MCP-1 McAb和Losartan拮抗VSMCs的增殖与迁移效应的实验研究
作者：何作云 李爱民
单位：何作云(第三军医大学附属新桥医院心血管内科，重庆 400037)；李爱民(第三军医大学附属新桥医院心血管内科，重庆 400037)
关键词：血管平滑肌细胞；增殖；迁移；单核细胞趋化蛋白-1单克隆抗体
第三军医大学学报000901
提 要： 目的 探讨单核细胞趋化蛋白-1单克隆抗体(MCP-1 McAb)或Losartan拮抗血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)介导的血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖与迁移效应的可能性，为防治动脉硬化(AS)提供一定的理论依据。方法 采用改良的Boyden小室法检测VSMCs的迁移效应；以MTT法、3H-TdR掺入法、3H-脯氨酸标记法和VSMCs计数评价VSMCs的增殖效应；将培养的VSMCs分为5组：2%胎牛血清(2%FCS)组、AngⅡ组(其浓度为10-10～10-6 mol/L)、Losartan组(其浓度为10-7～10-5 mol/L)、MCP-1 McAb组(终浓度为10 μg/ml)和阳性对照组(含5%的酵母多糖活化血清)。结果 ①AngⅡ具有剂量依赖性的促进VSMCs增殖与迁移效应；②MCP-1 McAb或Losartan能有效地拮抗AngⅡ介导的VSMCs增殖与迁移效应。结论 MCP-1 McAb或Losartan对动脉硬化性疾病可能具有较大的应用前景。
, http://www.100md.com
中图法分类号： R322.12;R329.25;R392.11 文献标识码： A
文章编号：1000-5404(2000)09-0815-04
Antagonistic effect of MCP-1 McAb and Losartan on proliferation and migration of Ang-Ⅱ-mediated VSMCs in vitro
HE Zuo-yun
(Department of Cardiology, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China)
LI Ai-min
, 百拇医药
(Department of Cardiology, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China)
Abstract： Objective To study the possibility of monocyte chemotactic protein-1 monoclonal antibody(MCP-1 McAb) or Losartan antagonizing the proliferation and migration of cultured vascular smooth muscle cells (VSMCs) mediated by angiotensin Ⅱ(AngⅡ). Methods The cultured VSMCs were divided into 5 groups, i.e. 2% fetal calf serum group (2%FCS group), AngⅡ group (concentration of 10-10-10-6 mol/L), Losartan group (concentration of 10-7-10-5 mol/L), MCP-1 McAb group(final concentration of 10 μg/ml) and positive control (concentration 5% zymosan). The migration effects of cultured VSMCs were examined by a modified Boyden's chamber. And the proliferation effect was evaluated with MTT, thiazolyl blue intaking, 3H-TdR and 3H-proline incorporation as well as VSMCs count. Results ①AngⅡexerted an enhancing effect on the proliferation and migration of cultured VSMCs in a concentration-dependent manner; ②Both MCP-1 McAb and Losartan could antagonize the proliferation and migration of AngⅡ-mediated VSMCs. Conclusion It is suggested that MCP-1 McAb and Losartan both play predominant roles in inhibiting the proliferation and migration of VSMCs and are prospective in the treatment of atherosclerotic diseases.
, http://www.100md.com
Key words： vascular smooth muscle cells; proliferation; migration; monocyte chemotactic protein-1 monoclonal antibody
近来研究表明血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，AngⅡ)对血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)具有生长激素样作用，在冠状动脉粥样硬化性心脏病和血管成形术后再狭窄等闭塞性血管病变的发生、发展中起着重要作用。本实验目的在于探讨AngⅡ对培养VSMCs增殖与迁移效应的影响，并探讨单核细胞趋化蛋白-1单克隆抗体(Monocyte chemotactic protein-1 monoclonal antibody，MCP-1 McAb)和Losartan拮抗AngⅡ介导的上述生物效应，为防治或消退动脉粥样硬化提供一定的理论依据。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 VSMCs迁移试验 采用改良的Boyden小室法[1]取生长活跃的培养VSMCs(第2～5代)进行实验。0.25%胰蛋白酶消化VSMCs，用含2%胎牛血清(2%FCS)的M199培养液将细胞密度调为1×106/ml，使细胞在培养液中悬浮1 h以恢复形态。混匀细胞悬液，吸取0.35 ml 分别加入Boyden小室的上室内，吸取含2%FCS的M199培养液0.5 ml加入Boyden小室的下室内，此为2%FCS组；下室内分别加入10-10～10-6 mol/L浓度的AngⅡ、10-7～10-5 mol/L的Losartan、5%的酵母多糖活化血清及在上室中加入终浓度为10 μg/ml的MCP-1 McAb，则分别为AngⅡ组、Losartan组、阳性对照组及MCP-1 McAb组，并在Losartan组和MCP-1 McAb组中分别在其下室中加入AngⅡ 10-7 mol/L。封闭下室小孔，置37 ℃，5%二氧化碳孵箱内培养6 h。取出Boyden小室内的微孔滤膜，PBS洗2次，无水乙醇固定10 s以杀死细胞，PBS洗2次后以Harris苏木素染色5 min，蒸馏水冲洗，1%盐酸酒精脱色3 min，流水冲洗，1% NaHCO3显蓝染色3 min。水洗后，37 ℃烤膜过夜，无水乙醇脱水，二甲苯透明，将滤膜上载玻片以中性树胶封片，在显微镜下，计算滤膜下10 μm处随机计数膜内不同层次的VSMCs数，每张膜观察10个高倍视野(10 HF)，计算其总数。双份滤膜内的移动细胞平均数表示VSMCs的迁移效应程度。
, 百拇医药
1.2 VSMCs增殖效应检测
1.2.1细胞生长曲线检测 以MTT法检测[2]2%FCS、F-12HAM培养液对照组、AngⅡ组、Losartan组和MCP-1 McAb组。
1.2.2 VSMCs内DNA和蛋白质合成的检测 以3H-TdR掺入法[3]和3H-脯氨酸标记法[4]检测上述4组的DNA和蛋白质合成量。
1.2.3 VSMCs计数 将细胞密度调整为4×104/ml，以每孔1 ml加入24孔培养板孔中，分别加入2%FCS(2%FCS组)、2%FCS+10-7 mol/L AngⅡ(AngⅡ组)、AngⅡ10-7 mol/L+10-5 mol/L Losartan+2%FCS(Losartan组)和10-7 mol/L AngⅡ+10 μg/ml MCP-1 McAb(MCP-1 McAb组)常规培养96 h后收集细胞，用血球计数板计数各孔VSMCs数量。每组试验重复5次，取其均值。
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1.3 统计学处理
计量资料以
±s表示，采用单因素方差分析比较组间差异的显著性。
2 结果
2.1 VSMCs迁移试验结果
2%FCS有少量的VSMCs移动，提示其含有生理量的VSMCs的趋化物质或生长因子；在AngⅡ组中，VSMCs的迁移数量随着AngⅡ浓度由10-10至10-6 mol/L的递增而明显的增加(P<0.01)，见图1；Losartan或MCP-1 McAb均能显著地抑制AngⅡ介导的VSMCs的迁移效应(P<0.01)，见图2。
, 百拇医药
图1 AngⅡ和2%FCS对VSCMs迁移的影响
Fig 1 Effect of AngⅡ and 2%FCS on VSCMs migration
1：Control(2%FCS)；2,3,4,5:10-10,10-8,10-7,10-6 mol/L AngⅡ+2%FCS;*：P<0.05,* *：P<0.01 vs control
图2 Losartan和MCP-1 McAb对VSMCs迁移的影响
Fig 2 Effect of Losartan and MCP-1 McAb on VSCMs migration
, http://www.100md.com
1：Control(AngⅡ10-7 mol/L)；2,4,5：Losartan 10-7,10-6,10-5 mol/L+AngⅡ10-7 mol/L；3：MCP-1 McAb+AngⅡ10-7 mol/L；* *：P<0.01 vs control
2.2 VSMCs增殖试验结果
2.2.1AngⅡ促进VSMCs的细胞代谢、DNA和蛋白质合成
AngⅡ在10-10～10-6 mol/L范围内，呈其浓度或剂量依赖性的增加VSMCs内细胞代谢、DNA和蛋白质合成量，然而AngⅡ10-12 mol/L却无上述效应，见表1。
, 百拇医药 2.2.2 Losartan和MCP-1 McAb抑制VSMCs内细胞代谢、DNA和蛋白质合成 Losartan在10-7～10-5 mol/L范围内，呈剂量依赖性抑制VSMCs内细胞代谢、DNA和蛋白质合成量，见表1。MCP-1 McAb也能明显抑制VSMCs内细胞代谢(对MTT的摄取与代谢，Dλ值降至0.060±0.008,P<0.01)、DNA[3H-TdR掺入量降至(2 121.4±122.2) min-1,P<0.01]和蛋白合成量[3H-脯氨酸掺入量降至(1 206.0±177.0) min-1,P<0.01]。
表1 AngⅡ促进VSMCs的细胞代谢、DNA和蛋白质合成量
Tab 1 Cellular metabolic level and synthesis of DNA and protein increased by AngⅡ
, 百拇医药
2%FCS
AngⅡ(CB/mol*L-1)
Losartan(CB/mol*L-1)
10-10
10-8
10-7
10-6
10-7
10-6
, 百拇医药 10-5
MTT(Dλ)
0.045±0.014
0.080±0.015* *
0.134±0.021* *
0.170±0.043* *
0.213±0.045* *
0.101±0.009*
0.080±0.005* *
, http://www.100md.com
0.043±0.004* *
3H-TdR(A/Bq)
142.7±3.3
154.7±5.8*
173.3±10.2* *
278.4±10.6* *
309.5±8.0* *
170.6±5.9*
158.0±6.5* *
, 百拇医药
145.5±6.1* *
3H-proline incorporation(A/Bq)
69.2±13.9
85.7±14.2*
104.1±16.0* *
186.6±20.5* *
214.5±24.5* *
135.8±16.9*
95.5±15.4* *
, 百拇医药
73.7±14.8* *
*：P<0.05,* *：P<0.01 vs 2% FCS
2.2.3 VSMCs计数 AngⅡ10-7 mol/L虽然对VSMCs的增殖效应有促进作用，但其计数无明显改变(P>0.05)，而且Losartan或MCP-1 McAb对VSMCs计数也无明显影响(P>0.05)。推测AngⅡ10-7 mol/L在常规培养96 h仅使VSMCs进入细胞周期的G1期、S期和G2期，尚未完成M期，故VSMCs计数无明显变化，见表2。
表2 各组对VSMCs计数的影响
Tab 2 Effects of 2% FCS, AngⅡ and Losartan and MCP-1 McAb on VSMCs count Group
, 百拇医药
VSMCs count(1×104/ml)
P value
2%FCS
3.97±0.90
2%FCS+AngⅡ
4.24±0.92
>0.05
2%FCS+AngⅡ+Losartan
3.99±0.80
>0.05
2%FCS+AngⅡ+MCP-1 McAb
, 百拇医药
3.96±0.90
>0.05
3 讨论
肾素-血管紧张素系统(RAS)是主要的体液调节系统，对血管和机体内环境的稳定起重要作用。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是该系统的重要生物活性肽，它的生理作用主要由AngⅡ受体(AT1)所介导，对VSMCs的短期作用表现为血管收缩；长期作用系促进VSMCs增殖和肥厚，诱导原癌基因(c-myc，c-fos)表达及自分泌生长因子(血小板衍化生长因子PDGF-A，碱性成纤维生长因子bFGF，转化生长因子TGF-β1)，可能与血管重塑(Remodeling)有关[5,6]。
我们的实验结果表明：在AngⅡ10-10～10-6 mol/L浓度或剂量范围内，均能促进VSMCs迁移，而且迁移效应的强度随着AngⅡ浓度的增大而增强，从而提示AngⅡ的浓度或剂量是导致VSMCs由中层迁移至内膜下，并吞噬脂质形成VSMCs源性泡沫细胞的主要因素。VSMCs迁移的主要趋化物质系MCP-1[7]，其生理作用系通过AT1发挥作用的[5]。因此，当采用MCP-1 McAb终浓度10 μg/ml或AT1拮抗剂Losartan 10-7～10-5 mol/L拮抗时，则明显地抑制VSMCs迁移效应，从而为防治或消退动脉粥样硬化提供了一定的理论依据。
, 百拇医药
本实验培养的VSMCs经倒置显微镜形态学和特异性抗平滑肌细胞α-actin单克隆抗体行免疫组化染色鉴定，取培养的第2～5代VSMCs，一部份观察VSMCs迁移试验；另一部分观察VSMCs增殖试验。结果表明，在AngⅡ10-10～10-6 mol/L浓度或剂量范围内，呈剂量依赖性的增加VSMCs内细胞代谢和生长、DNA和蛋白质合成量，然而AngⅡ10-12 mol/L却无上述生物效应。因此低浓度或生理剂量的AngⅡ对维持血管张力是必需的。然而，过多分泌的AngⅡ可使血管收缩，肾脏水钠潴留增加，心脏前后负荷增加；AngⅡ诱导VSMCs自分泌MCP-1，它又作用MCP-1受体CCR2[8]，从而促进VSMCs的增殖与迁移[7]。
我们的实验结果表明，当采用MCP-1 McAb或Losartan均能拮抗AngⅡ介导的VSMCs的增殖与迁移，提示MCP-1 McAb或Losartan在防治动脉硬化性疾病中起着重要的作用。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600041)
作者简介：何作云(1939-)，男，辽宁省大连市人，硕士，主任医师，教授，主要从事动脉硬化血栓性疾病的发病机制与防治方面的研究，发表论文96篇。电话：(023)65220165
参考文献：
[1] 张成武，邹伟文.人白细胞趋化性滤膜测定法及其影响因素[J].中国免疫学杂志，1987，3(4)：365-367.
[2] Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays[J]. J Immunol Methods,1983,65(1):55-63.
, 百拇医药
[3] 王向宇，吴可贵，晋学庆，等.血管紧张素Ⅱ对不同培养条件下自发性大鼠血管平滑肌细胞的影响[J].高血压杂志，1996，4(3)：245-247.
[4] Jimi S, Saku K, Vesugi N, et al. Oxidized low density lipoprotein stimulates collagen production in cultured arterial smooth muscle cells[J]. Atherosclerosis,1995,116(1):15-26.
[5] Gibbons G H, Dzau V J. The emerging concept of vascular remodeling[J]. New Engl J Med,1994,330(4):1 431-1 436.
[6] 王关嵩，钱桂生，黄桂君，等.外源性CO对大鼠肺动脉平滑肌细胞迁移的影响[J].中国应用生理学杂志，2000，16(2)：169-171.
, 百拇医药
[7] Porreca E, Di-Febbo C, Reale M, et al. Monocyte chemotactic protein-1(MCP-1) is a mitogen for cultured rat vascular smooth muscle cells[J]. J Vasc Res,1997,34(1):58-65.
[8] Hayes Z M, Jordan N J, Towers S, et al. Human vascular smooth muscle cells express receptors for CC chemokines[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,1998,18(4):397-403.
收稿日期：2000-01-15；修回日期：2000-05-08, http://www.100md.com
单位：何作云(第三军医大学附属新桥医院心血管内科，重庆 400037)；李爱民(第三军医大学附属新桥医院心血管内科，重庆 400037)
关键词：血管平滑肌细胞；增殖；迁移；单核细胞趋化蛋白-1单克隆抗体
第三军医大学学报000901
提 要： 目的 探讨单核细胞趋化蛋白-1单克隆抗体(MCP-1 McAb)或Losartan拮抗血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)介导的血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖与迁移效应的可能性，为防治动脉硬化(AS)提供一定的理论依据。方法 采用改良的Boyden小室法检测VSMCs的迁移效应；以MTT法、3H-TdR掺入法、3H-脯氨酸标记法和VSMCs计数评价VSMCs的增殖效应；将培养的VSMCs分为5组：2%胎牛血清(2%FCS)组、AngⅡ组(其浓度为10-10～10-6 mol/L)、Losartan组(其浓度为10-7～10-5 mol/L)、MCP-1 McAb组(终浓度为10 μg/ml)和阳性对照组(含5%的酵母多糖活化血清)。结果 ①AngⅡ具有剂量依赖性的促进VSMCs增殖与迁移效应；②MCP-1 McAb或Losartan能有效地拮抗AngⅡ介导的VSMCs增殖与迁移效应。结论 MCP-1 McAb或Losartan对动脉硬化性疾病可能具有较大的应用前景。
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中图法分类号： R322.12;R329.25;R392.11 文献标识码： A
文章编号：1000-5404(2000)09-0815-04
Antagonistic effect of MCP-1 McAb and Losartan on proliferation and migration of Ang-Ⅱ-mediated VSMCs in vitro
HE Zuo-yun
(Department of Cardiology, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China)
LI Ai-min
, 百拇医药
(Department of Cardiology, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China)
Abstract： Objective To study the possibility of monocyte chemotactic protein-1 monoclonal antibody(MCP-1 McAb) or Losartan antagonizing the proliferation and migration of cultured vascular smooth muscle cells (VSMCs) mediated by angiotensin Ⅱ(AngⅡ). Methods The cultured VSMCs were divided into 5 groups, i.e. 2% fetal calf serum group (2%FCS group), AngⅡ group (concentration of 10-10-10-6 mol/L), Losartan group (concentration of 10-7-10-5 mol/L), MCP-1 McAb group(final concentration of 10 μg/ml) and positive control (concentration 5% zymosan). The migration effects of cultured VSMCs were examined by a modified Boyden's chamber. And the proliferation effect was evaluated with MTT, thiazolyl blue intaking, 3H-TdR and 3H-proline incorporation as well as VSMCs count. Results ①AngⅡexerted an enhancing effect on the proliferation and migration of cultured VSMCs in a concentration-dependent manner; ②Both MCP-1 McAb and Losartan could antagonize the proliferation and migration of AngⅡ-mediated VSMCs. Conclusion It is suggested that MCP-1 McAb and Losartan both play predominant roles in inhibiting the proliferation and migration of VSMCs and are prospective in the treatment of atherosclerotic diseases.
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Key words： vascular smooth muscle cells; proliferation; migration; monocyte chemotactic protein-1 monoclonal antibody
近来研究表明血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，AngⅡ)对血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)具有生长激素样作用，在冠状动脉粥样硬化性心脏病和血管成形术后再狭窄等闭塞性血管病变的发生、发展中起着重要作用。本实验目的在于探讨AngⅡ对培养VSMCs增殖与迁移效应的影响，并探讨单核细胞趋化蛋白-1单克隆抗体(Monocyte chemotactic protein-1 monoclonal antibody，MCP-1 McAb)和Losartan拮抗AngⅡ介导的上述生物效应，为防治或消退动脉粥样硬化提供一定的理论依据。
1 材料与方法
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1.1 VSMCs迁移试验 采用改良的Boyden小室法[1]取生长活跃的培养VSMCs(第2～5代)进行实验。0.25%胰蛋白酶消化VSMCs，用含2%胎牛血清(2%FCS)的M199培养液将细胞密度调为1×106/ml，使细胞在培养液中悬浮1 h以恢复形态。混匀细胞悬液，吸取0.35 ml 分别加入Boyden小室的上室内，吸取含2%FCS的M199培养液0.5 ml加入Boyden小室的下室内，此为2%FCS组；下室内分别加入10-10～10-6 mol/L浓度的AngⅡ、10-7～10-5 mol/L的Losartan、5%的酵母多糖活化血清及在上室中加入终浓度为10 μg/ml的MCP-1 McAb，则分别为AngⅡ组、Losartan组、阳性对照组及MCP-1 McAb组，并在Losartan组和MCP-1 McAb组中分别在其下室中加入AngⅡ 10-7 mol/L。封闭下室小孔，置37 ℃，5%二氧化碳孵箱内培养6 h。取出Boyden小室内的微孔滤膜，PBS洗2次，无水乙醇固定10 s以杀死细胞，PBS洗2次后以Harris苏木素染色5 min，蒸馏水冲洗，1%盐酸酒精脱色3 min，流水冲洗，1% NaHCO3显蓝染色3 min。水洗后，37 ℃烤膜过夜，无水乙醇脱水，二甲苯透明，将滤膜上载玻片以中性树胶封片，在显微镜下，计算滤膜下10 μm处随机计数膜内不同层次的VSMCs数，每张膜观察10个高倍视野(10 HF)，计算其总数。双份滤膜内的移动细胞平均数表示VSMCs的迁移效应程度。
, 百拇医药
1.2 VSMCs增殖效应检测
1.2.1细胞生长曲线检测 以MTT法检测[2]2%FCS、F-12HAM培养液对照组、AngⅡ组、Losartan组和MCP-1 McAb组。
1.2.2 VSMCs内DNA和蛋白质合成的检测 以3H-TdR掺入法[3]和3H-脯氨酸标记法[4]检测上述4组的DNA和蛋白质合成量。
1.2.3 VSMCs计数 将细胞密度调整为4×104/ml，以每孔1 ml加入24孔培养板孔中，分别加入2%FCS(2%FCS组)、2%FCS+10-7 mol/L AngⅡ(AngⅡ组)、AngⅡ10-7 mol/L+10-5 mol/L Losartan+2%FCS(Losartan组)和10-7 mol/L AngⅡ+10 μg/ml MCP-1 McAb(MCP-1 McAb组)常规培养96 h后收集细胞，用血球计数板计数各孔VSMCs数量。每组试验重复5次，取其均值。
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1.3 统计学处理
计量资料以
±s表示，采用单因素方差分析比较组间差异的显著性。2 结果
2.1 VSMCs迁移试验结果
2%FCS有少量的VSMCs移动，提示其含有生理量的VSMCs的趋化物质或生长因子；在AngⅡ组中，VSMCs的迁移数量随着AngⅡ浓度由10-10至10-6 mol/L的递增而明显的增加(P<0.01)，见图1；Losartan或MCP-1 McAb均能显著地抑制AngⅡ介导的VSMCs的迁移效应(P<0.01)，见图2。
, 百拇医药
图1 AngⅡ和2%FCS对VSCMs迁移的影响
Fig 1 Effect of AngⅡ and 2%FCS on VSCMs migration
1：Control(2%FCS)；2,3,4,5:10-10,10-8,10-7,10-6 mol/L AngⅡ+2%FCS;*：P<0.05,* *：P<0.01 vs control
图2 Losartan和MCP-1 McAb对VSMCs迁移的影响
Fig 2 Effect of Losartan and MCP-1 McAb on VSCMs migration
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1：Control(AngⅡ10-7 mol/L)；2,4,5：Losartan 10-7,10-6,10-5 mol/L+AngⅡ10-7 mol/L；3：MCP-1 McAb+AngⅡ10-7 mol/L；* *：P<0.01 vs control
2.2 VSMCs增殖试验结果
2.2.1AngⅡ促进VSMCs的细胞代谢、DNA和蛋白质合成
AngⅡ在10-10～10-6 mol/L范围内，呈其浓度或剂量依赖性的增加VSMCs内细胞代谢、DNA和蛋白质合成量，然而AngⅡ10-12 mol/L却无上述效应，见表1。
, 百拇医药 2.2.2 Losartan和MCP-1 McAb抑制VSMCs内细胞代谢、DNA和蛋白质合成 Losartan在10-7～10-5 mol/L范围内，呈剂量依赖性抑制VSMCs内细胞代谢、DNA和蛋白质合成量，见表1。MCP-1 McAb也能明显抑制VSMCs内细胞代谢(对MTT的摄取与代谢，Dλ值降至0.060±0.008,P<0.01)、DNA[3H-TdR掺入量降至(2 121.4±122.2) min-1,P<0.01]和蛋白合成量[3H-脯氨酸掺入量降至(1 206.0±177.0) min-1,P<0.01]。
表1 AngⅡ促进VSMCs的细胞代谢、DNA和蛋白质合成量
Tab 1 Cellular metabolic level and synthesis of DNA and protein increased by AngⅡ
, 百拇医药
2%FCS
AngⅡ(CB/mol*L-1)
Losartan(CB/mol*L-1)
10-10
10-8
10-7
10-6
10-7
10-6
, 百拇医药 10-5
MTT(Dλ)
0.045±0.014
0.080±0.015* *
0.134±0.021* *
0.170±0.043* *
0.213±0.045* *
0.101±0.009*
0.080±0.005* *
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0.043±0.004* *
3H-TdR(A/Bq)
142.7±3.3
154.7±5.8*
173.3±10.2* *
278.4±10.6* *
309.5±8.0* *
170.6±5.9*
158.0±6.5* *
, 百拇医药
145.5±6.1* *
3H-proline incorporation(A/Bq)
69.2±13.9
85.7±14.2*
104.1±16.0* *
186.6±20.5* *
214.5±24.5* *
135.8±16.9*
95.5±15.4* *
, 百拇医药
73.7±14.8* *
*：P<0.05,* *：P<0.01 vs 2% FCS
2.2.3 VSMCs计数 AngⅡ10-7 mol/L虽然对VSMCs的增殖效应有促进作用，但其计数无明显改变(P>0.05)，而且Losartan或MCP-1 McAb对VSMCs计数也无明显影响(P>0.05)。推测AngⅡ10-7 mol/L在常规培养96 h仅使VSMCs进入细胞周期的G1期、S期和G2期，尚未完成M期，故VSMCs计数无明显变化，见表2。
表2 各组对VSMCs计数的影响
Tab 2 Effects of 2% FCS, AngⅡ and Losartan and MCP-1 McAb on VSMCs count Group
, 百拇医药
VSMCs count(1×104/ml)
P value
2%FCS
3.97±0.90
2%FCS+AngⅡ
4.24±0.92
>0.05
2%FCS+AngⅡ+Losartan
3.99±0.80
>0.05
2%FCS+AngⅡ+MCP-1 McAb
, 百拇医药
3.96±0.90
>0.05
3 讨论
肾素-血管紧张素系统(RAS)是主要的体液调节系统，对血管和机体内环境的稳定起重要作用。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是该系统的重要生物活性肽，它的生理作用主要由AngⅡ受体(AT1)所介导，对VSMCs的短期作用表现为血管收缩；长期作用系促进VSMCs增殖和肥厚，诱导原癌基因(c-myc，c-fos)表达及自分泌生长因子(血小板衍化生长因子PDGF-A，碱性成纤维生长因子bFGF，转化生长因子TGF-β1)，可能与血管重塑(Remodeling)有关[5,6]。
我们的实验结果表明：在AngⅡ10-10～10-6 mol/L浓度或剂量范围内，均能促进VSMCs迁移，而且迁移效应的强度随着AngⅡ浓度的增大而增强，从而提示AngⅡ的浓度或剂量是导致VSMCs由中层迁移至内膜下，并吞噬脂质形成VSMCs源性泡沫细胞的主要因素。VSMCs迁移的主要趋化物质系MCP-1[7]，其生理作用系通过AT1发挥作用的[5]。因此，当采用MCP-1 McAb终浓度10 μg/ml或AT1拮抗剂Losartan 10-7～10-5 mol/L拮抗时，则明显地抑制VSMCs迁移效应，从而为防治或消退动脉粥样硬化提供了一定的理论依据。
, 百拇医药
本实验培养的VSMCs经倒置显微镜形态学和特异性抗平滑肌细胞α-actin单克隆抗体行免疫组化染色鉴定，取培养的第2～5代VSMCs，一部份观察VSMCs迁移试验；另一部分观察VSMCs增殖试验。结果表明，在AngⅡ10-10～10-6 mol/L浓度或剂量范围内，呈剂量依赖性的增加VSMCs内细胞代谢和生长、DNA和蛋白质合成量，然而AngⅡ10-12 mol/L却无上述生物效应。因此低浓度或生理剂量的AngⅡ对维持血管张力是必需的。然而，过多分泌的AngⅡ可使血管收缩，肾脏水钠潴留增加，心脏前后负荷增加；AngⅡ诱导VSMCs自分泌MCP-1，它又作用MCP-1受体CCR2[8]，从而促进VSMCs的增殖与迁移[7]。
我们的实验结果表明，当采用MCP-1 McAb或Losartan均能拮抗AngⅡ介导的VSMCs的增殖与迁移，提示MCP-1 McAb或Losartan在防治动脉硬化性疾病中起着重要的作用。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600041)
作者简介：何作云(1939-)，男，辽宁省大连市人，硕士，主任医师，教授，主要从事动脉硬化血栓性疾病的发病机制与防治方面的研究，发表论文96篇。电话：(023)65220165
参考文献：
[1] 张成武，邹伟文.人白细胞趋化性滤膜测定法及其影响因素[J].中国免疫学杂志，1987，3(4)：365-367.
[2] Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays[J]. J Immunol Methods,1983,65(1):55-63.
, 百拇医药
[3] 王向宇，吴可贵，晋学庆，等.血管紧张素Ⅱ对不同培养条件下自发性大鼠血管平滑肌细胞的影响[J].高血压杂志，1996，4(3)：245-247.
[4] Jimi S, Saku K, Vesugi N, et al. Oxidized low density lipoprotein stimulates collagen production in cultured arterial smooth muscle cells[J]. Atherosclerosis,1995,116(1):15-26.
[5] Gibbons G H, Dzau V J. The emerging concept of vascular remodeling[J]. New Engl J Med,1994,330(4):1 431-1 436.
[6] 王关嵩，钱桂生，黄桂君，等.外源性CO对大鼠肺动脉平滑肌细胞迁移的影响[J].中国应用生理学杂志，2000，16(2)：169-171.
, 百拇医药
[7] Porreca E, Di-Febbo C, Reale M, et al. Monocyte chemotactic protein-1(MCP-1) is a mitogen for cultured rat vascular smooth muscle cells[J]. J Vasc Res,1997,34(1):58-65.
[8] Hayes Z M, Jordan N J, Towers S, et al. Human vascular smooth muscle cells express receptors for CC chemokines[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,1998,18(4):397-403.
收稿日期：2000-01-15；修回日期：2000-05-08, http://www.100md.com