雷公藤多甙对链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠血浆氧自由基与T细胞的影响
作者：钱书虹 王诗瑾 钱庆文 董义光
单位：钱书虹 王诗瑾(河南医科大学一附院检验中心 450052)；钱庆文(重庆医科大学)；董义光(河南医科大学一附院内分泌科)
关键词：雷公藤多甙；迟发性糖尿病；黄嘌呤氧化酶
中国现代医学杂志000909 为了解雷公藤多甙对Ⅰ型糖尿病氧自由基和T细胞的影响以及他们的关 系，以链脲佐菌素(STZ)诱导的迟发性糖尿病大鼠为研究对象，于发病第2天用T11灌胃后， 连续测定外周血中T细胞亚群CD+2、CD+4、CD+8、黄嘌呤氧化酶(XOD)、超 氧化物歧化酶(SOD)、过氧化酶(CAT)和丙二醛(MDA)等的水平。结果显示，糖尿病大鼠(DM) 血 清XOD、MDA与CD+4水平明显高于对照组；SOD、CAT和CD+8水平明显降低。服用T1 1后，上述指标于6～8周分别恢复正常。DM大鼠经T11治疗后，外周血CD+4、CD+8 T细胞亚群与12项有关自由基的指标变化规律类似，说明大鼠发病时氧自由基的产生与T细胞 亚群的异 常分化有着密切的关系；T11不仅能抑制T细胞亚群的异常分化且可使氧自由基恢复正常。
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分类号 R58
INFLUENCE OF PLASMA FREE OXYGEN RADICALS AND TCELLS OF STREPTOZOTOCIN-INDUCED LATELY-ONSET DIABETIC RATS BYTRIPTERGIITOTORUM
Qian Shuhong Qian Qingwen Dong Yuguang Wang Shijin
(Henan Center of Clinic Laboratory,the First Affiliated Hospital, Henan Medical University, Zhengzhou 450052)
[Abstract]Objective: To study the change of oxygen radical s and T cells of stre ptozotocin-induced lately-onset diabetic rats by treatment with triptegiitotorum (TII). Methods: After diabetic rats were fed with TII, its bloo d was collected at second day. Levels of T cells subsets in blood and serum xanthine oxidase (XO D), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), malondialdehyde (MDA) were seria lly determined. Results: The levels of XOD, MDA and CD4+ T c ells were markedly h igher than those of control. SOD, CAT and CD8+ T cells were signigicantly lo wer that those of control, and all of which became normal in 6～8 weeks by TII. So t h ere was closed relative between free oxygen radicals and T cells subsets at the onset of diabetic rats. Conclusions: TII not only inhibited the disorder of T cells subsets but also regulated diabetic free oxygen radicals.
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Key words:Triptegiitotorum; Lately-onset Diabetes; Xanthine O xidas
本文以STZ诱导的迟发性糖尿病大鼠为模型，通过测定服用T11前后糖 尿病大鼠外周血T细胞亚群和XOD等表示氧自由基代谢的几项指标，研究：T细胞亚群与氧自 由基的关系；T11对这些指标的影响与意义。
1 材料与方法
1.1 材料
STZ(Sigma公司)，雷公藤多甙(湖南株州制药三厂)，还原性辅酶(Bcehrieger Gm6H)，氯化 硝基四氮唑蓝和酚嗪二甲酯硫酸(上海前进试剂公司)，SOD和MDA试剂盒(南京建成生物工程 研 究所)，碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶免疫组化试剂盒(中国军事科学院)。T细胞亚群单克隆抗 体(MR-OX-34，CD+2单抗；V3/25，CD+4单抗；MRC OX-8，CD+8单抗 ， 均由牛津大学，J.Pukavec教授馈赠)；果糖胺试剂盒(东瓯生物工程公司)，动物：Wistar大 鼠，体重(200±209)g(河南省实验动物中心)。
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1.2 方法
1.2.1 动物模型与分组 Wistar大鼠21只：DM组7只，本组为迟发型糖尿病，标本模型的制作参照Wight JR等法 [1]，制作过程中每天测定尿糖1次，每周测定血糖2次。成模后继续按此测定。糖尿病 确诊按Like AA标准[2]；T11治疗组(D+T11)7只，DM大鼠成模后2天开始用T11 10m g/kg体重灌胃；对照组7只。DM组和对照组用盐水灌胃。
1.2.2 方法 标本采取：选用尾静脉血，一部分血液用肝素(50iu/ml)抗凝 ，此部分血液用于T细胞亚群测定。另部分静脉血于凝固后分离血清，测定XOD、SOD、CAT和 MDA。实验方法：T细胞亚群采用免疫组化法[3]；XOD为酚嗪二甲酯硫酸与氯化硝 基四氮唑蓝法[4]；其他试验按说明书操作。
1.3 统计分析
, 百拇医药
测定数据用均值±标准差和t检验统计处理。
2 结果
2.1 T11对T细胞亚群的影响
DM大鼠经T11治疗后，3组大鼠外周血中CD+2T细胞亚群的变化相互间无显著性差异。CD +4T细胞亚群于第6周和对照组无显著差异(P>0.05，图1)。CD+8T亚群在 第7周恢复正常(P>0.05，图2)。图中数据皆按各组大鼠T细胞亚群的均值作图。
图1 三组大鼠外周血CD+4T细胞亚群 的动态变化
图2 三组大鼠外周血CD+8T细胞亚群的动态变化
, 百拇医药
2.2 T11对DM大鼠血清XOD等4项指标的影响
2.2.1 血清XOD等4项指标的动态变化 DM大鼠经T11治疗后，血清XOD与MDA 水平逐渐降低，于第7周恢复正常(图3，图4)；SOD和CAT活性逐渐升高，分别于第8周与第7 周和对照组无显著性差异(图5，图6)。
图3 三组大鼠血清XOD活性的动态 变化(用均值作图)
图4 三组大鼠血清MDA水平的动态变化(以均值作图)
图5 三组大鼠血清SOD活性的动态变化(以均值作图)
图6 三组大鼠血清CAT活性的动态变化(以均值作图)
, 百拇医药
2.2.2 服用T11后7周4项指标的比较 DM大鼠服用T11后，第7周血清XOD、MDA、SOD和CAT的水平和DM组及对照组比较，见附表。
附表 三组大鼠血清4项指标水平的比较 (
±s) 组别
n
XOD(U/L)
SOD(NU/L)
CAT(U/L)
MDA(mmol/L)
DM组
7
, 百拇医药
24.40±2.751)
162.50±8.161)
5.80±1.121)
25.42±2.411)
D+T11组
7
12.20±2.09
182.96±7.852)
6.45±3.43
7.5 0±1.96
, 百拇医药
对照组
7
12.46±1.45
192.71±7.89
8.18±3.25
6.43±0.61
注：1)DM组与对照组比较P<0.0005
2)D+T11组与对照组比较P<0.005
表中显示DM大鼠用T11后7周，血清XOD和MDA水平明显低于DM组，而和对照组无明显差 异，CAT水平高于DM组，与对照组的差异无显著性；血清SOD水平则D+T11组高于DM组，但和 对照组相比，仍有显著性差别(P<0.005)。
, 百拇医药
2.3 服用T11后DM大鼠血清果糖胺的水平
本实验过程中，同时测定三组大鼠血清果糖胺的含量以便了解。T11对糖尿病的控制情 况 。DM大鼠服用T11后第7周果糖胺水平(1.45±0.32mmol/L)显著性低于DM组(2.93±0.33m mol/L,P<0.0005)，与对照组(1.35±0.25mmol/L)无显著性差别。
3 讨论
本实验制作的DM大鼠模型，外周血中CD+4T细胞亚群与CD+4/CD+8比值升高 ，CD+8降低，与Ziegler M等报告一致[5]。经病理证实，此动物模型是为ST Z诱导的迟发性糖尿病，即在外界因素作用下，由细胞介导而发生糖尿病。实验结果显示 大鼠发生糖尿病时，外周血T细胞亚群CD+4、CD+8分化异常的同时血中的氧自由 基同样发生异常改变，血清XOD活性与MDA水平明显升高，SOD与CAT则明显降低，机体免疫平 衡机制受损，过剩氧自由基与STZ选择性地损害了胰岛B细胞，最终形成糖尿病。
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T11为中药免疫抑制剂，内含三萜类、少量二萜类生物碱类[6]，对细胞免疫的调 节作用具有选择性，能选择抑制CD+4T细胞亚群的增殖，增强CD+8T细胞的活性 [7]，故DM大鼠在服用T11后CD+4T细胞和CD+8T细胞逐渐恢复正常；血清 XOD、MDA、SOD和CAT水平同样恢复至和对照组无显著性差别；血清果糖胺明显低于DM组，接 近对照组。这些变化规律表明：大鼠发生DM时T细胞亚群分化异常的同时氧自由基平衡失调且两 者间有着密切关系[8]；T11对T细胞亚群的异常分化和氧自由基的异常改变具有抑 制作用；DM大鼠服用T11后血清果糖胺恢复至对照组的水平，糖尿病大鼠的血糖升高得到控 制。本实验为临床使用T11治疗Ⅰ型糖尿病的研究提供理论基础。
参考文献
, 百拇医药
1，Wright JR,Lacy PE.Synthergistic effects of adjuvants,endotoxin,and fas ting on induction of diabetes with multple low dose of stretozocin in rats.Diabe tes,1988;317:112～118
2，Like AA,Rossin AA.Striptozotocin-induced pancreatic insulitis;new mode l of diabetes mellitus.Sciene,1979;193:415～418
3，钱庆文，董义光，吴俊荣.自身免疫性糖尿病大鼠T细胞亚群的变化.河南医科大 学学报，1997；32：47～49
4，王诗瑾，张 音，钱书虹.血清黄嘌呤氧化酶测定-四唑蓝直接比色法.河南医科 大学学报，1993；28：27～30
, http://www.100md.com
5，Ziegler M,Ziegler B,Hehmke L,et al.Autoimmune response directed to pan creatic beta cells in rats induced by combined treatment with low dose of strept ozotocin and completed Freund's adjuvant.Biochim Acta,1984;5:675～681
6，吕 余，张崇璞，陈 纭.雷公藤多甙的化学成分.江苏医药，1987；5：675～68 1
7，王国春，关冬梅.雷公藤对风湿关节炎患者淋巴细胞亚群的影响.中华内科杂志， 1994；33：42
8，Lowe GM,Huley CE,Rhodes ES,et al.Free radical stimulation of tyrosine kinase and phosphatase activity in human perpheral blood mononuclear cells.Bioch em Biophys Res Commun,1998;245:17～22
1999-10-21收稿, 百拇医药
单位：钱书虹 王诗瑾(河南医科大学一附院检验中心 450052)；钱庆文(重庆医科大学)；董义光(河南医科大学一附院内分泌科)
关键词：雷公藤多甙；迟发性糖尿病；黄嘌呤氧化酶
中国现代医学杂志000909 为了解雷公藤多甙对Ⅰ型糖尿病氧自由基和T细胞的影响以及他们的关 系，以链脲佐菌素(STZ)诱导的迟发性糖尿病大鼠为研究对象，于发病第2天用T11灌胃后， 连续测定外周血中T细胞亚群CD+2、CD+4、CD+8、黄嘌呤氧化酶(XOD)、超 氧化物歧化酶(SOD)、过氧化酶(CAT)和丙二醛(MDA)等的水平。结果显示，糖尿病大鼠(DM) 血 清XOD、MDA与CD+4水平明显高于对照组；SOD、CAT和CD+8水平明显降低。服用T1 1后，上述指标于6～8周分别恢复正常。DM大鼠经T11治疗后，外周血CD+4、CD+8 T细胞亚群与12项有关自由基的指标变化规律类似，说明大鼠发病时氧自由基的产生与T细胞 亚群的异 常分化有着密切的关系；T11不仅能抑制T细胞亚群的异常分化且可使氧自由基恢复正常。
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分类号 R58
INFLUENCE OF PLASMA FREE OXYGEN RADICALS AND TCELLS OF STREPTOZOTOCIN-INDUCED LATELY-ONSET DIABETIC RATS BYTRIPTERGIITOTORUM
Qian Shuhong Qian Qingwen Dong Yuguang Wang Shijin
(Henan Center of Clinic Laboratory,the First Affiliated Hospital, Henan Medical University, Zhengzhou 450052)
[Abstract]Objective: To study the change of oxygen radical s and T cells of stre ptozotocin-induced lately-onset diabetic rats by treatment with triptegiitotorum (TII). Methods: After diabetic rats were fed with TII, its bloo d was collected at second day. Levels of T cells subsets in blood and serum xanthine oxidase (XO D), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), malondialdehyde (MDA) were seria lly determined. Results: The levels of XOD, MDA and CD4+ T c ells were markedly h igher than those of control. SOD, CAT and CD8+ T cells were signigicantly lo wer that those of control, and all of which became normal in 6～8 weeks by TII. So t h ere was closed relative between free oxygen radicals and T cells subsets at the onset of diabetic rats. Conclusions: TII not only inhibited the disorder of T cells subsets but also regulated diabetic free oxygen radicals.
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Key words:Triptegiitotorum; Lately-onset Diabetes; Xanthine O xidas
本文以STZ诱导的迟发性糖尿病大鼠为模型，通过测定服用T11前后糖 尿病大鼠外周血T细胞亚群和XOD等表示氧自由基代谢的几项指标，研究：T细胞亚群与氧自 由基的关系；T11对这些指标的影响与意义。
1 材料与方法
1.1 材料
STZ(Sigma公司)，雷公藤多甙(湖南株州制药三厂)，还原性辅酶(Bcehrieger Gm6H)，氯化 硝基四氮唑蓝和酚嗪二甲酯硫酸(上海前进试剂公司)，SOD和MDA试剂盒(南京建成生物工程 研 究所)，碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶免疫组化试剂盒(中国军事科学院)。T细胞亚群单克隆抗 体(MR-OX-34，CD+2单抗；V3/25，CD+4单抗；MRC OX-8，CD+8单抗 ， 均由牛津大学，J.Pukavec教授馈赠)；果糖胺试剂盒(东瓯生物工程公司)，动物：Wistar大 鼠，体重(200±209)g(河南省实验动物中心)。
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 动物模型与分组 Wistar大鼠21只：DM组7只，本组为迟发型糖尿病，标本模型的制作参照Wight JR等法 [1]，制作过程中每天测定尿糖1次，每周测定血糖2次。成模后继续按此测定。糖尿病 确诊按Like AA标准[2]；T11治疗组(D+T11)7只，DM大鼠成模后2天开始用T11 10m g/kg体重灌胃；对照组7只。DM组和对照组用盐水灌胃。
1.2.2 方法 标本采取：选用尾静脉血，一部分血液用肝素(50iu/ml)抗凝 ，此部分血液用于T细胞亚群测定。另部分静脉血于凝固后分离血清，测定XOD、SOD、CAT和 MDA。实验方法：T细胞亚群采用免疫组化法[3]；XOD为酚嗪二甲酯硫酸与氯化硝 基四氮唑蓝法[4]；其他试验按说明书操作。
1.3 统计分析
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测定数据用均值±标准差和t检验统计处理。
2 结果
2.1 T11对T细胞亚群的影响
DM大鼠经T11治疗后，3组大鼠外周血中CD+2T细胞亚群的变化相互间无显著性差异。CD +4T细胞亚群于第6周和对照组无显著差异(P>0.05，图1)。CD+8T亚群在 第7周恢复正常(P>0.05，图2)。图中数据皆按各组大鼠T细胞亚群的均值作图。
图1 三组大鼠外周血CD+4T细胞亚群 的动态变化 图2 三组大鼠外周血CD+8T细胞亚群的动态变化, 百拇医药
2.2 T11对DM大鼠血清XOD等4项指标的影响
2.2.1 血清XOD等4项指标的动态变化 DM大鼠经T11治疗后，血清XOD与MDA 水平逐渐降低，于第7周恢复正常(图3，图4)；SOD和CAT活性逐渐升高，分别于第8周与第7 周和对照组无显著性差异(图5，图6)。
图3 三组大鼠血清XOD活性的动态 变化(用均值作图) 图4 三组大鼠血清MDA水平的动态变化(以均值作图) 图5 三组大鼠血清SOD活性的动态变化(以均值作图) 图6 三组大鼠血清CAT活性的动态变化(以均值作图), 百拇医药
2.2.2 服用T11后7周4项指标的比较 DM大鼠服用T11后，第7周血清XOD、MDA、SOD和CAT的水平和DM组及对照组比较，见附表。
附表 三组大鼠血清4项指标水平的比较 (
±s) 组别n
XOD(U/L)
SOD(NU/L)
CAT(U/L)
MDA(mmol/L)
DM组
7
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24.40±2.751)
162.50±8.161)
5.80±1.121)
25.42±2.411)
D+T11组
7
12.20±2.09
182.96±7.852)
6.45±3.43
7.5 0±1.96
, 百拇医药
对照组
7
12.46±1.45
192.71±7.89
8.18±3.25
6.43±0.61
注：1)DM组与对照组比较P<0.0005
2)D+T11组与对照组比较P<0.005
表中显示DM大鼠用T11后7周，血清XOD和MDA水平明显低于DM组，而和对照组无明显差 异，CAT水平高于DM组，与对照组的差异无显著性；血清SOD水平则D+T11组高于DM组，但和 对照组相比，仍有显著性差别(P<0.005)。
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2.3 服用T11后DM大鼠血清果糖胺的水平
本实验过程中，同时测定三组大鼠血清果糖胺的含量以便了解。T11对糖尿病的控制情 况 。DM大鼠服用T11后第7周果糖胺水平(1.45±0.32mmol/L)显著性低于DM组(2.93±0.33m mol/L,P<0.0005)，与对照组(1.35±0.25mmol/L)无显著性差别。
3 讨论
本实验制作的DM大鼠模型，外周血中CD+4T细胞亚群与CD+4/CD+8比值升高 ，CD+8降低，与Ziegler M等报告一致[5]。经病理证实，此动物模型是为ST Z诱导的迟发性糖尿病，即在外界因素作用下，由细胞介导而发生糖尿病。实验结果显示 大鼠发生糖尿病时，外周血T细胞亚群CD+4、CD+8分化异常的同时血中的氧自由 基同样发生异常改变，血清XOD活性与MDA水平明显升高，SOD与CAT则明显降低，机体免疫平 衡机制受损，过剩氧自由基与STZ选择性地损害了胰岛B细胞，最终形成糖尿病。
, http://www.100md.com
T11为中药免疫抑制剂，内含三萜类、少量二萜类生物碱类[6]，对细胞免疫的调 节作用具有选择性，能选择抑制CD+4T细胞亚群的增殖，增强CD+8T细胞的活性 [7]，故DM大鼠在服用T11后CD+4T细胞和CD+8T细胞逐渐恢复正常；血清 XOD、MDA、SOD和CAT水平同样恢复至和对照组无显著性差别；血清果糖胺明显低于DM组，接 近对照组。这些变化规律表明：大鼠发生DM时T细胞亚群分化异常的同时氧自由基平衡失调且两 者间有着密切关系[8]；T11对T细胞亚群的异常分化和氧自由基的异常改变具有抑 制作用；DM大鼠服用T11后血清果糖胺恢复至对照组的水平，糖尿病大鼠的血糖升高得到控 制。本实验为临床使用T11治疗Ⅰ型糖尿病的研究提供理论基础。
参考文献
, 百拇医药
1，Wright JR,Lacy PE.Synthergistic effects of adjuvants,endotoxin,and fas ting on induction of diabetes with multple low dose of stretozocin in rats.Diabe tes,1988;317:112～118
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3，钱庆文，董义光，吴俊荣.自身免疫性糖尿病大鼠T细胞亚群的变化.河南医科大 学学报，1997；32：47～49
4，王诗瑾，张 音，钱书虹.血清黄嘌呤氧化酶测定-四唑蓝直接比色法.河南医科 大学学报，1993；28：27～30
, http://www.100md.com
5，Ziegler M,Ziegler B,Hehmke L,et al.Autoimmune response directed to pan creatic beta cells in rats induced by combined treatment with low dose of strept ozotocin and completed Freund's adjuvant.Biochim Acta,1984;5:675～681
6，吕 余，张崇璞，陈 纭.雷公藤多甙的化学成分.江苏医药，1987；5：675～68 1
7，王国春，关冬梅.雷公藤对风湿关节炎患者淋巴细胞亚群的影响.中华内科杂志， 1994；33：42
8，Lowe GM,Huley CE,Rhodes ES,et al.Free radical stimulation of tyrosine kinase and phosphatase activity in human perpheral blood mononuclear cells.Bioch em Biophys Res Commun,1998;245:17～22
1999-10-21收稿, 百拇医药