
反义ODNs对巨噬细胞TXS mRNA表达的影响 各组两探针斑点灰度积分吸光度的比值：ODN I组为0.69，与非特异性对照组1.3相比下降了57%(图2)。ODN Ⅰ与其错义ODN相比，ODN Ⅰ组比值为0.25，比对照组0.55降低了45%；错义ODN组比值为0.54，与对照组相比无下降趋势(图3)。
讨 论
静息状态的巨噬细胞在胞浆磷脂酶A2(cPLA2)、环氧合酶-1(COX-1)和血栓素合酶(TXS)作用下产生结构型即刻反应，生成基础水平的TXA2，TXA2是前列腺素类物质之一。内毒素刺激的巨噬细胞发生诱导型反应，主要由诱导型的PLA2、COX-2、PGE2合酶参与代谢，产物以PGE2生成增多为主[2]。本实验结果显示：一定浓度的内毒素可刺激巨噬细胞分泌TXA2增加2倍多，这可能是内毒素对COX-2等基因的诱导作用所致[3]。TXS是否象COX、PGH合酶、PGE2合酶一样，有结构型和诱导型之分，还需进一步研究，但其底物PGH2的增加就可使TXA2的合成相应增加[4]。
, 百拇医药
TXS在大鼠腹腔巨噬细胞中有丰富的表达[5]。Matsumoto等[3]实验表明：经内毒素刺激的巨噬细胞中TXS活性略有增高，当细胞中加入放线菌酮、放线菌素D以抑制新的蛋白质和RNA合成时，TXS活性显著下降，说明内毒素可通过诱导TXS的合成使TXA2生成增多。本课题人工合成的ODNⅠ可能就是通过与TXS mRNA结合，加速其降解，干扰TXS蛋白的合成，从而达到减少TXA2生成的目的，且此片段具有较高的序列特异性。
前列腺素类物质不仅参与一系列正常的细胞代谢调节，在疾病过程中也有过量表达。传统的非甾体抗炎药，如消炎痛在减少TXA2生成的同时，也引起一些副作用。本实验从细胞、分子水平筛选出能有效抑制内毒素刺激的巨噬细胞TXS基因表达和TXA2生成的反义寡核苷酸片段——ODNⅠ，为反义技术作为基因治疗的手段提供了可行性依据。■
, 百拇医药 国家自然科学基金(39400052)资助
魏泽兰(同济医科大学 病理生理学教研室，武汉430030)
王迪浔(同济医科大学 病理生理学教研室，武汉430030)
参考文献
[1]魏泽兰,胡清华,王迪浔.反义核酸抑制血栓素合酶的基因表达.中国病理生理杂志,1998,14(6):595-598
[2]Naraba H,Murakami M,Matsumoto H,et al.Segregated coupling of phospholipases A2,cyclooxygenases,and terminal prostaniod synthase in different phases of prostanoid biosynthesis in rat peritoneal macrophages.J Immunol,1998,160(6):2974-2982
, 百拇医药
[3]Matsumoto H,Naraba H,Murakami M,et al.Concor- dant induction of prostaglandin E2 synthase with cyclooxygenase-2 leads to preferred production of prostaglandin E2 over thromboxane and prostaglandin D2 in lipopolysaccharide-stimulated rat peritoneal macrophages.Biochem Biophy Res Com,1997,230:110-114
[4]Hempel SL,Monick MM,Hunninghake GW.Lipopol- ysaccharide induces prostaglandin H synthase-2 protein and mRNA in human alveolar macrophages and blood monocytes.J Clin Invest,1994,93(1):391-396
[5]Tone Y,Miyata A,Hara S.Abundant expression of thromboxane synthase in rat macrophages.FEBS Letters,1994,340:241-244, 百拇医药(反义寡核苷酸对内毒素刺激的巨噬细胞血栓素A2合成的影响)
魏泽兰 王迪浔
摘 要 目的 筛选有效抑制内毒素刺激的巨噬细胞血栓素合酶基因表达和血栓素A2生成的反义寡脱氧核苷酸片段。方法 人工合成的3条反义寡核苷酸片段(ODNⅠ、ODNⅡ、ODNⅢ)和内毒素刺激的大鼠腹腔巨噬细胞共温育24 h，以放射免疫方法检测血栓素A2的稳定代谢产物血栓素B2的含量；以分子杂交技术检测血栓素合酶mRNA的表达水平。 结果 ODNⅠ组血栓素B2的含量为(69.7±10.9) pg/μg细胞蛋白，明显低于对照组的(100.6±28.6) pg/μg细胞蛋白(P<0.05)；且血栓素合酶mRNA水平也明显低于对照组。ODNⅡ组、ODNⅢ组血栓素B2水平和血栓素合酶mRNA水平均与对照组无明显差异。结论 ODNⅠ能有效抑制内毒素刺激的巨噬细胞血栓素A2的合成。
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关键词：反义核酸 血栓素合酶 血栓素A2 内毒素
在内毒素性休克，弥散性血管内凝血等病理过程中，血栓素A2(TXA2)水平的增高是引起组织损伤的重要因素，已有研究证明人工合成的反义寡核苷酸(ODNs)对血栓素合酶基因表达及TXA2生成有抑制作用[1]，若反义ODNs能减少TXA2在病变过程中的过量生成，就有可能减轻内毒素血症对机体的危害。本实验旨在探讨反义ODNs对内毒素刺激的巨噬细胞合成分泌TXA2的影响。
材料和方法
材料 DMEM培养基， 胎牛血清， TrizolTM试剂盒购自Gibco公司。 限制性内切酶Xba Ⅰ, Xho Ⅰ，随机引物标记系统为Promega公司产品。 α-32P-dATP购自中国原子能同位素公司。 TXB2放免试剂盒购自北京东亚免疫技术研究所。 TXS cDNA质粒为美国德克萨斯州立大学Wang教授惠赠。 本实验所用内毒素购自Sigma公司，成分为脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)。其它试剂均为进口或国产分析纯级产品。
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大鼠腹腔巨噬细胞的培养 按常规方法收集、培养SD雄性大鼠腹腔巨噬细胞。按每孔(2～4)×106个细胞数接种于12孔培养板中，于37 ℃,5% CO2条件下温育3 h后，用DMEM洗去未贴壁的细胞，继续培养24 h后，用于实验。
反义寡核苷酸的设计、合成与修饰 针对大鼠血栓素合酶(TXS) cDNA设计了3条反义ODNs片段：ODN Ⅰ 与大鼠TXS cDNA第5位至第22位的碱基互补，序列为5′-TGAGAAGCCCCAACACTT-3′；ODNⅡ与大鼠TXS cDNA第65位至第86位的碱基互补，序列为5′-TTCAGGAGGGCCAAGAGAGC- CA-3′。ODNⅢ与大鼠TXS cDNA第833位至第852位碱基互补，序列为5-′ATCCAGCACCATCTG- CAGGA-3′。从病毒基因库中随机选出1个非特异性片段(non-specific ODN)作为对照，序列为5′-ATAAGCTCGACC- GTCGCT-3′，与TXS基因比较，无结合的可能性。ODNⅠ的错义ODN(missense ODN),序列为5′-CTTACACCAGCCGAATGA-3′。以上片段经亚磷酰胺法全硫代修饰，PAGE纯化，紫外分光光度法定量。
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TXA2测定 以放射免疫方法检测巨噬细胞培养液中TXA2的稳定代谢产物TXB2的含量。首先，检测大鼠腹腔巨噬细胞在不同浓度内毒素作用下(0、10、20 ng/ml DMEM)细胞培养上清中TXB2的含量；以20 ng/ml DMEM内毒素为刺激浓度，取3条反义ODNs和非特异性ODN与巨噬细胞共温育24 h(各组ODN均取0、4、8、12 μmol/L 4个浓度)，检测细胞培养上清中TXB2的含量；取12 μmol/L的ODN Ⅰ与ODN Ⅰ的错义ODN，与20 ng/ml DMEM内毒素刺激的巨噬细胞温育24 h后，检测细胞培养上清中TXB2的含量。
TXS cDNA探针制备与标记 质粒经转化，鉴定，扩增，Xba Ⅰ,Xho Ⅰ酶切电泳，回收的0.5 kb片段即为TXS cDNA探针，按随机引物法以32P标记探针，同时标记β-actin探针。
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斑点杂交法检测巨噬细胞TXS mRNA的表达 取上述实验后各组大鼠腹腔巨噬细胞，按TrizolTM试剂盒说明操作，提取细胞总RNA。甲醛变性凝胶电泳鉴定RNA的完整性，紫外分光光度法测定RNA的量。每组用15 μg总RNA点膜，按文献[1]的方法以TXS cDNA和β-actin探针进行杂交，洗膜。在-70 ℃进行放射自显影，定影。斑点用Kodak图象分析系统分析处理，斑点灰度以相对积分吸光度值进行半定量。共进行3次独立的斑点杂交重复实验，取其中一次结果进行分析。
统计学处理 数据以均值±标准差(x±s)表示，组间差异显著性采用t检验。
结 果
内毒素刺激大鼠巨噬细胞分泌TXA2的作用 当内毒素浓度为0，10，20 ng/ml DMEM时，TXB2的含量分别为50，102，127 pg/μg细胞蛋白。
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反义ODNs对内毒素刺激的巨噬细胞生成TXA2的影响 ODNⅠ组TXB2的含量在3个浓度点分别为(75.4±17.7)，(72.8±17.3)，(69.7±10.9) pg/μg细胞蛋白，均低于对照组的(90.6±12.7)，(99.1±15.4)，(93.5±6.1) pg/μg细胞蛋白，当ODN浓度为12 μmol/L时，差异有显著性(P<0.05，图1)。另有实验显示，12 μmol/L ODN时，ODN Ⅰ组TXB2含量(70.1±11.3) pg/μg细胞蛋白较对照组(100.1±10.3) pg/μg细胞蛋白有显著下降(P<0.05)，而同浓度的错义ODN组TXB2含量(101.3±8.4) pg/μg细胞蛋白与对照组无明显差异，说明ODN Ⅰ抑制作用有序列特异性。
图 1 反义与非特异性ODN对内毒素刺激的巨噬细胞生成TXB2的影响
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Fig 1 Effect of ODNs on the levels of TXB2 from macrophages stimulated by endotoxin (x±s)
*P<0.05 compared with non-specific ODN
图 2 反义ODNs与非特异性ODN对内毒素刺激的巨噬细胞TXS mRNA表达水平的影响
Fig 2 Effects of ODNs on the expression of TXS mRNA from macrophages stimulated by endotoxin
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图 3 反义ODN Ⅰ与错义ODN对内毒素刺激的巨噬细胞TXS mRNA表达水平的影响
Fig 3 Effect of ODN Ⅰ and mis-ODN on the expression of TXS mRNA from macrophages stimulated by endotoxin
反义ODNs对巨噬细胞TXS mRNA表达的影响 各组两探针斑点灰度积分吸光度的比值：ODN I组为0.69，与非特异性对照组1.3相比下降了57%(图2)。ODN Ⅰ与其错义ODN相比，ODN Ⅰ组比值为0.25，比对照组0.55降低了45%；错义ODN组比值为0.54，与对照组相比无下降趋势(图3)。
讨 论
静息状态的巨噬细胞在胞浆磷脂酶A2(cPLA2)、环氧合酶-1(COX-1)和血栓素合酶(TXS)作用下产生结构型即刻反应，生成基础水平的TXA2，TXA2是前列腺素类物质之一。内毒素刺激的巨噬细胞发生诱导型反应，主要由诱导型的PLA2、COX-2、PGE2合酶参与代谢，产物以PGE2生成增多为主[2]。本实验结果显示：一定浓度的内毒素可刺激巨噬细胞分泌TXA2增加2倍多，这可能是内毒素对COX-2等基因的诱导作用所致[3]。TXS是否象COX、PGH合酶、PGE2合酶一样，有结构型和诱导型之分，还需进一步研究，但其底物PGH2的增加就可使TXA2的合成相应增加[4]。
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TXS在大鼠腹腔巨噬细胞中有丰富的表达[5]。Matsumoto等[3]实验表明：经内毒素刺激的巨噬细胞中TXS活性略有增高，当细胞中加入放线菌酮、放线菌素D以抑制新的蛋白质和RNA合成时，TXS活性显著下降，说明内毒素可通过诱导TXS的合成使TXA2生成增多。本课题人工合成的ODNⅠ可能就是通过与TXS mRNA结合，加速其降解，干扰TXS蛋白的合成，从而达到减少TXA2生成的目的，且此片段具有较高的序列特异性。
前列腺素类物质不仅参与一系列正常的细胞代谢调节，在疾病过程中也有过量表达。传统的非甾体抗炎药，如消炎痛在减少TXA2生成的同时，也引起一些副作用。本实验从细胞、分子水平筛选出能有效抑制内毒素刺激的巨噬细胞TXS基因表达和TXA2生成的反义寡核苷酸片段——ODNⅠ，为反义技术作为基因治疗的手段提供了可行性依据。■
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魏泽兰(同济医科大学 病理生理学教研室，武汉430030)
王迪浔(同济医科大学 病理生理学教研室，武汉430030)
参考文献
[1]魏泽兰,胡清华,王迪浔.反义核酸抑制血栓素合酶的基因表达.中国病理生理杂志,1998,14(6):595-598
[2]Naraba H,Murakami M,Matsumoto H,et al.Segregated coupling of phospholipases A2,cyclooxygenases,and terminal prostaniod synthase in different phases of prostanoid biosynthesis in rat peritoneal macrophages.J Immunol,1998,160(6):2974-2982
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[3]Matsumoto H,Naraba H,Murakami M,et al.Concor- dant induction of prostaglandin E2 synthase with cyclooxygenase-2 leads to preferred production of prostaglandin E2 over thromboxane and prostaglandin D2 in lipopolysaccharide-stimulated rat peritoneal macrophages.Biochem Biophy Res Com,1997,230:110-114
[4]Hempel SL,Monick MM,Hunninghake GW.Lipopol- ysaccharide induces prostaglandin H synthase-2 protein and mRNA in human alveolar macrophages and blood monocytes.J Clin Invest,1994,93(1):391-396
[5]Tone Y,Miyata A,Hara S.Abundant expression of thromboxane synthase in rat macrophages.FEBS Letters,1994,340:241-244, 百拇医药(反义寡核苷酸对内毒素刺激的巨噬细胞血栓素A2合成的影响)