外套细胞淋巴瘤细胞周期蛋白D1基因原位检测及病理形态学研究
作者：张广森 肖乐 陈永恒 张新民 戴崇文 周见远
单位：张广森 肖乐 陈永恒 张新民 戴崇文(410011 长沙，湖南医科大学附属第二医院分子血液病研究室)；周见远(美国南加州大学医学院病理科)
关键词：
中华血液学杂志000917 外套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma, MCL)是一种具有特殊病理形态学、特异免疫表型及特征性分子遗传学改变[t(11;14)]的B细胞淋巴瘤。1994年，国际淋巴瘤研究组制定的淋巴组织肿瘤欧美修订分类方案已将MCL作为一种独立的淋巴瘤亚型列出[1]。90年代初，有作者注意到MCL存在细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的过度表达，并认为是MCL特征性的分子遗传学改变[2]。我们用FITC标记的Cyclin D1基因组探针，检测来自于一例MCL患者的肿瘤组织切片中Cyclin D1基因拷贝，并对MCL的组织形态学特点进行分析，现将结果报道如下。
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材料和方法
1 标本来源与制作 MCL的病理切片由美国纽约Memorial医院病理科提供。患者，男，83岁，白种人。由于乏力，左颈部发现肿块2个月就诊。活检左颈部组织肿块(2.0cm×1.8cm×1.0cm)，HE染色，并作免疫表型分析及Cyclin D1基因检测。2例弥漫性非霍奇金淋巴瘤标本，由我院病理科提供，女，年龄分别为38岁和50岁病，取其瘤组织(B细胞)理切片，作为Cyclin D1基因原位检测的阴性对照。
2 免疫表型分析
MCL的免疫表型标记物包括B淋巴细胞标记CD21/1 F8，树突状细胞标记物选用C3d受体及CD21；流式细胞术分析肿瘤组织的免疫表型标记包括CD5，CD10，CD11，CD19，CD20，CD23，CD25。上述免疫表型分析在Memorial医院完成。2例非霍奇金淋巴瘤病理切片均进行CD20(B淋巴细胞标记)、CD45RO(T淋巴细胞标记)免疫组化分析。
, 百拇医药
3 原位杂交(FISH)检测Cyclin D1基因
3.1 材料：生物素标记的人Cyclin D1基因组DNA(全长18kb)被插入粘性质粒载体；Cot-1基因重复序列DNA(阻断受检标本中非Cyclin D1基因的非特异性DNA重复序列)由美国南加洲大学医学院病理科制备。FITC-标记的卵白素(Avidin)，Anti-avidin抗体，DAPI/antifade，蛋白酶K等试剂来自Oncor公司。
3.2 Cyclin D1基因检测方法
3.2.1 切片处理：按常规的FISH操作程序进行。
3.2.2 探针处理及杂交：取1μg Cyclin D1探针加20μg Cot-1 DNA，混合后加1/10体积的3mol/L醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇，-70℃沉淀30min，离心，用体积分数为75%乙醇洗涤DNA，加入20μl杂交液与DNA混合，置78℃水浴中变性10min，冰上骤冷，37℃复温。然后将变性的探针滴到变性的病理切片上，37℃湿盒恒温箱中孵育16～18h后，加0.3% NP-40/2×SSC液，73℃洗涤3min，增强Cyclin D1的荧光信号。
, 百拇医药
4 结果判定：非MCL淋巴瘤，细胞内存在2个黄绿色荧光点，反映位于2条11号染色体上的Cyclin D1基因；MCL病理切片上，荧光点数目增多，与正常比较，超过荧光点数1.5倍，判定为Cyclin D1基因过表达。
结果
1 病理形态学特征 瘤细胞呈弥漫性增生浸润，淋巴结正常结构消失，瘤细胞呈中等到大淋巴样细胞大小，胞浆少，核形不规则，呈中心细胞样，核染色质较粗，核仁不明显(图1)。
图1 瘤细胞由中等大小和大淋巴样细胞构成，核外形不规则，呈明显多形性 HE染色，×1000
2 免疫表型特点 本例MCL的B淋巴细胞标记CD21/1F8阳性；树突状细胞标志(C3d受体,CD21)呈阳性；流式细胞术分析证实淋巴瘤标本中80%有核细胞为单克隆B淋巴细胞群,受检细胞表达中等强度单克隆κ轻链信号;其它免疫表型呈现出CD5+,CD10-，CD11C弱阳性，CD19+，CD20+，CD23-，CD25+，2例非MCL对照显示CD20+，CD45RO-。
, 百拇医药
3 Cyclin D1基因表达 对照组非MCL原位杂交结果显示每个细胞内存在2个荧光点。而在MCL切片中，瘤细胞内存在多个荧光信号，有些细胞内可达10～20个。随机计数20个瘤细胞内的荧光点，MCL平均荧光信号为8个/细胞；在对照组，平均荧光信号为1.9个/细胞。比值为4.2，提示MCL细胞存在Cyclin D1基因的过度表达(图2，3)。
图2 FISH技术显示瘤细胞内绿色荧光信号明显增多，反映Cyclin D1基因拷贝数增多 ×1000
图3 非MCL淋巴瘤病理切片(阴性对照)FISH技术显示瘤细胞内只有2个荧光信号 ×1000
, 百拇医药 讨论
仅依形态学，外套细胞淋巴瘤容易与其它B细胞性淋巴瘤混淆。九十年代以来，由于免疫学及分子遗传学技术的发展，揭示出MCL具有独特的免疫表型特点，从而提出将MCL作为淋巴瘤的一种类型而单独列出。Ott等将MCL分为3种亚型：①中央细胞型；②原始淋巴细胞型；③变异型[3]。本例MCL在形态学上应归于变异型MCL。其细胞学特点也与Zoldan等[4]报道的大细胞变异型MCL符合。这类淋巴瘤多伴有p53基因异常，瘤细胞增殖速度快，临床呈进行性恶化趋势，预后差。
MCL的免疫表型分析有助于诊断的确定，一般认为CD5+有助于MCL与滤泡中心型或边缘区非霍奇金淋巴瘤之间的鉴别[5,6]。本例的免疫表型不仅呈现出CD5+，CD10-，CD23-，而且也显示了部分瘤细胞呈树突状细胞分化特征，即C3d受体及CD21阳性。
, 百拇医药
染色体t(11,14)(q13,q32)是MCL特征性的细胞遗传学改变。Cyclin D1系一种与细胞周期调控有关的核蛋白，它在G1周期的早期被合成，对于控制细胞周期进程及G1/S期时相的转换发挥重要作用[7]。Cyclin D1的过表达授予MCL瘤细胞以明显增殖优势，并成为MCL区别于其它类型淋巴瘤的分子标志。我们用FISH技术，分析MCL组织切片中的Cyclin D1基因表达，靶向性高，可以较准确地定量基因扩增拷贝数，结果判断较之所报道的方法更为客观、可信。
志谢 诚挚地感谢美国纽约Memorial医院病理科医生夏锦如博士提供的病理切片及MCL病理诊断的审定
参 考 文 献
1，Harris NL, Jaffe ES, Stain H, et al. A revised Eruopean-American classification of lymphoid neoplasms: a proposal from the international lymphoma study group. Blood, 1994,84:1361-1392.
, http://www.100md.com
2，Rimokh R, Berger F, Delsol G, et al. Rearrangement and overexpression of the BCL-1/PRAD-1 gene in intermediate lymphocytic lymphoma and in t(11q13)-bearing leukemia. Blood, 1993,81:3063-3067.
3，Ott MM, Ott G, Kuse R, et al. The anyaplastic variant of centrocytic lymphoma is marked by frequent rearrangement of the bcl-1 gene and high proliferation indices. Histopathology, 1994,24:329-334.
4，Zoldan MC, Inghirami G, Masuda Y, et al. Large-cell variants of mantle cell lymphoma: cytologic characteristics and p53 anomalies may predict poor outcome. Br J Hemaetol, 1996,93:475-486.
, http://www.100md.com
5，戴崇文,张广森.具t(11,14)特征的外套细胞淋巴瘤与Cyclin D1表达失调调节网络.国外医学*输血及血液学分册,1999,22:6-9.
6，Ott G, Kalla J, Ott MM, et al. Blastoid variants of mantle cell lymphoma: frequent bcl-1 rearrangements at the major translocation cluster region and tetraploid chromosome clones. Blood, 1997,89:1421-1429.
7，Resnitzky D, Gossen M, Bujard H, et al. Acceleration of the G1/S phase transition by expression of Cyclin D1 and E with an inducible system. Molecular Cellular Biology, 1994,14:1669-1679.
(本文图1～3见插页图3)
(收稿日期：1999-08-12), 百拇医药
单位：张广森 肖乐 陈永恒 张新民 戴崇文(410011 长沙，湖南医科大学附属第二医院分子血液病研究室)；周见远(美国南加州大学医学院病理科)
关键词：
中华血液学杂志000917 外套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma, MCL)是一种具有特殊病理形态学、特异免疫表型及特征性分子遗传学改变[t(11;14)]的B细胞淋巴瘤。1994年，国际淋巴瘤研究组制定的淋巴组织肿瘤欧美修订分类方案已将MCL作为一种独立的淋巴瘤亚型列出[1]。90年代初，有作者注意到MCL存在细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的过度表达，并认为是MCL特征性的分子遗传学改变[2]。我们用FITC标记的Cyclin D1基因组探针，检测来自于一例MCL患者的肿瘤组织切片中Cyclin D1基因拷贝，并对MCL的组织形态学特点进行分析，现将结果报道如下。
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材料和方法
1 标本来源与制作 MCL的病理切片由美国纽约Memorial医院病理科提供。患者，男，83岁，白种人。由于乏力，左颈部发现肿块2个月就诊。活检左颈部组织肿块(2.0cm×1.8cm×1.0cm)，HE染色，并作免疫表型分析及Cyclin D1基因检测。2例弥漫性非霍奇金淋巴瘤标本，由我院病理科提供，女，年龄分别为38岁和50岁病，取其瘤组织(B细胞)理切片，作为Cyclin D1基因原位检测的阴性对照。
2 免疫表型分析
MCL的免疫表型标记物包括B淋巴细胞标记CD21/1 F8，树突状细胞标记物选用C3d受体及CD21；流式细胞术分析肿瘤组织的免疫表型标记包括CD5，CD10，CD11，CD19，CD20，CD23，CD25。上述免疫表型分析在Memorial医院完成。2例非霍奇金淋巴瘤病理切片均进行CD20(B淋巴细胞标记)、CD45RO(T淋巴细胞标记)免疫组化分析。
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3 原位杂交(FISH)检测Cyclin D1基因
3.1 材料：生物素标记的人Cyclin D1基因组DNA(全长18kb)被插入粘性质粒载体；Cot-1基因重复序列DNA(阻断受检标本中非Cyclin D1基因的非特异性DNA重复序列)由美国南加洲大学医学院病理科制备。FITC-标记的卵白素(Avidin)，Anti-avidin抗体，DAPI/antifade，蛋白酶K等试剂来自Oncor公司。
3.2 Cyclin D1基因检测方法
3.2.1 切片处理：按常规的FISH操作程序进行。
3.2.2 探针处理及杂交：取1μg Cyclin D1探针加20μg Cot-1 DNA，混合后加1/10体积的3mol/L醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇，-70℃沉淀30min，离心，用体积分数为75%乙醇洗涤DNA，加入20μl杂交液与DNA混合，置78℃水浴中变性10min，冰上骤冷，37℃复温。然后将变性的探针滴到变性的病理切片上，37℃湿盒恒温箱中孵育16～18h后，加0.3% NP-40/2×SSC液，73℃洗涤3min，增强Cyclin D1的荧光信号。
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4 结果判定：非MCL淋巴瘤，细胞内存在2个黄绿色荧光点，反映位于2条11号染色体上的Cyclin D1基因；MCL病理切片上，荧光点数目增多，与正常比较，超过荧光点数1.5倍，判定为Cyclin D1基因过表达。
结果
1 病理形态学特征 瘤细胞呈弥漫性增生浸润，淋巴结正常结构消失，瘤细胞呈中等到大淋巴样细胞大小，胞浆少，核形不规则，呈中心细胞样，核染色质较粗，核仁不明显(图1)。
图1 瘤细胞由中等大小和大淋巴样细胞构成，核外形不规则，呈明显多形性 HE染色，×1000
2 免疫表型特点 本例MCL的B淋巴细胞标记CD21/1F8阳性；树突状细胞标志(C3d受体,CD21)呈阳性；流式细胞术分析证实淋巴瘤标本中80%有核细胞为单克隆B淋巴细胞群,受检细胞表达中等强度单克隆κ轻链信号;其它免疫表型呈现出CD5+,CD10-，CD11C弱阳性，CD19+，CD20+，CD23-，CD25+，2例非MCL对照显示CD20+，CD45RO-。
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3 Cyclin D1基因表达 对照组非MCL原位杂交结果显示每个细胞内存在2个荧光点。而在MCL切片中，瘤细胞内存在多个荧光信号，有些细胞内可达10～20个。随机计数20个瘤细胞内的荧光点，MCL平均荧光信号为8个/细胞；在对照组，平均荧光信号为1.9个/细胞。比值为4.2，提示MCL细胞存在Cyclin D1基因的过度表达(图2，3)。
图2 FISH技术显示瘤细胞内绿色荧光信号明显增多，反映Cyclin D1基因拷贝数增多 ×1000
图3 非MCL淋巴瘤病理切片(阴性对照)FISH技术显示瘤细胞内只有2个荧光信号 ×1000
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仅依形态学，外套细胞淋巴瘤容易与其它B细胞性淋巴瘤混淆。九十年代以来，由于免疫学及分子遗传学技术的发展，揭示出MCL具有独特的免疫表型特点，从而提出将MCL作为淋巴瘤的一种类型而单独列出。Ott等将MCL分为3种亚型：①中央细胞型；②原始淋巴细胞型；③变异型[3]。本例MCL在形态学上应归于变异型MCL。其细胞学特点也与Zoldan等[4]报道的大细胞变异型MCL符合。这类淋巴瘤多伴有p53基因异常，瘤细胞增殖速度快，临床呈进行性恶化趋势，预后差。
MCL的免疫表型分析有助于诊断的确定，一般认为CD5+有助于MCL与滤泡中心型或边缘区非霍奇金淋巴瘤之间的鉴别[5,6]。本例的免疫表型不仅呈现出CD5+，CD10-，CD23-，而且也显示了部分瘤细胞呈树突状细胞分化特征，即C3d受体及CD21阳性。
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染色体t(11,14)(q13,q32)是MCL特征性的细胞遗传学改变。Cyclin D1系一种与细胞周期调控有关的核蛋白，它在G1周期的早期被合成，对于控制细胞周期进程及G1/S期时相的转换发挥重要作用[7]。Cyclin D1的过表达授予MCL瘤细胞以明显增殖优势，并成为MCL区别于其它类型淋巴瘤的分子标志。我们用FISH技术，分析MCL组织切片中的Cyclin D1基因表达，靶向性高，可以较准确地定量基因扩增拷贝数，结果判断较之所报道的方法更为客观、可信。
志谢 诚挚地感谢美国纽约Memorial医院病理科医生夏锦如博士提供的病理切片及MCL病理诊断的审定
参 考 文 献
1，Harris NL, Jaffe ES, Stain H, et al. A revised Eruopean-American classification of lymphoid neoplasms: a proposal from the international lymphoma study group. Blood, 1994,84:1361-1392.
, http://www.100md.com
2，Rimokh R, Berger F, Delsol G, et al. Rearrangement and overexpression of the BCL-1/PRAD-1 gene in intermediate lymphocytic lymphoma and in t(11q13)-bearing leukemia. Blood, 1993,81:3063-3067.
3，Ott MM, Ott G, Kuse R, et al. The anyaplastic variant of centrocytic lymphoma is marked by frequent rearrangement of the bcl-1 gene and high proliferation indices. Histopathology, 1994,24:329-334.
4，Zoldan MC, Inghirami G, Masuda Y, et al. Large-cell variants of mantle cell lymphoma: cytologic characteristics and p53 anomalies may predict poor outcome. Br J Hemaetol, 1996,93:475-486.
, http://www.100md.com
5，戴崇文,张广森.具t(11,14)特征的外套细胞淋巴瘤与Cyclin D1表达失调调节网络.国外医学*输血及血液学分册,1999,22:6-9.
6，Ott G, Kalla J, Ott MM, et al. Blastoid variants of mantle cell lymphoma: frequent bcl-1 rearrangements at the major translocation cluster region and tetraploid chromosome clones. Blood, 1997,89:1421-1429.
7，Resnitzky D, Gossen M, Bujard H, et al. Acceleration of the G1/S phase transition by expression of Cyclin D1 and E with an inducible system. Molecular Cellular Biology, 1994,14:1669-1679.
(本文图1～3见插页图3)
(收稿日期：1999-08-12), 百拇医药