用微板核酸杂交-ELISA技术检测皖北地区不同人群TTV感染情况
作者：赵守松 高春明 田维铨
单位：233004 蚌埠医学院附属医院传染病科
关键词：核酸杂交；酶联免疫吸附测定；肝炎病毒；基因型；TT病毒
实用医学杂志000909 摘 要 目的：用微板核酸杂交-ELISA技术检测皖北地区不同人群TTV感染情况。方法：用PCR法将患者血清标本中的TTV DNA扩增后，与两条特异性探针夹心杂交，通过酶联显色检测血清标本中的TTV DNA，进行分型并与套式PCR方法比较。结果：TTV在学生、血透患者、肝病患者中的阳性率分别为3.3%，16.7%和13.5%，前者与后两者比较差异均有显著意义(P<0.05)；14例非甲-非戊(NA-NE)肝炎的TTV阳性率为14.3%。本地区流行的TTV可分为两个主要的基因型，即Ⅰ型(66.7%)、Ⅱ型(25%)，并存在混合感染(8.3%)。微板核酸杂交-ELISA与套式PCR方法的相符率为98.1%(205/209)。结论：本地区一般人群、血透和肝病患者中存在TTV感染，后两者为感染的高危人群，TTV的基因型以Ⅰ型为主。TTV不是本地NA-NE肝炎的主要病因。微板核酸杂交-ELISA技术具有灵敏性高、操作简单、易自动化的特点。
, 百拇医药
我们分别采用套式PCR和微板核酸杂交-ELISA技术检测了安徽皖北地区不同人群血清中的DNA，并采用分型探针进行基因分型，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象 60名肝功正常，HBV，HCV阴性学生血清标本来自本院97级大学生，60例血透标本来自本院和阜阳地区二院血透室；89例肝病患者(50例慢性乙型肝炎、25例乙型肝炎后肝硬化及14例NA-NE肝炎)的血清标本来自1998年12月～1999年12月本院及蚌埠铁路医院传染病科住院患者。
1.2 试剂和仪器 PCR仪为上海复华公司产品，550型酶标仪为BIO-RAD公司产品，生物素、底物、Taq酶、dNTP及Fico11 400链亲和素-辣根过氧化氢酶分别购自华美公司和华粤公司。微板核酸杂交-ELISA试剂盒由第一军医大学生物诊断中心提供。
1.3 杂交液主要配方 20×SSC(3 mol/L NaCl，0.3 mol/L柠檬酸三钠)、硫酸葡聚糖、PGE、去离子甲酰胺、SDS等；杂交洗液：1×SSC；封闭剂：0.5%Fico11 400，0.5%HS-DNA，0.5%PVP，0.5%BSA。
, 百拇医药
1.4 方法
1.4.1 引物及探针的设计与合成 按照Okamoto等[4]发表的基因序列，选取TTV ORF1的保守序列作内引物；包被探针选择Ⅰ型和Ⅱ型同源性极高的序列nt2464-nt2520，显色探针Ⅰ和Ⅱ则选择一段异源性大于50%的序列，并在显色探针的5'端标上生物素，见表1。引物和探针由上海生工公司合成。
表1 引物及探针序列和基因位置
序列5'～3'
基因位置
外引物1
GGCAACATGTTATGGATAGACTGG
1915～1938
, 百拇医药
外引物2
GGAGTGGTACACCTCGGTGTC
2607～2587
内引物1
CTACCTCTATGGGCAGCAGCATAT
1996～2019
内引物2
CAGTAGTTGTTGGTTGTTGTTGCA
2551～2528
包被探针
GGAACTCACATTCCATACCTGGGACTTC
, 百拇医药
2464～2520
AGACGTGGCCTCTTTGGCCCGAAAGCTAT
显色探针
2125～2159
Ⅰ型
ACAGACCCCACAAAAGGCTTTGTTCCTTACTCTTT
Ⅱ型
AACAACAGCCTTAGGGGATACGTACCCTACAGCAT
1.4.2 探针包被与封闭 在37℃下，用碳酸盐缓冲液(pH 9.6)在微板孔上包被14 h。用封闭剂封闭微板孔非特异性结合部位。
, 百拇医药
1.4.3 基因扩增 取处理液50μl于0.5 ml离心管内，加待测血清50μl，100℃煮沸15 min，12 000 r/min离心5 min。取上清液4μl加入含有外引物，dNTP,Taq酶等的反应液内，弹匀，上机，预变性94℃ 2 min。循环条件：94℃ 50 s，53℃ 50 s，72℃ 60 s，共循环35次，最后72℃延伸3 min。再取其扩增产物3μl加入含有内引物反应液内，弹匀，上机，预变性94℃ 2 min。循环条件：94℃ 50 s，55℃ 50 s，72℃ 60 s，共循环35次，最后72℃延伸3 min。取最后扩增产物变性：94℃ 10 min，冰浴10 min。
1.5 微板夹心杂交与显色 取变性产物25μl，杂交液90μl，150 nmol显色探针Ⅰ或Ⅱ型于反应孔内(每份样品分别加入显色探针Ⅰ型和Ⅱ型各1孔)，轻轻摇匀，52℃杂交90 min，甩净。于每孔中加入杂交洗液200μl，置室温3～5 min，甩净，再重复两次。然后在每孔中加入链亲和素-辣根过氧化氢酶100μl，37℃ 30 min，甩净，每孔加入洗液200μl，置室温5～10 min，再重复两次。每孔加入底物TMB 1滴，置室温10 min后，加入2M硫酸溶液2滴，终止反应，并在酶标450 nm处读数。阴性对照OD值范围为0.155～0.195，OD值达到0.350以上即可判断为阳性。
, 百拇医药
1.6 套式PCR方法 见参考文献[3]。
2 结果
2.1 不同人群中TTV的检出率 60名大学生中2例(3.3%)阳性，60例血透患者中10例(16.7%)阳性，89例肝病患者中12例(13.5%)阳性，大学生组与肝病及血透组相比，χ21=4.34，χ22=5.93，均P<0.05。其中肝病组50例慢性乙型肝炎有6例(12.0%)阳性，25例肝硬化中4例(16.0%)阳性，14例不明原因肝炎中2例(14.3%)阳性。
2.2 基因分型 本地区TTV可以分为两个基因型，不同人群中TTV基因型分布见表2，其中，66.7%(16/24)基因型为Ⅰ型，25%(6/24)的基因型为Ⅱ型，8.3%(2/24)的基因型为混合型。
表2 不同人群中TTV基因型分布情况(例) 基因型
, 百拇医药
学
生
血透
患者
慢性
乙肝
肝
硬化
NA-NE
肝炎
合计
Ⅰ型
2
6
, 百拇医药
3
3
2
16
Ⅱ型
0
3
2
1
0
6
混合型
0
1
, 百拇医药
1
0
0
2
2.3 微板核酸杂交-ELISA技术与套式PCR方法比较 209例血清标本中两法皆TTA阳性为20例；微板核酸杂交-ELISA法TTV阳性为11.5%(24/209)，套式PCR方法TTV阳性为13.9%(29/209)，两种方法符合率为98.1%(205/209)。
3 讨论
核酸杂交技术特异性强、PCR技术灵敏度高、ELISA方法信号判断方便。微板核酸杂交-ELISA技术正是这三种技术的有机结合[5]，它首先通过PCR将待测核酸扩增，然后与两条探针(捕捉探针和显色探针)同时杂交，最后通过酶联显色进行定性检测和分型，能有效地避免PCR扩增造成的假阳性。本组结果显示，微板核酸杂交-ELISA法和套式PCR法的符合率为98.1%，表明微板核酸杂交-ELISA技术进行TTV检测，具有特异性强，灵敏性高，操作简单方便，有利于自动化操作等特点。
, 百拇医药
我们采用微板核酸杂交-ELISA技术，选择ORF1的保守序列作内外引物，Ⅰ型和Ⅱ型同源性高的序列作包被探针检测TTV DNA，在Ⅰ型和Ⅱ型核苷酸序列中，选择一段异源性大于50%的序列作Ⅰ型、Ⅱ型显色探针进行基因分型，该方法比酶切分型及基因测序分型更为简单方便。探针分型结果表明，本地区的TTV DNA可以分两个主要的基因型，以Ⅰ型为主(66.7%)，其次为Ⅱ型(25%)，并存在不同基因型的混合感染(8.3%)。Okamoto等[6]也证实，TTV的不同基因型混合感染是常见的。
本组正常人群、血透患者及肝病患者TTV DNA的阳性率分别为3.3%，13.5%和16.7%，表明在本省皖北地区的正常人群、血透患者及肝病患者中存在TTV的感染。血透患者、肝病患者的TTV感染率显著高于大学生组(P<0.05)，提示TTV可能主要经血液途径传播，与HBV有类似的传播途径并常重叠感染；血透患者、慢性乙型肝炎和肝硬化是TTV感染的高危人群。TTV在NA-NE肝炎患者中检出，说明TTV与HDV不同，可不依赖其它病毒而存在。NA-NE肝炎患者中TTV的检出率为14.3%(2/14)，显著低于国内外的其它报道[3，4]，说明TTV不是本地区不明原因肝炎的主要病因。
, http://www.100md.com
本课题为安徽省教委自然科学基金资助项目(编号：99 J 10147)
参考文献
1，Nishizawa T,Okamoto H,Konishi K,et al. A novel DNA virus(TTV)associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Biochem Biophys Res Commun,1997,241(1):92～97.
2，Abe K,Inami T,Asano K，et al. TT virus infection is widespread in the general populations from different geographic regions. J Clin Microbiol,1999,37(8):2703～2705.
, http://www.100md.com
3，周伯平，马为民，王火生，等. 深圳地区不同人群TTV感染情况的调查. 中华实验和临床病毒学杂志，1998，12(3)：241～243.
4，Okamoto H,Nishizawa T,Kato N,et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus(TTV)associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Hepatology Research,1998,10(1):1～16.
5，王 虹，王省良，万成松，等. 微板核酸杂交-ELISA方法对肝炎病人血清中HBV DNA的定量检测与分析. 第一军医大学学报，1999，19(4)：354～356.
6，Okamoto H,Takahashi M,Nishizawa T,et al. Marked genomic heterogeneity and frequent mixed infection of TT virus demonstrated by PCR with primers from coding and noncoding regions. Virology. 1999,259(2):428～436.
(修回日期：2000-05-28), 百拇医药
单位：233004 蚌埠医学院附属医院传染病科
关键词：核酸杂交；酶联免疫吸附测定；肝炎病毒；基因型；TT病毒
实用医学杂志000909 摘 要 目的：用微板核酸杂交-ELISA技术检测皖北地区不同人群TTV感染情况。方法：用PCR法将患者血清标本中的TTV DNA扩增后，与两条特异性探针夹心杂交，通过酶联显色检测血清标本中的TTV DNA，进行分型并与套式PCR方法比较。结果：TTV在学生、血透患者、肝病患者中的阳性率分别为3.3%，16.7%和13.5%，前者与后两者比较差异均有显著意义(P<0.05)；14例非甲-非戊(NA-NE)肝炎的TTV阳性率为14.3%。本地区流行的TTV可分为两个主要的基因型，即Ⅰ型(66.7%)、Ⅱ型(25%)，并存在混合感染(8.3%)。微板核酸杂交-ELISA与套式PCR方法的相符率为98.1%(205/209)。结论：本地区一般人群、血透和肝病患者中存在TTV感染，后两者为感染的高危人群，TTV的基因型以Ⅰ型为主。TTV不是本地NA-NE肝炎的主要病因。微板核酸杂交-ELISA技术具有灵敏性高、操作简单、易自动化的特点。
, 百拇医药
我们分别采用套式PCR和微板核酸杂交-ELISA技术检测了安徽皖北地区不同人群血清中的DNA，并采用分型探针进行基因分型，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象 60名肝功正常，HBV，HCV阴性学生血清标本来自本院97级大学生，60例血透标本来自本院和阜阳地区二院血透室；89例肝病患者(50例慢性乙型肝炎、25例乙型肝炎后肝硬化及14例NA-NE肝炎)的血清标本来自1998年12月～1999年12月本院及蚌埠铁路医院传染病科住院患者。
1.2 试剂和仪器 PCR仪为上海复华公司产品，550型酶标仪为BIO-RAD公司产品，生物素、底物、Taq酶、dNTP及Fico11 400链亲和素-辣根过氧化氢酶分别购自华美公司和华粤公司。微板核酸杂交-ELISA试剂盒由第一军医大学生物诊断中心提供。
1.3 杂交液主要配方 20×SSC(3 mol/L NaCl，0.3 mol/L柠檬酸三钠)、硫酸葡聚糖、PGE、去离子甲酰胺、SDS等；杂交洗液：1×SSC；封闭剂：0.5%Fico11 400，0.5%HS-DNA，0.5%PVP，0.5%BSA。
, 百拇医药
1.4 方法
1.4.1 引物及探针的设计与合成 按照Okamoto等[4]发表的基因序列，选取TTV ORF1的保守序列作内引物；包被探针选择Ⅰ型和Ⅱ型同源性极高的序列nt2464-nt2520，显色探针Ⅰ和Ⅱ则选择一段异源性大于50%的序列，并在显色探针的5'端标上生物素，见表1。引物和探针由上海生工公司合成。
表1 引物及探针序列和基因位置
序列5'～3'
基因位置
外引物1
GGCAACATGTTATGGATAGACTGG
1915～1938
, 百拇医药
外引物2
GGAGTGGTACACCTCGGTGTC
2607～2587
内引物1
CTACCTCTATGGGCAGCAGCATAT
1996～2019
内引物2
CAGTAGTTGTTGGTTGTTGTTGCA
2551～2528
包被探针
GGAACTCACATTCCATACCTGGGACTTC
, 百拇医药
2464～2520
AGACGTGGCCTCTTTGGCCCGAAAGCTAT
显色探针
2125～2159
Ⅰ型
ACAGACCCCACAAAAGGCTTTGTTCCTTACTCTTT
Ⅱ型
AACAACAGCCTTAGGGGATACGTACCCTACAGCAT
1.4.2 探针包被与封闭 在37℃下，用碳酸盐缓冲液(pH 9.6)在微板孔上包被14 h。用封闭剂封闭微板孔非特异性结合部位。
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1.4.3 基因扩增 取处理液50μl于0.5 ml离心管内，加待测血清50μl，100℃煮沸15 min，12 000 r/min离心5 min。取上清液4μl加入含有外引物，dNTP,Taq酶等的反应液内，弹匀，上机，预变性94℃ 2 min。循环条件：94℃ 50 s，53℃ 50 s，72℃ 60 s，共循环35次，最后72℃延伸3 min。再取其扩增产物3μl加入含有内引物反应液内，弹匀，上机，预变性94℃ 2 min。循环条件：94℃ 50 s，55℃ 50 s，72℃ 60 s，共循环35次，最后72℃延伸3 min。取最后扩增产物变性：94℃ 10 min，冰浴10 min。
1.5 微板夹心杂交与显色 取变性产物25μl，杂交液90μl，150 nmol显色探针Ⅰ或Ⅱ型于反应孔内(每份样品分别加入显色探针Ⅰ型和Ⅱ型各1孔)，轻轻摇匀，52℃杂交90 min，甩净。于每孔中加入杂交洗液200μl，置室温3～5 min，甩净，再重复两次。然后在每孔中加入链亲和素-辣根过氧化氢酶100μl，37℃ 30 min，甩净，每孔加入洗液200μl，置室温5～10 min，再重复两次。每孔加入底物TMB 1滴，置室温10 min后，加入2M硫酸溶液2滴，终止反应，并在酶标450 nm处读数。阴性对照OD值范围为0.155～0.195，OD值达到0.350以上即可判断为阳性。
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1.6 套式PCR方法 见参考文献[3]。
2 结果
2.1 不同人群中TTV的检出率 60名大学生中2例(3.3%)阳性，60例血透患者中10例(16.7%)阳性，89例肝病患者中12例(13.5%)阳性，大学生组与肝病及血透组相比，χ21=4.34，χ22=5.93，均P<0.05。其中肝病组50例慢性乙型肝炎有6例(12.0%)阳性，25例肝硬化中4例(16.0%)阳性，14例不明原因肝炎中2例(14.3%)阳性。
2.2 基因分型 本地区TTV可以分为两个基因型，不同人群中TTV基因型分布见表2，其中，66.7%(16/24)基因型为Ⅰ型，25%(6/24)的基因型为Ⅱ型，8.3%(2/24)的基因型为混合型。
表2 不同人群中TTV基因型分布情况(例) 基因型
, 百拇医药
学
生
血透
患者
慢性
乙肝
肝
硬化
NA-NE
肝炎
合计
Ⅰ型
2
6
, 百拇医药
3
3
2
16
Ⅱ型
0
3
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1
0
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混合型
0
1
, 百拇医药
1
0
0
2
2.3 微板核酸杂交-ELISA技术与套式PCR方法比较 209例血清标本中两法皆TTA阳性为20例；微板核酸杂交-ELISA法TTV阳性为11.5%(24/209)，套式PCR方法TTV阳性为13.9%(29/209)，两种方法符合率为98.1%(205/209)。
3 讨论
核酸杂交技术特异性强、PCR技术灵敏度高、ELISA方法信号判断方便。微板核酸杂交-ELISA技术正是这三种技术的有机结合[5]，它首先通过PCR将待测核酸扩增，然后与两条探针(捕捉探针和显色探针)同时杂交，最后通过酶联显色进行定性检测和分型，能有效地避免PCR扩增造成的假阳性。本组结果显示，微板核酸杂交-ELISA法和套式PCR法的符合率为98.1%，表明微板核酸杂交-ELISA技术进行TTV检测，具有特异性强，灵敏性高，操作简单方便，有利于自动化操作等特点。
, 百拇医药
我们采用微板核酸杂交-ELISA技术，选择ORF1的保守序列作内外引物，Ⅰ型和Ⅱ型同源性高的序列作包被探针检测TTV DNA，在Ⅰ型和Ⅱ型核苷酸序列中，选择一段异源性大于50%的序列作Ⅰ型、Ⅱ型显色探针进行基因分型，该方法比酶切分型及基因测序分型更为简单方便。探针分型结果表明，本地区的TTV DNA可以分两个主要的基因型，以Ⅰ型为主(66.7%)，其次为Ⅱ型(25%)，并存在不同基因型的混合感染(8.3%)。Okamoto等[6]也证实，TTV的不同基因型混合感染是常见的。
本组正常人群、血透患者及肝病患者TTV DNA的阳性率分别为3.3%，13.5%和16.7%，表明在本省皖北地区的正常人群、血透患者及肝病患者中存在TTV的感染。血透患者、肝病患者的TTV感染率显著高于大学生组(P<0.05)，提示TTV可能主要经血液途径传播，与HBV有类似的传播途径并常重叠感染；血透患者、慢性乙型肝炎和肝硬化是TTV感染的高危人群。TTV在NA-NE肝炎患者中检出，说明TTV与HDV不同，可不依赖其它病毒而存在。NA-NE肝炎患者中TTV的检出率为14.3%(2/14)，显著低于国内外的其它报道[3，4]，说明TTV不是本地区不明原因肝炎的主要病因。
, http://www.100md.com
本课题为安徽省教委自然科学基金资助项目(编号：99 J 10147)
参考文献
1，Nishizawa T,Okamoto H,Konishi K,et al. A novel DNA virus(TTV)associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Biochem Biophys Res Commun,1997,241(1):92～97.
2，Abe K,Inami T,Asano K，et al. TT virus infection is widespread in the general populations from different geographic regions. J Clin Microbiol,1999,37(8):2703～2705.
, http://www.100md.com
3，周伯平，马为民，王火生，等. 深圳地区不同人群TTV感染情况的调查. 中华实验和临床病毒学杂志，1998，12(3)：241～243.
4，Okamoto H,Nishizawa T,Kato N,et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus(TTV)associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Hepatology Research,1998,10(1):1～16.
5，王 虹，王省良，万成松，等. 微板核酸杂交-ELISA方法对肝炎病人血清中HBV DNA的定量检测与分析. 第一军医大学学报，1999，19(4)：354～356.
6，Okamoto H,Takahashi M,Nishizawa T,et al. Marked genomic heterogeneity and frequent mixed infection of TT virus demonstrated by PCR with primers from coding and noncoding regions. Virology. 1999,259(2):428～436.
(修回日期：2000-05-28), 百拇医药