可降解聚合物在骨组织工程中的应用进展
郑磊 王前 裴国献
摘 要 目的 探讨理想的骨组织工程细胞外基质材料的选择和制备。方法 广泛查阅了近期有关可降解聚合物用作成骨细胞培养支架的文献，总结了各种可降解聚合物在骨组织工程研究中作为细胞外基质材料的优缺点。结果 理想的骨组织工程细胞外基质材料应由无机类材料、人工合成聚合物类材料和天然聚合物类材料组成，并含有最佳的生长因子缓释系统的多孔三维立体泡沫。结论 复合型细胞外基质材料的研制是骨组织工程研究中十分重要而迫切的任务。
关键词：可降解聚合物 骨 组织工程 细胞外基质材料
器官和组织中的细胞，其行为不仅取决于细胞内在的基因序列，还在很大程度上受到外界环境因素的影响，包括细胞与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的相互作用。ECM不仅为细胞生长提供支持和保护，更重要的是细胞与ECM的相互作用调节细胞的形态发生过程，影响细胞生存、迁移、增殖和功能代谢。因此，在组织工程研究中挑选和制备利于种子细胞的粘附、增殖和分化的细胞外基质材料是十分重要和迫切的任务。
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理想的骨组织工程细胞外基质材料的要求有[1、2]：①良好的生物相容性。除满足生物材料的一般要求，如无毒、不致畸性等外，还应利于种子细胞粘附、增殖，降解产物对细胞无毒害作用，不引起炎症反应，甚至利于细胞生长和分化。②良好的生物降解性。基质材料在完成支架作用后应能降解，降解率应与组织细胞生长率相适应，降解时间应能根据组织生长特性作人为调控。③具有三维立体多孔结构。基质材料可加工成三维立体结构，孔隙率最好达90%以上，具有较高的面积体积比。这种结构可提供宽大的表面积和空间，利于细胞粘附生长，细胞外基质沉积，营养和氧气进入，代谢产物排出，也有利于血管和神经长入。④可塑性和一定的机械强度。基质材料具有良好的可塑性，可预先制作成一定形状。并具有一定的机械强度，为新生组织提供支撑，并保持一定时间直至新生组织具有自身生物力学特性。⑤良好的材料-细胞界面。材料应能提供良好的细胞界面，利于细胞粘附、增殖，更重要的是能激活细胞特异基因表达，维持细胞正常表型表达。
目前，可降解聚合物用作骨组织工程细胞外基质材料主要有两类，一类是天然聚合物，如胶原蛋白、纤维蛋白等；另一类为人工合成聚合物，如聚酯类、聚偶磷氮等。天然材料生物相容性好，具有细胞识别信号(如某些氨基酸序列等)，利于细胞粘附、增殖和分化，但也存在许多缺点，如大规模生产的限制、不同批号制成品的差异、材料本身因素控制的困难(如机械强度、降解速度等)。人工合成聚合物则避免了上述困难，材料的微结构、大体形态、机械性能、降解时间等都能预先设计和调控，最后降解完全，避免了长期异物反应的危险。但人工合成材料最大的缺点是缺乏细胞识别信号，与细胞间缺乏生物性相互作用。并且目前人工合成聚合物要达到理想的骨组织工程细胞外基质材料的要求在制作中还存在许多差距。
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1 人工合成可降解聚合物
目前，可用作成骨细胞种植基质材料的聚合物主要有：聚乳酸(polylactic acid,PLA)、聚乙醇酸(polyglycolic acid,PGA)、聚偶磷氮(polyphophazenes)、聚原酸酯(polyorthoester,POE)、聚己内酯(polycaprolactone,PCL)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚酸酐亚胺共聚物[poly (anhydride-co-imides)]、聚羟丁酯(polyhydroxyrate,PHB)及其共聚物等。下面介绍几种生物可降解合成聚合物在骨组织工程中的应用情况。
1.1 聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物
PLA、PGA均属α-聚酯类。PLA有三种异构体(PDLA、PLLA、PDLLA)，在体内降解生成乳酸，是糖的代谢产物；PGA在体内降解为羟基乙酸，易于参加体内代谢。聚合物中酯键易于水解，属非酶性水解。共聚物的降解时间可通过改变两者的比例来调控，约为几周到几年。这类聚合物属热塑性塑料，可通过模塑、挤压、溶剂浇铸等技术加工成各种结构形状。因其降解产物无毒及良好的生物相容性，PLA、PGA已被美国食品与药品管理局(FDA)批准广泛用作医用缝线、暂时性支架和药物控释载体。Vacanti等[3]首先将PGA、PLA用作软骨细胞体外培养基质材料，通过组织工程方法获得新生软骨成功。此后，PLA、PGA及其共聚物被广泛用于组织工程各类组织细胞外的基质材料，如软骨、骨、肌腱、小肠、气管、心瓣膜等，取得了初步成功。
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PLA、PGA及其共聚物在组织工程中应用的主要结构形式有纤维支架、多孔泡沫以及管状结构等。这些结构形式在骨组织工程实验研究中都显示出良好的成骨效应。
Breitbart等[4]将PGA无纺纤维支架制成直径15 mm、厚2 mm的圆盘状，复合体外培养的兔骨膜成骨细胞，植入修复兔颅骨直径为15 mm的全层骨缺损。4周后缺损区有骨岛形成，12周后缺损区大量骨生成，完全修复骨缺损。Ishaug等[5]将大鼠骨髓基质细胞种植于PLGA泡沫，再将复合物移植于大鼠肠系膜观察其成骨能力。组织学检查发现7天后复合物中即可见矿化骨组织，7周后，孔径为150～300 μm的泡沫复合物中矿化骨组织厚度达(370±160) μm。另外，PLA、PGA及其共聚物亦被制成管状结构用于小肠、尿道等管状器官的组织工程细胞外基质材料。
尽管目前PLA、PGA及其共聚物是应用最为广泛的组织工程细胞外基质材料，但在应用过程中发现不少缺点。下面就其不足之处和改善方法作一简单介绍。
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1.1.1 亲水性差，细胞吸附力较弱 以PLA包埋的PGA无纺纤维支架亲水性差、细胞吸附力弱的问题一直困扰着组织工程学家，人们一直在寻找解决这一问题的方法。Mikos等[6]通过乙醇和水两步预湿的方法，有效地对支架进行预湿，增强了亲水性，促进了细胞在支架表面均匀分布，并将有利于体内移植后纤维血管的长入。刘彦春等[7]选择卵磷脂和多聚赖氨酸共同包埋PGA+PLA，也显著提高了支架的亲水性和细胞吸附力。Hubble[8]指出，聚乙醇是一种水溶性、非离子聚合物，可减少生物材料对蛋白的吸附作用。将聚乙醇与聚酯形成共聚物，可提高材料的亲水性，同时也加速了聚合物的降解。
1.1.2 引起无菌性炎症 临床上PLA、PGA的应用过程中发现患者出现非特异性无菌性炎症反应率较高，约为8%[9]。Lam等[10]的实验中提出中分子量降解产物可增加非感染炎性反应，PLA平均分子量低于20 ku(1 Da=0.992 1 u)时，无菌性炎症发生率较高，使用高分子量PLA可延迟但不能消除这一反应。
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目前认为出现无菌性炎症的原因可能与聚合物降解过程中酸性降解产物引起局部pH值下降有关[11]。因此，有学者将碱性物质，如碳酸钙、碳酸氢钠、钙羟基磷灰石引入聚合物中，可代偿聚合物降解引起的pH值下降，有助于防止无菌性炎症的发生[12]。另外，将聚酯-聚乙二醇共聚物作为前体物质合成水凝胶，这种水凝胶中聚酯在聚己二醇末端以低聚体形式存在，含量较低，在体内降解过程中不会引起炎症反应[8]。当然，无菌性炎症的根本解决办法是开发一种降解不释放或缓慢释放酸性降解产物的新型聚合物。
1.1.3 机械强度不足 单纯编织成的PGA无纺纤维支架不具备一定的抗压强度，通过聚合物包埋或热处理虽然可改善其机械强度，但仍然存在抗压强度不足的缺陷。Devin等[13]将羟基磷灰石(hydroxyapatile,HA)与50∶50 PLGA共聚物组成多孔复合基质材料，实验表明复合材料抗压弹性模量随HA成份增加而增加。聚合物降解后，含50%HA的复合材料模量为1 459 MPa，而不含HA的基质材料模量为293 MPa。同时，HA的引入也延缓了聚合物的降解时间。含10%HA的复合材料6周内可完全降解，而含50%HA的复合材料则相对稳定。因此，将钙磷陶瓷引入PLGA共聚物，可改善PLGA的机械性能差、降解速度快、骨结合力弱等缺点。
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1.1.4 其他 PLA、PGA及其共聚物还存在其他一些问题，如聚合物中残留的有机溶剂的细胞毒作用，以及可能引起的纤维化及与周围组织的免疫反应等问题[14]。
1.2 聚丁酸
聚丁酸(polyhydroxybutyrate,PHB)最早由Lemoigne(1964)从细菌中分离出来，随后在诸多细菌，如巨杆菌属、红螺菌属等的胞浆颗粒中均发现有这种聚合物。PHB是由3-羟基丁酸通过酯键链接而成。PHB最早被美国农业食品组织用作动物饲料，后来人们发现PHB具有压电效应，十分适合作为骨折固定材料，但由于单纯PHB易碎、热不稳定、降解时间长、可塑性和机械性能差等缺点限制了它的广泛应用。
将聚羟戊酸(polyhydroxyvalerate,PHV)引入PHB主链，形成PHBV共聚物，由PHB和0～24%PHV组成，可改善PHB的上述缺点。PHBV可在较低的温度下加工塑形，避免了PHB的热降解问题。PHBV通过微生物酶解和水解作用而发生降解，水解作用主要与环境酸碱度有关。Rivard等[15]用PHB/9%HV组成的PHBV共聚物制成三维立体泡沫用作软骨细胞、成骨细胞培养支架，细胞均匀分散在整个聚合物基质中，呈良好的粘附、增殖状态，并在培养21天时细胞生长达最大密度。但PHBV共聚物还存在机械性能差、骨结合力弱等问题。
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1.3 聚偶磷氮
Allcock最早通过聚二氯化偶磷氮与氨基酸酯反应制得含氨基酸酯取代基的聚有机偶磷氮[poly(organo)phosphazenes]。这种聚有机偶磷氮具有良好的生物相容性，降解产物无毒，逐渐被用作药物控释载体。聚有机偶磷氮降解是通过氨基酸酯的水解，生成羧酸，再催化主链的裂解。因此通过调节水解不稳定性的氨基酸酯取代基与主链的化学组成可以实现聚合物降解速度的调控。其完全水解产物对人体基本无毒害作用。
Laurencin等[16]将聚有机偶磷氮用作成骨细胞培养载体，发现取代基为乙基甘氨酸酯的聚有机偶磷氮，不仅有利于细胞的粘附生长，而且可提高聚合物的降解率。在此基础上，通过盐析技术制成具有三维立体结构的聚甲基苯氧基乙基甘氨酸偶磷氮，平均孔径165 μm，分布均匀，孔隙之间相互交通。将成骨细胞种植于其上，培养第1天成骨细胞就从材料表面长入孔隙内，并在21天的培养期中细胞以恒定速度增殖，呈现出良好的生物相容性。但其水解产物对人体可能产生一定毒害作用。
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1.4 聚酸酐
聚酸酐是由羧酸聚合而成。性质活泼，遇水极不稳定。脂肪簇聚酸酐在几天内完全降解，而芳香簇聚酸酐则需几年时间才能降解完全。综合两者的特点，通过调整主链中两种单体的组成比例来调控材料的性能和降解速度。毒理学评价表明，聚酸酐的体内生物相容性非常理想，被广泛用于药物控释体系。
Attawia等[17、18]将酸酐和亚胺聚合成共聚物用作成骨细胞培养载体。其中亚胺成份由苯均四酸亚胺丙氨酸或偏苯三酸亚胺甘氨酸组成。酸酐成份由皮脂酸或1，6-二羧基苯氧乙烷组成。将共聚物制成圆盘状，与成骨细胞株MC3T3-E1共同培养，发现24小时内，酸酐单体在1，6-二羧基苯氧己烷的共聚物培养体系中，细胞粘附良好，形态正常。而单体在皮脂酸的共聚物培养体系中，由于聚合物表面的快速降解，导致细胞不粘附。在此基础上，进一步研究了在共聚物降解产物苯均四酸亚胺丙氨酸和苯均四酸存在的情况下，成骨细胞仍能维持特征性的多角形，在21天的培养期内维持分泌骨钙素的成骨细胞表型。这种亚胺酸酐共聚物对成骨细胞有良好的相容性，不影响表型表达，但其中的亚胺成份可能对细胞生长有影响。
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2 天然高分子聚合物
2.1 胶原
胶原是动物体内含量最丰富的蛋白，约占人体蛋白总量的30%以上，其中以ECM中胶原蛋白含量最高。胶原蛋白在体内以胶原纤维的形式存在，其基本组成单位是原胶原分子，原胶原蛋白分子经多级聚合形成胶原纤维。胶原纤维与细胞外基质中其他成份形成结构与功能的复合体。胶原主要分五类，骨组织中为Ⅰ型胶原。胶原不仅为细胞提供支持保护作用，而且与细胞的粘附、生长、表型表达均有密切关系。
Ⅰ型胶原通过成骨细胞表面特异性受体β1整合素亚单位与成骨细胞紧密结合。Basle等[19]研究发现成骨细胞系Saos-2在异种骨基质中沿胶原纤维束粘附延展，用免疫组织化学技术观察到胶原纤维表面通过β1整合素亚单位与细胞外表面紧密结合，当抗β1整合素亚单位抗体存在时，细胞堆积，无定向延展。另有研究表明Ⅰ型胶原与成骨细胞复合可提高成骨细胞的成骨能力，刺激多潜能间充质细胞向成骨细胞方向转化，并促进细胞表达碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Ⅰ型胶原及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)[20]。Green等[21]研究证实Ⅰ型胶原是通过增强成骨细胞的蛋白激酶C活性，增强成骨细胞合成蛋白能力，同时该酶还可活化Na+/H+交换系统，提高细胞质中的pH值，促进成骨细胞增殖。
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由于Ⅰ型胶原能促进成骨细胞粘附、增殖和分化，增强其成骨能力。Mizuno等[22]将Ⅰ型胶原用作骨髓基质细胞的培养基质，发现骨髓基质细胞可定向分化为成骨细胞，最终形成含骨髓成份的新生骨组织，成骨过程中无软骨生成，而Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ型胶原上则未见新骨生成。
Ⅰ型胶原由于含特定的细胞识别信号(如某些氨基酸序列)，利于成骨细胞粘附、增殖和分化，但其最大的缺点是缺乏一定的机械强度，难以单独用作成骨细胞培养基质材料，可作为良好的材料包埋和添加剂。另外，还存在生理学性质不稳定和外来胶原引起的免疫反应等问题。
2.2 纤维蛋白
纤维蛋白单体在凝血酶作用下可聚合成立体网状结构的纤维蛋白凝胶。聚合后的纤维蛋白凝胶可通过释放β转化因子和血小板衍生生长因子等来促进细胞粘附、增殖并分泌基质，具有良好的生物相容性。另外，纤维蛋白凝胶可塑性强，通过降低凝血酶浓度的方法可延缓纤维蛋白聚合过程，为凝胶的塑形提供充分的时间。这种纤维蛋白凝胶来源于自身血液，避免了免疫原性问题，是较理想的细胞外基质材料。Sims等[14]首次报道了用纤维蛋白凝胶复合软骨细胞植入无胸腺小鼠皮下，12周后新生软骨组织为透明软骨，氨基葡聚糖与软骨湿重比接近正常软骨。
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但是纤维蛋白凝胶也存在天然材料的共同缺点，如缺乏机械强度、大量获取困难、降解时间难以控制等，故也难以单独作为组织工程中成骨细胞种植基质材料。
2.3 甲壳素及其衍生物
甲壳素，亦称甲壳质、几丁质，是自然界中仅次于纤维素的天然多糖，广泛存在于昆虫、甲壳类动物外壳及真菌细胞壁中。经脱乙酰化反应变成甲壳胺，即壳聚糖。甲壳素一般不溶于水、碱和常规有机溶剂中。只溶于盐酸等无机酸及甲醇、乙醇等。高度脱乙酰化甲壳胺可溶于水。甲壳胺分子中有许多胺基和羟基，容易进行化学修饰和改性。这类天然多糖具有明显碱性、良好的生物相容性和生物可降解性。壳聚糖在体内溶菌酶、甲壳酶的作用下水解成低聚糖。由于壳聚糖的体内降解属于酶解作用，故难于对它的降解速度进行人为调控。降解产物为对人体无毒的N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖。降解过程中产生的低分子量甲壳素(胺)或其寡聚糖在体内不积累，无免疫原性。
Klokkevold等[23]研究了壳聚糖对体外成骨细胞分化和骨形成的影响。他们取胎鼠颅盖骨间充质细胞按3.5×105个/ml的细胞浓度种植于培养皿中，加入200 ml浓度为2 mg/ml的壳聚糖乙酸溶液共同培养14天，发现其成骨细胞克隆形成率为(6.2±1.2)个/皿，明显高于未加壳聚糖的对照组颗粒形成率(3.6±0.6)个/培养皿，新生骨组织的平均面积亦明显高于对照组。使用结果表明，壳聚糖具有促进前成骨细胞分化，加速骨形成的作用。倪斌等[24]用壳聚糖膜包绕骨缺损断端，认为它对骨膜下骨痂的生长能起导向作用。
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壳聚糖的生物相容性一般认为是良好的，但这些评价大都是将壳聚糖制成膜材料、线材料和药物载体的研究观察到的。当材料的几何形状变化时，通过蛋白质和细胞在其表面触发反应，可能损害与它接触的细胞和组织。张建湘等[25]发现在壳聚糖钉周围的炎症反应较明显，表现在钉周围始终有以淋巴细胞、中性粒细胞和异物巨噬细胞为主的炎症反应存在，以及组织学上偶尔见到小脓肿形成。一般认为中性粒细胞和小脓肿是非特异的异物排斥反应，而异物巨噬细胞是可降解材料组织反应的免疫原性所致。壳聚糖钉周围的明显炎症反应也可能与正电荷密度增高有关，因此有人认为壳聚糖不适合作为体内埋植材料。
2.4 藻酸盐
藻酸盐是从海藻中分离出的一类多糖，是由D-mannuronate和L-guluronate组成的共聚物，在二价离子如钙离子存在时可通过离子交联作用形成开放晶格的水凝胶。藻酸钙水凝胶可塑性好，可预先制成各种形状。其力学强度与钙浓度和藻酸盐浓度均有关。在钙浓度高达500 mmol/L或藻酸盐浓度达4%时，对生物活性物质的渗透扩散仍无阻碍作用。藻酸钙通过酶解作用分解，产物对人体无毒害作用。因此，藻酸盐被用作伤口覆盖材料、药物载体和细胞培养载体等。
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Paige等[26]采用藻酸钙水凝胶复合软骨细胞移植入小鼠皮下，产生新生软骨获得成功。这种藻酸钙水凝胶为细胞提供三维生长空间，与PLA、PGA等聚合物相比，藻酸钙水凝胶具有更好的亲水性，营养物质易于渗透等优点。但藻酸钙仍存在体内难降解、组成成份不稳定、不同成品纯度不一等不足，且植入体内后，随着钙离子的扩散丢失，藻酸钙难以维持其水凝胶样结构。
3 骨组织工程细胞外基质材料的发展方向
3.1 增强材料对成骨细胞的粘附力
细胞与材料的相互作用是组织工程研究的主要领域，其中细胞与材料的粘附是基础，细胞必须与材料发生适当的粘附，才能进行迁移、分化和增殖[27]。因此，新材料的开发和应用必须考虑是否有利于细胞粘附这一重要问题。
正常情况下，细胞与ECM的粘附主要通过特异性受体-整合素(Integrin)与ECM特异配体位点结合。Integrin是由α、β两个亚基组成的跨膜受体，已知有14个α亚基和8个β亚基。成骨细胞表达α1、α2、α3、α4、α5、αv、α6、β1、β3等亚基。α5β1为纤维连接蛋白(fibronectin,FN)受体，识别FN的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)序列[28]；α2β1为Ⅰ型胶原受体，识别Ⅰ型胶原的α1(Ⅰ)链的天冬氨酸-甘氨酸-谷氨酸-丙氨酸(Asp-Gly-Glu-Ala,DGEA)序列[29]。Integrin一方面介导细胞与ECM和细胞-细胞间的粘附；另一方面激活信号传导通路，联系细胞外微环境与细胞内代谢活动，对细胞生长、代谢起重要作用。
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因此，采取预衬或溶剂链接的方法，将FN、胶原或RGD、DGEA等促细胞粘附短肽引入基质材料的表面或整体，将促进细胞粘附、增强生长代谢。Garcia等[30]将FN预衬于生物活性玻璃表面，可显著增强其对成骨细胞的粘附力，并与FN的表面密度呈正相关，成骨细胞的粘附是由FN的RGD位点介导，用FN抗体或与FN竞争的短肽RGD可抑制成骨细胞的粘附。
但FN或胶原除粘附成骨细胞外，对其他多种细胞都有粘附力。骨组织工程用基质材料最好能对种子细胞具有特异性吸附作用，尽量减少非种子细胞的粘附。Dee等[31]发现，赖氨酸-精氨酸-丝氨酸-精氨酸组成的短肽(Lys-Arg-Ser-Arg)可选择性增强硫酸乙酰肝素介导的成骨细胞粘附机制，这种粘附作用不同于Integrin介导的细胞粘附机制，具有成骨细胞特异性粘附作用。用这种短肽包埋的基质材料可显著提高成骨细胞粘附率，减少内皮细胞、成纤维细胞的粘附。是一种良好的骨组织工程基质材料包埋剂。
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对于多种组织组成的复杂器官的组织工程再造，细胞的特异性吸附则更具有应用意义。在基质材料的不同空间引入不同的细胞粘附序列，引导不同组织细胞在特定位置生长，可望再造多组织复杂器官。
3.2 通过材料给予细胞应力刺激
大量研究表明，在多种细胞的体外培养中，机械应力通过培养基质作用于细胞，可明显地调节不同组织细胞的生长和表型表达。组织工程中为了再造功能结构组织(如骨、软骨等)，在新生组织生长过程中通过基质材料给予适当的应力作用是必要的。未经应力刺激的组织工程化肌腱虽然在组织学上与正常肌腱相似，但不具备正常的力学强度[32]。如何通过基质材料给予细胞应力刺激，对基质材料的特性提出了要求。相比之下，凝胶样材料适合于对细胞施加应力，因为细胞完全处于凝胶包围中，凝胶的应变易于对细胞产生应力刺激。
3.3 将控释系统引入基质材料
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众所周知，生长因子和激素都可调节细胞生长和表型表达。因此将药物控释技术引入组织工程，将基质材料负载各种生长因子或激素，向种子细胞定量、持续释放，将有利于细胞的生长和分化。如负载血管内皮生长因子的聚合物基质材料可刺激组织工程化组织的血管再生[33]。当然，要达到理想的生长因子控释还存在很大的困难，近年来随着基因工程技术的发展，有人试图利用转基因技术将生长因子基因转载到成骨细胞内，让其自身表达各种生长因子，增强和调节骨形成。Lieberman等[34]成功地将骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)基因转染骨髓基质细胞，显示出更强的成骨能力。相信将转基因技术应用到组织工程研究必将成为组织工程今后的发展趋势。
综上所述，骨组织工程细胞外基质材料的制备应考虑到无机类材料、合成聚合物材料、天然聚合物材料的优缺点，将三者通过合适的方法组合成复合材料，取长补短，模拟天然骨基质组成成份，并含有最佳组合的生长因子缓释系统，促进成骨细胞的粘附、增殖和分化，发挥最佳成骨能力。
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作者单位：郑磊(第一军医大学附属南方医院创伤骨科 广州，510515)
王前(第一军医大学附属南方医院创伤骨科 广州，510515)
裴国献(第一军医大学附属南方医院创伤骨科 广州，510515)
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摘 要 目的 探讨理想的骨组织工程细胞外基质材料的选择和制备。方法 广泛查阅了近期有关可降解聚合物用作成骨细胞培养支架的文献，总结了各种可降解聚合物在骨组织工程研究中作为细胞外基质材料的优缺点。结果 理想的骨组织工程细胞外基质材料应由无机类材料、人工合成聚合物类材料和天然聚合物类材料组成，并含有最佳的生长因子缓释系统的多孔三维立体泡沫。结论 复合型细胞外基质材料的研制是骨组织工程研究中十分重要而迫切的任务。
关键词：可降解聚合物 骨 组织工程 细胞外基质材料
器官和组织中的细胞，其行为不仅取决于细胞内在的基因序列，还在很大程度上受到外界环境因素的影响，包括细胞与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的相互作用。ECM不仅为细胞生长提供支持和保护，更重要的是细胞与ECM的相互作用调节细胞的形态发生过程，影响细胞生存、迁移、增殖和功能代谢。因此，在组织工程研究中挑选和制备利于种子细胞的粘附、增殖和分化的细胞外基质材料是十分重要和迫切的任务。
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理想的骨组织工程细胞外基质材料的要求有[1、2]：①良好的生物相容性。除满足生物材料的一般要求，如无毒、不致畸性等外，还应利于种子细胞粘附、增殖，降解产物对细胞无毒害作用，不引起炎症反应，甚至利于细胞生长和分化。②良好的生物降解性。基质材料在完成支架作用后应能降解，降解率应与组织细胞生长率相适应，降解时间应能根据组织生长特性作人为调控。③具有三维立体多孔结构。基质材料可加工成三维立体结构，孔隙率最好达90%以上，具有较高的面积体积比。这种结构可提供宽大的表面积和空间，利于细胞粘附生长，细胞外基质沉积，营养和氧气进入，代谢产物排出，也有利于血管和神经长入。④可塑性和一定的机械强度。基质材料具有良好的可塑性，可预先制作成一定形状。并具有一定的机械强度，为新生组织提供支撑，并保持一定时间直至新生组织具有自身生物力学特性。⑤良好的材料-细胞界面。材料应能提供良好的细胞界面，利于细胞粘附、增殖，更重要的是能激活细胞特异基因表达，维持细胞正常表型表达。
目前，可降解聚合物用作骨组织工程细胞外基质材料主要有两类，一类是天然聚合物，如胶原蛋白、纤维蛋白等；另一类为人工合成聚合物，如聚酯类、聚偶磷氮等。天然材料生物相容性好，具有细胞识别信号(如某些氨基酸序列等)，利于细胞粘附、增殖和分化，但也存在许多缺点，如大规模生产的限制、不同批号制成品的差异、材料本身因素控制的困难(如机械强度、降解速度等)。人工合成聚合物则避免了上述困难，材料的微结构、大体形态、机械性能、降解时间等都能预先设计和调控，最后降解完全，避免了长期异物反应的危险。但人工合成材料最大的缺点是缺乏细胞识别信号，与细胞间缺乏生物性相互作用。并且目前人工合成聚合物要达到理想的骨组织工程细胞外基质材料的要求在制作中还存在许多差距。
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1 人工合成可降解聚合物
目前，可用作成骨细胞种植基质材料的聚合物主要有：聚乳酸(polylactic acid,PLA)、聚乙醇酸(polyglycolic acid,PGA)、聚偶磷氮(polyphophazenes)、聚原酸酯(polyorthoester,POE)、聚己内酯(polycaprolactone,PCL)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚酸酐亚胺共聚物[poly (anhydride-co-imides)]、聚羟丁酯(polyhydroxyrate,PHB)及其共聚物等。下面介绍几种生物可降解合成聚合物在骨组织工程中的应用情况。
1.1 聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物
PLA、PGA均属α-聚酯类。PLA有三种异构体(PDLA、PLLA、PDLLA)，在体内降解生成乳酸，是糖的代谢产物；PGA在体内降解为羟基乙酸，易于参加体内代谢。聚合物中酯键易于水解，属非酶性水解。共聚物的降解时间可通过改变两者的比例来调控，约为几周到几年。这类聚合物属热塑性塑料，可通过模塑、挤压、溶剂浇铸等技术加工成各种结构形状。因其降解产物无毒及良好的生物相容性，PLA、PGA已被美国食品与药品管理局(FDA)批准广泛用作医用缝线、暂时性支架和药物控释载体。Vacanti等[3]首先将PGA、PLA用作软骨细胞体外培养基质材料，通过组织工程方法获得新生软骨成功。此后，PLA、PGA及其共聚物被广泛用于组织工程各类组织细胞外的基质材料，如软骨、骨、肌腱、小肠、气管、心瓣膜等，取得了初步成功。
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PLA、PGA及其共聚物在组织工程中应用的主要结构形式有纤维支架、多孔泡沫以及管状结构等。这些结构形式在骨组织工程实验研究中都显示出良好的成骨效应。
Breitbart等[4]将PGA无纺纤维支架制成直径15 mm、厚2 mm的圆盘状，复合体外培养的兔骨膜成骨细胞，植入修复兔颅骨直径为15 mm的全层骨缺损。4周后缺损区有骨岛形成，12周后缺损区大量骨生成，完全修复骨缺损。Ishaug等[5]将大鼠骨髓基质细胞种植于PLGA泡沫，再将复合物移植于大鼠肠系膜观察其成骨能力。组织学检查发现7天后复合物中即可见矿化骨组织，7周后，孔径为150～300 μm的泡沫复合物中矿化骨组织厚度达(370±160) μm。另外，PLA、PGA及其共聚物亦被制成管状结构用于小肠、尿道等管状器官的组织工程细胞外基质材料。
尽管目前PLA、PGA及其共聚物是应用最为广泛的组织工程细胞外基质材料，但在应用过程中发现不少缺点。下面就其不足之处和改善方法作一简单介绍。
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1.1.1 亲水性差，细胞吸附力较弱 以PLA包埋的PGA无纺纤维支架亲水性差、细胞吸附力弱的问题一直困扰着组织工程学家，人们一直在寻找解决这一问题的方法。Mikos等[6]通过乙醇和水两步预湿的方法，有效地对支架进行预湿，增强了亲水性，促进了细胞在支架表面均匀分布，并将有利于体内移植后纤维血管的长入。刘彦春等[7]选择卵磷脂和多聚赖氨酸共同包埋PGA+PLA，也显著提高了支架的亲水性和细胞吸附力。Hubble[8]指出，聚乙醇是一种水溶性、非离子聚合物，可减少生物材料对蛋白的吸附作用。将聚乙醇与聚酯形成共聚物，可提高材料的亲水性，同时也加速了聚合物的降解。
1.1.2 引起无菌性炎症 临床上PLA、PGA的应用过程中发现患者出现非特异性无菌性炎症反应率较高，约为8%[9]。Lam等[10]的实验中提出中分子量降解产物可增加非感染炎性反应，PLA平均分子量低于20 ku(1 Da=0.992 1 u)时，无菌性炎症发生率较高，使用高分子量PLA可延迟但不能消除这一反应。
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目前认为出现无菌性炎症的原因可能与聚合物降解过程中酸性降解产物引起局部pH值下降有关[11]。因此，有学者将碱性物质，如碳酸钙、碳酸氢钠、钙羟基磷灰石引入聚合物中，可代偿聚合物降解引起的pH值下降，有助于防止无菌性炎症的发生[12]。另外，将聚酯-聚乙二醇共聚物作为前体物质合成水凝胶，这种水凝胶中聚酯在聚己二醇末端以低聚体形式存在，含量较低，在体内降解过程中不会引起炎症反应[8]。当然，无菌性炎症的根本解决办法是开发一种降解不释放或缓慢释放酸性降解产物的新型聚合物。
1.1.3 机械强度不足 单纯编织成的PGA无纺纤维支架不具备一定的抗压强度，通过聚合物包埋或热处理虽然可改善其机械强度，但仍然存在抗压强度不足的缺陷。Devin等[13]将羟基磷灰石(hydroxyapatile,HA)与50∶50 PLGA共聚物组成多孔复合基质材料，实验表明复合材料抗压弹性模量随HA成份增加而增加。聚合物降解后，含50%HA的复合材料模量为1 459 MPa，而不含HA的基质材料模量为293 MPa。同时，HA的引入也延缓了聚合物的降解时间。含10%HA的复合材料6周内可完全降解，而含50%HA的复合材料则相对稳定。因此，将钙磷陶瓷引入PLGA共聚物，可改善PLGA的机械性能差、降解速度快、骨结合力弱等缺点。
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1.1.4 其他 PLA、PGA及其共聚物还存在其他一些问题，如聚合物中残留的有机溶剂的细胞毒作用，以及可能引起的纤维化及与周围组织的免疫反应等问题[14]。
1.2 聚丁酸
聚丁酸(polyhydroxybutyrate,PHB)最早由Lemoigne(1964)从细菌中分离出来，随后在诸多细菌，如巨杆菌属、红螺菌属等的胞浆颗粒中均发现有这种聚合物。PHB是由3-羟基丁酸通过酯键链接而成。PHB最早被美国农业食品组织用作动物饲料，后来人们发现PHB具有压电效应，十分适合作为骨折固定材料，但由于单纯PHB易碎、热不稳定、降解时间长、可塑性和机械性能差等缺点限制了它的广泛应用。
将聚羟戊酸(polyhydroxyvalerate,PHV)引入PHB主链，形成PHBV共聚物，由PHB和0～24%PHV组成，可改善PHB的上述缺点。PHBV可在较低的温度下加工塑形，避免了PHB的热降解问题。PHBV通过微生物酶解和水解作用而发生降解，水解作用主要与环境酸碱度有关。Rivard等[15]用PHB/9%HV组成的PHBV共聚物制成三维立体泡沫用作软骨细胞、成骨细胞培养支架，细胞均匀分散在整个聚合物基质中，呈良好的粘附、增殖状态，并在培养21天时细胞生长达最大密度。但PHBV共聚物还存在机械性能差、骨结合力弱等问题。
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1.3 聚偶磷氮
Allcock最早通过聚二氯化偶磷氮与氨基酸酯反应制得含氨基酸酯取代基的聚有机偶磷氮[poly(organo)phosphazenes]。这种聚有机偶磷氮具有良好的生物相容性，降解产物无毒，逐渐被用作药物控释载体。聚有机偶磷氮降解是通过氨基酸酯的水解，生成羧酸，再催化主链的裂解。因此通过调节水解不稳定性的氨基酸酯取代基与主链的化学组成可以实现聚合物降解速度的调控。其完全水解产物对人体基本无毒害作用。
Laurencin等[16]将聚有机偶磷氮用作成骨细胞培养载体，发现取代基为乙基甘氨酸酯的聚有机偶磷氮，不仅有利于细胞的粘附生长，而且可提高聚合物的降解率。在此基础上，通过盐析技术制成具有三维立体结构的聚甲基苯氧基乙基甘氨酸偶磷氮，平均孔径165 μm，分布均匀，孔隙之间相互交通。将成骨细胞种植于其上，培养第1天成骨细胞就从材料表面长入孔隙内，并在21天的培养期中细胞以恒定速度增殖，呈现出良好的生物相容性。但其水解产物对人体可能产生一定毒害作用。
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1.4 聚酸酐
聚酸酐是由羧酸聚合而成。性质活泼，遇水极不稳定。脂肪簇聚酸酐在几天内完全降解，而芳香簇聚酸酐则需几年时间才能降解完全。综合两者的特点，通过调整主链中两种单体的组成比例来调控材料的性能和降解速度。毒理学评价表明，聚酸酐的体内生物相容性非常理想，被广泛用于药物控释体系。
Attawia等[17、18]将酸酐和亚胺聚合成共聚物用作成骨细胞培养载体。其中亚胺成份由苯均四酸亚胺丙氨酸或偏苯三酸亚胺甘氨酸组成。酸酐成份由皮脂酸或1，6-二羧基苯氧乙烷组成。将共聚物制成圆盘状，与成骨细胞株MC3T3-E1共同培养，发现24小时内，酸酐单体在1，6-二羧基苯氧己烷的共聚物培养体系中，细胞粘附良好，形态正常。而单体在皮脂酸的共聚物培养体系中，由于聚合物表面的快速降解，导致细胞不粘附。在此基础上，进一步研究了在共聚物降解产物苯均四酸亚胺丙氨酸和苯均四酸存在的情况下，成骨细胞仍能维持特征性的多角形，在21天的培养期内维持分泌骨钙素的成骨细胞表型。这种亚胺酸酐共聚物对成骨细胞有良好的相容性，不影响表型表达，但其中的亚胺成份可能对细胞生长有影响。
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2 天然高分子聚合物
2.1 胶原
胶原是动物体内含量最丰富的蛋白，约占人体蛋白总量的30%以上，其中以ECM中胶原蛋白含量最高。胶原蛋白在体内以胶原纤维的形式存在，其基本组成单位是原胶原分子，原胶原蛋白分子经多级聚合形成胶原纤维。胶原纤维与细胞外基质中其他成份形成结构与功能的复合体。胶原主要分五类，骨组织中为Ⅰ型胶原。胶原不仅为细胞提供支持保护作用，而且与细胞的粘附、生长、表型表达均有密切关系。
Ⅰ型胶原通过成骨细胞表面特异性受体β1整合素亚单位与成骨细胞紧密结合。Basle等[19]研究发现成骨细胞系Saos-2在异种骨基质中沿胶原纤维束粘附延展，用免疫组织化学技术观察到胶原纤维表面通过β1整合素亚单位与细胞外表面紧密结合，当抗β1整合素亚单位抗体存在时，细胞堆积，无定向延展。另有研究表明Ⅰ型胶原与成骨细胞复合可提高成骨细胞的成骨能力，刺激多潜能间充质细胞向成骨细胞方向转化，并促进细胞表达碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Ⅰ型胶原及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)[20]。Green等[21]研究证实Ⅰ型胶原是通过增强成骨细胞的蛋白激酶C活性，增强成骨细胞合成蛋白能力，同时该酶还可活化Na+/H+交换系统，提高细胞质中的pH值，促进成骨细胞增殖。
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由于Ⅰ型胶原能促进成骨细胞粘附、增殖和分化，增强其成骨能力。Mizuno等[22]将Ⅰ型胶原用作骨髓基质细胞的培养基质，发现骨髓基质细胞可定向分化为成骨细胞，最终形成含骨髓成份的新生骨组织，成骨过程中无软骨生成，而Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ型胶原上则未见新骨生成。
Ⅰ型胶原由于含特定的细胞识别信号(如某些氨基酸序列)，利于成骨细胞粘附、增殖和分化，但其最大的缺点是缺乏一定的机械强度，难以单独用作成骨细胞培养基质材料，可作为良好的材料包埋和添加剂。另外，还存在生理学性质不稳定和外来胶原引起的免疫反应等问题。
2.2 纤维蛋白
纤维蛋白单体在凝血酶作用下可聚合成立体网状结构的纤维蛋白凝胶。聚合后的纤维蛋白凝胶可通过释放β转化因子和血小板衍生生长因子等来促进细胞粘附、增殖并分泌基质，具有良好的生物相容性。另外，纤维蛋白凝胶可塑性强，通过降低凝血酶浓度的方法可延缓纤维蛋白聚合过程，为凝胶的塑形提供充分的时间。这种纤维蛋白凝胶来源于自身血液，避免了免疫原性问题，是较理想的细胞外基质材料。Sims等[14]首次报道了用纤维蛋白凝胶复合软骨细胞植入无胸腺小鼠皮下，12周后新生软骨组织为透明软骨，氨基葡聚糖与软骨湿重比接近正常软骨。
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但是纤维蛋白凝胶也存在天然材料的共同缺点，如缺乏机械强度、大量获取困难、降解时间难以控制等，故也难以单独作为组织工程中成骨细胞种植基质材料。
2.3 甲壳素及其衍生物
甲壳素，亦称甲壳质、几丁质，是自然界中仅次于纤维素的天然多糖，广泛存在于昆虫、甲壳类动物外壳及真菌细胞壁中。经脱乙酰化反应变成甲壳胺，即壳聚糖。甲壳素一般不溶于水、碱和常规有机溶剂中。只溶于盐酸等无机酸及甲醇、乙醇等。高度脱乙酰化甲壳胺可溶于水。甲壳胺分子中有许多胺基和羟基，容易进行化学修饰和改性。这类天然多糖具有明显碱性、良好的生物相容性和生物可降解性。壳聚糖在体内溶菌酶、甲壳酶的作用下水解成低聚糖。由于壳聚糖的体内降解属于酶解作用，故难于对它的降解速度进行人为调控。降解产物为对人体无毒的N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖。降解过程中产生的低分子量甲壳素(胺)或其寡聚糖在体内不积累，无免疫原性。
Klokkevold等[23]研究了壳聚糖对体外成骨细胞分化和骨形成的影响。他们取胎鼠颅盖骨间充质细胞按3.5×105个/ml的细胞浓度种植于培养皿中，加入200 ml浓度为2 mg/ml的壳聚糖乙酸溶液共同培养14天，发现其成骨细胞克隆形成率为(6.2±1.2)个/皿，明显高于未加壳聚糖的对照组颗粒形成率(3.6±0.6)个/培养皿，新生骨组织的平均面积亦明显高于对照组。使用结果表明，壳聚糖具有促进前成骨细胞分化，加速骨形成的作用。倪斌等[24]用壳聚糖膜包绕骨缺损断端，认为它对骨膜下骨痂的生长能起导向作用。
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壳聚糖的生物相容性一般认为是良好的，但这些评价大都是将壳聚糖制成膜材料、线材料和药物载体的研究观察到的。当材料的几何形状变化时，通过蛋白质和细胞在其表面触发反应，可能损害与它接触的细胞和组织。张建湘等[25]发现在壳聚糖钉周围的炎症反应较明显，表现在钉周围始终有以淋巴细胞、中性粒细胞和异物巨噬细胞为主的炎症反应存在，以及组织学上偶尔见到小脓肿形成。一般认为中性粒细胞和小脓肿是非特异的异物排斥反应，而异物巨噬细胞是可降解材料组织反应的免疫原性所致。壳聚糖钉周围的明显炎症反应也可能与正电荷密度增高有关，因此有人认为壳聚糖不适合作为体内埋植材料。
2.4 藻酸盐
藻酸盐是从海藻中分离出的一类多糖，是由D-mannuronate和L-guluronate组成的共聚物，在二价离子如钙离子存在时可通过离子交联作用形成开放晶格的水凝胶。藻酸钙水凝胶可塑性好，可预先制成各种形状。其力学强度与钙浓度和藻酸盐浓度均有关。在钙浓度高达500 mmol/L或藻酸盐浓度达4%时，对生物活性物质的渗透扩散仍无阻碍作用。藻酸钙通过酶解作用分解，产物对人体无毒害作用。因此，藻酸盐被用作伤口覆盖材料、药物载体和细胞培养载体等。
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Paige等[26]采用藻酸钙水凝胶复合软骨细胞移植入小鼠皮下，产生新生软骨获得成功。这种藻酸钙水凝胶为细胞提供三维生长空间，与PLA、PGA等聚合物相比，藻酸钙水凝胶具有更好的亲水性，营养物质易于渗透等优点。但藻酸钙仍存在体内难降解、组成成份不稳定、不同成品纯度不一等不足，且植入体内后，随着钙离子的扩散丢失，藻酸钙难以维持其水凝胶样结构。
3 骨组织工程细胞外基质材料的发展方向
3.1 增强材料对成骨细胞的粘附力
细胞与材料的相互作用是组织工程研究的主要领域，其中细胞与材料的粘附是基础，细胞必须与材料发生适当的粘附，才能进行迁移、分化和增殖[27]。因此，新材料的开发和应用必须考虑是否有利于细胞粘附这一重要问题。
正常情况下，细胞与ECM的粘附主要通过特异性受体-整合素(Integrin)与ECM特异配体位点结合。Integrin是由α、β两个亚基组成的跨膜受体，已知有14个α亚基和8个β亚基。成骨细胞表达α1、α2、α3、α4、α5、αv、α6、β1、β3等亚基。α5β1为纤维连接蛋白(fibronectin,FN)受体，识别FN的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)序列[28]；α2β1为Ⅰ型胶原受体，识别Ⅰ型胶原的α1(Ⅰ)链的天冬氨酸-甘氨酸-谷氨酸-丙氨酸(Asp-Gly-Glu-Ala,DGEA)序列[29]。Integrin一方面介导细胞与ECM和细胞-细胞间的粘附；另一方面激活信号传导通路，联系细胞外微环境与细胞内代谢活动，对细胞生长、代谢起重要作用。
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因此，采取预衬或溶剂链接的方法，将FN、胶原或RGD、DGEA等促细胞粘附短肽引入基质材料的表面或整体，将促进细胞粘附、增强生长代谢。Garcia等[30]将FN预衬于生物活性玻璃表面，可显著增强其对成骨细胞的粘附力，并与FN的表面密度呈正相关，成骨细胞的粘附是由FN的RGD位点介导，用FN抗体或与FN竞争的短肽RGD可抑制成骨细胞的粘附。
但FN或胶原除粘附成骨细胞外，对其他多种细胞都有粘附力。骨组织工程用基质材料最好能对种子细胞具有特异性吸附作用，尽量减少非种子细胞的粘附。Dee等[31]发现，赖氨酸-精氨酸-丝氨酸-精氨酸组成的短肽(Lys-Arg-Ser-Arg)可选择性增强硫酸乙酰肝素介导的成骨细胞粘附机制，这种粘附作用不同于Integrin介导的细胞粘附机制，具有成骨细胞特异性粘附作用。用这种短肽包埋的基质材料可显著提高成骨细胞粘附率，减少内皮细胞、成纤维细胞的粘附。是一种良好的骨组织工程基质材料包埋剂。
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对于多种组织组成的复杂器官的组织工程再造，细胞的特异性吸附则更具有应用意义。在基质材料的不同空间引入不同的细胞粘附序列，引导不同组织细胞在特定位置生长，可望再造多组织复杂器官。
3.2 通过材料给予细胞应力刺激
大量研究表明，在多种细胞的体外培养中，机械应力通过培养基质作用于细胞，可明显地调节不同组织细胞的生长和表型表达。组织工程中为了再造功能结构组织(如骨、软骨等)，在新生组织生长过程中通过基质材料给予适当的应力作用是必要的。未经应力刺激的组织工程化肌腱虽然在组织学上与正常肌腱相似，但不具备正常的力学强度[32]。如何通过基质材料给予细胞应力刺激，对基质材料的特性提出了要求。相比之下，凝胶样材料适合于对细胞施加应力，因为细胞完全处于凝胶包围中，凝胶的应变易于对细胞产生应力刺激。
3.3 将控释系统引入基质材料
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众所周知，生长因子和激素都可调节细胞生长和表型表达。因此将药物控释技术引入组织工程，将基质材料负载各种生长因子或激素，向种子细胞定量、持续释放，将有利于细胞的生长和分化。如负载血管内皮生长因子的聚合物基质材料可刺激组织工程化组织的血管再生[33]。当然，要达到理想的生长因子控释还存在很大的困难，近年来随着基因工程技术的发展，有人试图利用转基因技术将生长因子基因转载到成骨细胞内，让其自身表达各种生长因子，增强和调节骨形成。Lieberman等[34]成功地将骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)基因转染骨髓基质细胞，显示出更强的成骨能力。相信将转基因技术应用到组织工程研究必将成为组织工程今后的发展趋势。
综上所述，骨组织工程细胞外基质材料的制备应考虑到无机类材料、合成聚合物材料、天然聚合物材料的优缺点，将三者通过合适的方法组合成复合材料，取长补短，模拟天然骨基质组成成份，并含有最佳组合的生长因子缓释系统，促进成骨细胞的粘附、增殖和分化，发挥最佳成骨能力。
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作者单位：郑磊(第一军医大学附属南方医院创伤骨科 广州，510515)
王前(第一军医大学附属南方医院创伤骨科 广州，510515)
裴国献(第一军医大学附属南方医院创伤骨科 广州，510515)
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