食管癌及癌前病变组织中癌基因的表达
作者：张式暖 王亚利 王艳华 吕世军 魏志新 姜红心
单位：潍坊医学院病理学教研室 261042
关键词：食管肿瘤；癌基因蛋白p53；点突变；癌前状态
中国现代医学杂志000903
目的：研究p53基因点突变在食管癌及癌前病变粘膜细胞癌变过程中的 变异作用及定量分析，对病人预后的关系。方法：选取手术新鲜标本及蜡块90例。DNA提取 分析，应用PCR-RFLP和DNA序列分析，免疫组化ABC法，利用MPV-2型显微分光光度计检测 分析。结果p53基因在食管癌、不典型增生组织中点突变频率较高，分别为60%、29.4% 。 错义突变和移码突变占全部突变的73%。p53表达强度与生存期有相关性。结论：p53基因点 突变在食管粘膜细胞癌变过程中起重要作用。
, http://www.100md.com 分类号 R735.1
STUDIES ON ONCOGENE IN THE ESOPHAGUS CARCINOMA AND PRECANCEROSIS
Zhang Shinua Wang Yali Wang Yanhua,et al.
(Wei Fang Medical College, Shandong 261042)
[Abstract]Objective: To investigate the variation action of p53 point mutation in esophagus carcinoma, precancerosis and the p53 quantitative analysis relatio nship with patient's prognosis. Methods: Selected 90 cases of fr esh operative pr eparations and embedded (precancerosis 30, squamous cell carcinoma 60). DNA adva nce analysis, used PCR-RFLP and DNA sequential analysis to examine and analyze t he fashions and types of p53 gene point mutation; By Immunohistochemistry ABC me thods. Results: Frequencies of p53 gene point mutation in esopha gus carcinoma an d dysplasia tissues were higher (60% and 29.4% respectively). Missense mutation and frame shift mutation accounted for 73 percent of all. Expression of p53 posi tive immunoactive cells was 60% in esophagus carcinoma and 42% in dysplasia. The degree of p53 gene expressions had a relationship with survival stage. Compared esophagus carcinoma and dysplasia with normal mucosa tissue, the activity of LD H increased P<0.05. Compared the numbers of monocyte and lymphocyte of stro ma of esophagus carcinoma with that of normal mucosa cell had difference P<0.01. Conclusions: p53 gene point mutation plays an important role in the processes of eso phagus carcinomas.
, 百拇医药
Key words:Esophageal Neoplasms; Oncogene Protein p53; Precacero us Conditions; Point Mutation
食管癌的发生、发展是一个多基因变异累积的复杂过程，涉及多种癌 基因和抑癌基因的异常。p53基因缺失及点突变，都存在p53基因的异常，点突变是其最主要 的失活方式之一。我们选取了食管癌标本，对p53基因点突变进行检测和分析，为其发病 机制提供论据。
1 材料与方法
1.1 组织标本
收集潍坊医学院附属医院及潍坊市人民医院手术切除标本90例，包括食管癌标本60例，癌前 病变标本30例，其中男66例，女24例。所有标本经病理切片HE及免疫化确定，利用标本两端 作为正常对照。
, 百拇医药
1.2 p53基因突变检测
DNA提取，石蜡包埋食管病变组织，连续切片10μm厚，经二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，Prot ease k消化，酚/氯仿，氯仿/戊醇抽提，乙醇沉淀pH8.0，TE溶解提取DNA；聚合酶链反应后 ，置冰溶液加入0.5μl Taq酶，置9600Ⅱ型PCR循环仪上扩增；限制性片段长度多态性，即R F LP分析，取10ml扩增产物，加DNA限制性内切酶MSPI、HaeⅢ酶切，37℃消化酶切过夜，酶切 产物用4%聚丙烯酰胺垂直电泳分析。
1.3 p53基因引物由中国科学院微生物所合成，Protease k,Taq DNA多聚酶，DNA分子量，D NA限制性内切酶MSP I、HaeⅢ均购自Promega生物工程公司。
1.4 p53免疫组化染色
免疫组化ABC法，Ⅰ抗为鼠抗人p53抗体(Ⅰ抗及ABC试剂盒为DAKO公司产品)，最后DAB显色 。免疫组化染色结果根据阳性细胞百分比及着色强度进行计分，结果见表1。利用四川大 学生产的MIAS病理图像分析仪，对肿瘤细胞核的形态和DNA含量各参数进行测量。将4μm切片 置于物镜下，随机选样100个癌细胞，同100个淋巴细胞作对照，图像处理通过对各种参数进 行处理。
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表1 免疫组化染色评分标准 阳性细胞百分比
着色强度计分
百分比(%)
计分
强度
计分
0
0
无
0
<25
1
弱(蛋黄)
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1
～50
2
中(棕黄)
2
～75
3
强(棕黄)
3
>75
4
注：两项分数相加得总积分2 结果
2.1 p53基因突变结果分析
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p53基因引物扩增片段164片段、p53～248位点经MSPI酶切，野生型切成113bp、51bp两个片 段 ，突变型则为164bp；p53～249位点经HaeⅢ酶切，野生型切成28bp、46bp、96bp三个片段， 而 突变后则被切成28bp、136bp二个片段。60例食管癌组织中存在32例p53～248位点突变， 占53. 3%，p53～249位点36例发生点突变，占60.0%；30例食管粘膜不典型增生病例中有5例(19.4 %) 发生点突变，5例重度不典型增生病例中，在2个外显子上发现有点突变。突变方式：食管粘 膜病变组织的序列分析显示，23例点突变中，碱基转换11例(47.8%)，颠倒8例(34.8%) ，移 码突变3例(13.0%)。p53基因249位点密码子错义点突变分析发现为高频度的错义点突变 。
2.2 免疫组化p53表达及DNA定量分析的关系
食管癌，不典型增生p53阳性率分别为60%(见图p53表达阳性)，42%。不同性别、年龄、分化 程度及肿瘤大小，p53表达率无统计学差异，但p53表达强度与生存期有关，见表2。
附图 食管鳞癌细胞核内p53阳性颗粒苏木精复染 ×600
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表2 p53蛋白表达强度与生存期的关系 例(%) p53强度
例数
生存时间(年)
<1
1～3
>3
(-)
25
8(32.0)
9(36.0)
8(32.0)
(+)
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20
3(15.0)
8(40.0)
9(45.0)
(++～+++)
15
6(40.0)
6(40.0)
3(20.0)
注：与<1年相比，P<0.05
p53免疫组化积分与图像分析参数作相关分析，结果显示积分与DIM有相关性，相关系数为0.362，P<0.05。而积分与DIP、PER和AER均无相关性。对免疫组化阴性与阳性组 的图像分析 参数进行t检验，两组各参数均无统计学差异。但将免疫组化评分进行统计分析显示， 两组之间有显著差异，P<0.01。
, 百拇医药
3 讨论
3.1 p53基因点突变与食管癌变的关系
p53基因的异常与食管粘膜细胞癌变的过程密切相关，与食管粘膜细胞癌变的过程密 切 相关，点突变是最主要的 形式之一，在相对保守的第5～8外显子上发生较为频繁(80%以上) [1]。这些突变使p53核心区空间结构发生改变，影响DNA片段的结合，也可能影响 p53的磷酸化，使p53失去正常的转录活化功能[2]，突变后的p53丧失野生型的功 能 ，表现负显性作用，具有潜在的致瘤性，而且这种致瘤性需要野生型的活化区域[3] 。检测发现p53基因在食管癌、异常增生组织中均存在较高频率的突变，分别为60.0%、29 .4%，癌前期病变组织中突变频率明显低于癌组织。结果显示，食管粘膜重度不典型增生→ 癌变的演变过程，p53基因点突变频率呈渐增趋势，p53基因的点突变是食管粘膜病变演化的 重要分子标准物。
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在检出的突变点中248和249位点为p53基因的突变热点，点突变频率伴随食管癌演变过程， 呈渐进趋势，组织中p53基因突变的类型不同，点突变分布不同。点突变分布在第5～8外显 子，以第5和第7为最高。错义突变和移码突变是p53基因失活的主要原因 [4，5]。多因素的作用可能是p53基因异常的重要原因，这种作用导致了食管癌 组织中p53基因点突变位点和类型的多样化[6，7]，并致使其最终丧失抑制细胞 生长的功能而导致肿瘤的发生。
3.2 p53基因与食管癌的预后关系
本文发现，单纯的p53蛋白定性表达阳性率高低与病人生存期长短之间无明显关系，但与表 达 强度有关。存活<1年组中p53弱阳性占15.0%，而强阳性占40.0%；存活>3年组中分别为45. 0%，20.0%，两组相比，差异有显著性P<0.05，表明p53弱阳性表达的患者存活3年 以上 的多，预后较好，而强阳性表达的，1年内死亡的多，预后差。在我们存活5年以上的10例病 人中无1例强阳性表达者。其结果提示p53表达强度，可作为判断食管癌预后的一个参数指标 。
, 百拇医药
3.3 p53基因与细胞形态定量分析
本研究对不同分组统计分析表明，p53阳性组与阴性组的DNA指数并无差异，但评分大于3分 组和小于等于3分(包括阴性者)组其DNA指数有统计学差异。3分以上组DI均值为3.27，5年存 活率为20%左右；3分以下组为2.40，5年存活率为36%。p53评分为2～3分组其DNA指数与阴 性组无统计学差异。推测p53免疫组化评分3分及3分以下和3分以上这两组的生物学行为上有 一定的差异，p53弱阳性与阴性其生物学行为相似。因此p53积分可作为判断病人预后的又 一个辅助指标。
山东省教委资助项目 编号19996
参考文献
1，Hollstein M,Sidransky D,Vogelstein B,et al.p53 mutation in human cance rs.Science,1991;253:49
, 百拇医药
2，Cho Y,Gorina S,Jeffrey PD,et al.Crystal structure of a p53 tumor suppr essor DNA complex:understanding tumorigenic mutations.Science,1994;265:346
3，Ko LJ,Prives C.p53:puzzle and paradigm.Genen.Development,1996;10:1054
4，Goukon Y,Sasano H,Nishihira T,et al.p53 overexpression in human oesoph geal carcinoma:a correlation with tumor DNA ploidy and two parameter flow cytome tric study.Anticancer Res,1994;14:1305
, 百拇医药
5，Bennett WP,Hollstein MC,He A,et al.Archival analysis of p53 genetic an d protein alternations in Chinese esophageal ancer.Oncogene,1991;6:1779
6，Vijeyasingam R,Darnton SJ,Jenner K,et al.Expression of p53 protein in oesophageal carinoma:clinicopathological correlation and prognostic significance .Br J Surg,1994;81:1623
7，Shimaya K,Shiozaki H,Inoue M,et al.Significance of p53 expression as a prognostic factor in oesophageal squamous cell carcinoma.Virchows Archiv A Path ol anat,1993;422:271
2000-02-10收稿, 百拇医药
单位：潍坊医学院病理学教研室 261042
关键词：食管肿瘤；癌基因蛋白p53；点突变；癌前状态
中国现代医学杂志000903
目的：研究p53基因点突变在食管癌及癌前病变粘膜细胞癌变过程中的 变异作用及定量分析，对病人预后的关系。方法：选取手术新鲜标本及蜡块90例。DNA提取 分析，应用PCR-RFLP和DNA序列分析，免疫组化ABC法，利用MPV-2型显微分光光度计检测 分析。结果p53基因在食管癌、不典型增生组织中点突变频率较高，分别为60%、29.4% 。 错义突变和移码突变占全部突变的73%。p53表达强度与生存期有相关性。结论：p53基因点 突变在食管粘膜细胞癌变过程中起重要作用。
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STUDIES ON ONCOGENE IN THE ESOPHAGUS CARCINOMA AND PRECANCEROSIS
Zhang Shinua Wang Yali Wang Yanhua,et al.
(Wei Fang Medical College, Shandong 261042)
[Abstract]Objective: To investigate the variation action of p53 point mutation in esophagus carcinoma, precancerosis and the p53 quantitative analysis relatio nship with patient's prognosis. Methods: Selected 90 cases of fr esh operative pr eparations and embedded (precancerosis 30, squamous cell carcinoma 60). DNA adva nce analysis, used PCR-RFLP and DNA sequential analysis to examine and analyze t he fashions and types of p53 gene point mutation; By Immunohistochemistry ABC me thods. Results: Frequencies of p53 gene point mutation in esopha gus carcinoma an d dysplasia tissues were higher (60% and 29.4% respectively). Missense mutation and frame shift mutation accounted for 73 percent of all. Expression of p53 posi tive immunoactive cells was 60% in esophagus carcinoma and 42% in dysplasia. The degree of p53 gene expressions had a relationship with survival stage. Compared esophagus carcinoma and dysplasia with normal mucosa tissue, the activity of LD H increased P<0.05. Compared the numbers of monocyte and lymphocyte of stro ma of esophagus carcinoma with that of normal mucosa cell had difference P<0.01. Conclusions: p53 gene point mutation plays an important role in the processes of eso phagus carcinomas.
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Key words:Esophageal Neoplasms; Oncogene Protein p53; Precacero us Conditions; Point Mutation
食管癌的发生、发展是一个多基因变异累积的复杂过程，涉及多种癌 基因和抑癌基因的异常。p53基因缺失及点突变，都存在p53基因的异常，点突变是其最主要 的失活方式之一。我们选取了食管癌标本，对p53基因点突变进行检测和分析，为其发病 机制提供论据。
1 材料与方法
1.1 组织标本
收集潍坊医学院附属医院及潍坊市人民医院手术切除标本90例，包括食管癌标本60例，癌前 病变标本30例，其中男66例，女24例。所有标本经病理切片HE及免疫化确定，利用标本两端 作为正常对照。
, 百拇医药
1.2 p53基因突变检测
DNA提取，石蜡包埋食管病变组织，连续切片10μm厚，经二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，Prot ease k消化，酚/氯仿，氯仿/戊醇抽提，乙醇沉淀pH8.0，TE溶解提取DNA；聚合酶链反应后 ，置冰溶液加入0.5μl Taq酶，置9600Ⅱ型PCR循环仪上扩增；限制性片段长度多态性，即R F LP分析，取10ml扩增产物，加DNA限制性内切酶MSPI、HaeⅢ酶切，37℃消化酶切过夜，酶切 产物用4%聚丙烯酰胺垂直电泳分析。
1.3 p53基因引物由中国科学院微生物所合成，Protease k,Taq DNA多聚酶，DNA分子量，D NA限制性内切酶MSP I、HaeⅢ均购自Promega生物工程公司。
1.4 p53免疫组化染色
免疫组化ABC法，Ⅰ抗为鼠抗人p53抗体(Ⅰ抗及ABC试剂盒为DAKO公司产品)，最后DAB显色 。免疫组化染色结果根据阳性细胞百分比及着色强度进行计分，结果见表1。利用四川大 学生产的MIAS病理图像分析仪，对肿瘤细胞核的形态和DNA含量各参数进行测量。将4μm切片 置于物镜下，随机选样100个癌细胞，同100个淋巴细胞作对照，图像处理通过对各种参数进 行处理。
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表1 免疫组化染色评分标准 阳性细胞百分比
着色强度计分
百分比(%)
计分
强度
计分
0
0
无
0
<25
1
弱(蛋黄)
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1
～50
2
中(棕黄)
2
～75
3
强(棕黄)
3
>75
4
注：两项分数相加得总积分2 结果
2.1 p53基因突变结果分析
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p53基因引物扩增片段164片段、p53～248位点经MSPI酶切，野生型切成113bp、51bp两个片 段 ，突变型则为164bp；p53～249位点经HaeⅢ酶切，野生型切成28bp、46bp、96bp三个片段， 而 突变后则被切成28bp、136bp二个片段。60例食管癌组织中存在32例p53～248位点突变， 占53. 3%，p53～249位点36例发生点突变，占60.0%；30例食管粘膜不典型增生病例中有5例(19.4 %) 发生点突变，5例重度不典型增生病例中，在2个外显子上发现有点突变。突变方式：食管粘 膜病变组织的序列分析显示，23例点突变中，碱基转换11例(47.8%)，颠倒8例(34.8%) ，移 码突变3例(13.0%)。p53基因249位点密码子错义点突变分析发现为高频度的错义点突变 。
2.2 免疫组化p53表达及DNA定量分析的关系
食管癌，不典型增生p53阳性率分别为60%(见图p53表达阳性)，42%。不同性别、年龄、分化 程度及肿瘤大小，p53表达率无统计学差异，但p53表达强度与生存期有关，见表2。
附图 食管鳞癌细胞核内p53阳性颗粒苏木精复染 ×600, 百拇医药
表2 p53蛋白表达强度与生存期的关系 例(%) p53强度
例数
生存时间(年)
<1
1～3
>3
(-)
25
8(32.0)
9(36.0)
8(32.0)
(+)
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20
3(15.0)
8(40.0)
9(45.0)
(++～+++)
15
6(40.0)
6(40.0)
3(20.0)
注：与<1年相比，P<0.05
p53免疫组化积分与图像分析参数作相关分析，结果显示积分与DIM有相关性，相关系数为0.362，P<0.05。而积分与DIP、PER和AER均无相关性。对免疫组化阴性与阳性组 的图像分析 参数进行t检验，两组各参数均无统计学差异。但将免疫组化评分进行统计分析显示， 两组之间有显著差异，P<0.01。
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3 讨论
3.1 p53基因点突变与食管癌变的关系
p53基因的异常与食管粘膜细胞癌变的过程密切相关，与食管粘膜细胞癌变的过程密 切 相关，点突变是最主要的 形式之一，在相对保守的第5～8外显子上发生较为频繁(80%以上) [1]。这些突变使p53核心区空间结构发生改变，影响DNA片段的结合，也可能影响 p53的磷酸化，使p53失去正常的转录活化功能[2]，突变后的p53丧失野生型的功 能 ，表现负显性作用，具有潜在的致瘤性，而且这种致瘤性需要野生型的活化区域[3] 。检测发现p53基因在食管癌、异常增生组织中均存在较高频率的突变，分别为60.0%、29 .4%，癌前期病变组织中突变频率明显低于癌组织。结果显示，食管粘膜重度不典型增生→ 癌变的演变过程，p53基因点突变频率呈渐增趋势，p53基因的点突变是食管粘膜病变演化的 重要分子标准物。
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在检出的突变点中248和249位点为p53基因的突变热点，点突变频率伴随食管癌演变过程， 呈渐进趋势，组织中p53基因突变的类型不同，点突变分布不同。点突变分布在第5～8外显 子，以第5和第7为最高。错义突变和移码突变是p53基因失活的主要原因 [4，5]。多因素的作用可能是p53基因异常的重要原因，这种作用导致了食管癌 组织中p53基因点突变位点和类型的多样化[6，7]，并致使其最终丧失抑制细胞 生长的功能而导致肿瘤的发生。
3.2 p53基因与食管癌的预后关系
本文发现，单纯的p53蛋白定性表达阳性率高低与病人生存期长短之间无明显关系，但与表 达 强度有关。存活<1年组中p53弱阳性占15.0%，而强阳性占40.0%；存活>3年组中分别为45. 0%，20.0%，两组相比，差异有显著性P<0.05，表明p53弱阳性表达的患者存活3年 以上 的多，预后较好，而强阳性表达的，1年内死亡的多，预后差。在我们存活5年以上的10例病 人中无1例强阳性表达者。其结果提示p53表达强度，可作为判断食管癌预后的一个参数指标 。
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3.3 p53基因与细胞形态定量分析
本研究对不同分组统计分析表明，p53阳性组与阴性组的DNA指数并无差异，但评分大于3分 组和小于等于3分(包括阴性者)组其DNA指数有统计学差异。3分以上组DI均值为3.27，5年存 活率为20%左右；3分以下组为2.40，5年存活率为36%。p53评分为2～3分组其DNA指数与阴 性组无统计学差异。推测p53免疫组化评分3分及3分以下和3分以上这两组的生物学行为上有 一定的差异，p53弱阳性与阴性其生物学行为相似。因此p53积分可作为判断病人预后的又 一个辅助指标。
山东省教委资助项目 编号19996
参考文献
1，Hollstein M,Sidransky D,Vogelstein B,et al.p53 mutation in human cance rs.Science,1991;253:49
, 百拇医药
2，Cho Y,Gorina S,Jeffrey PD,et al.Crystal structure of a p53 tumor suppr essor DNA complex:understanding tumorigenic mutations.Science,1994;265:346
3，Ko LJ,Prives C.p53:puzzle and paradigm.Genen.Development,1996;10:1054
4，Goukon Y,Sasano H,Nishihira T,et al.p53 overexpression in human oesoph geal carcinoma:a correlation with tumor DNA ploidy and two parameter flow cytome tric study.Anticancer Res,1994;14:1305
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5，Bennett WP,Hollstein MC,He A,et al.Archival analysis of p53 genetic an d protein alternations in Chinese esophageal ancer.Oncogene,1991;6:1779
6，Vijeyasingam R,Darnton SJ,Jenner K,et al.Expression of p53 protein in oesophageal carinoma:clinicopathological correlation and prognostic significance .Br J Surg,1994;81:1623
7，Shimaya K,Shiozaki H,Inoue M,et al.Significance of p53 expression as a prognostic factor in oesophageal squamous cell carcinoma.Virchows Archiv A Path ol anat,1993;422:271
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