急性白血病患者酪氨酸激酶基因BMX表达及其临床意义
作者：李栋梁 宣宝和 张静 余裕炉 张建平
单位：李栋梁 宣宝和 余裕炉 张建平(050082 石家庄，解放军白求恩国际和平医院)；张静(解放军第二六○医院)
关键词：
中华血液学杂志000916 酪氨酸激酶(TK)是造血细胞信号传导的主要成分，在调节细胞增殖及分化方面具有重要意义，其异常高表达与多种造血系统肿瘤的发生有关。BMX是在人骨髓细胞RNA中发现的一种新的非受体TK基因，定位于染色体Xp22.2，其mRNA长度2.7kb，编码一相对分子质量为80×103的蛋白质[1]。我们应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测了34例急性白血病患者的BMX基因表达水平，并将检测结果与某些临床指标作相关性分析，以探讨此基因表达在白血病发病中的作用及临床意义。
病例和方法
, 百拇医药
1 研究对象 初诊急性白血病患者34例，其中急性髓系白血病(AML)25例(M1 3例、M2 5例、M3 4例、M4 5例、M5 6例、M6 2例)，急性淋巴细胞白血病(ALL)9例。男21例，女13例。年龄13～71岁，平均39岁。正常对照10名，男5名，女5名，年龄21～59岁，平均34岁。
2 引物合成 根据BMX基因序列[2]设计合成的引物顺序如下：有义链5′-AACATGCAGTATATTCCA-3′,反义链5′-AGAGGAAAACCTGGATG-3′。此为对应于BMX基因SH3序列的特异性引物，扩增片段长度188bp[3]。实验设内对照为β2微球蛋白(β2M)基因引物顺序为：有义链5′-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3′, 反义链5′-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3′,此扩增片段为120bp[3]。上述引物由北京赛百盛生物公司合成并纯化。
, 百拇医药
3 骨髓细胞总RNA提取 取骨髓液2ml,肝素抗凝，生理盐水稀释4倍后，加入4～5ml Ficoll淋巴细胞分离液，取界面层单个核细胞, 然后按基因释放(Gene ReleaserTM)试剂盒说明书提取骨髓细胞总RNA。
4 半定量RT-PCR
4.1 逆转录反应：取1.0μg细胞总RNA，20pmol随机引物，加入反应液(含逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP、Mg2+、缓冲液)管内，补加去离子水至20μl。57℃ 10min，42℃ 60min，94℃ 5min，4℃保存备用。
4.2 聚合酶链反应：取逆转录产物5μl,20pmol BMX或β2M引物,加入反应液(含Taq DNA聚合酶、dNTP、Mg2+等)管内，补加去离子水至50μl。94℃预变性5min后，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环30次。
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4.3 半定量分析：取PCR产物5μl行20g/L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶在紫外灯下观察并照相，并用Eagle EyeⅡ凝胶系统计算机分析仪(Stratagene公司生产)对电泳条带行半定量分析。
5 统计学处理 t检验，相关分析。
结果
1 正常对照BMX基因的表达 以BMX/β2M表示BMX的相对表达水平。10名正常对照均扩增出特异性BMX和β2M片段，BMX/β2M为0.70±0.04 。取BMX/β2M=0.70作为BMX基因相对正常表达值。
2 白血病患者BMX的表达 25例初诊AML患者均扩增出特异性BMX及β2M 基因片段，其BMX/β2M为1.33±0.58, 较正常对照组明显增高(P<0.05);而9例ALL患者均未扩出特异性BMX基因片段(图1)。
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M：分子量标志；1，2，3：BMX(188bp)及β2M(120bp) mRNA表达产物；
4，5：仅为BMX(188bp)的高表达产物
图1 AML的BMX序列RT-PCR结果
3 BMX基因表达与AML临床特征的关系 将25例AML患者分为BMX/β2M<1.0和>1.0两组,BMX/β2M<1.0 11例，其中7例经化疗达CR(63.6%); BMX/β2M>1.0 14例，5例经化疗达CR(35.7%)，两组间CR率差异有显著性(P<0.05)。两组患者的年龄，出血情况，肝、脾、淋巴结肿大，外周血白细胞计数及幼稚细胞数，骨髓原始(幼稚)细胞数，FAB分型等临床指标之间差异无显著性。对4例AML患者化疗前后BMX表达水平进行了动态观察，其中2例化疗前BMX表达均<1.0，化疗达CR后表达仍<1.0，发病至今已分别为13，18个月，仍处于CR期；1例化疗前BMX表达为1.53，化疗后CR时降为1.12，但4个月后复发时升至1.75，经化疗未缓解而死亡；另1例化疗前BMX表达为1.68，化疗后未缓解，此时表达值为1.59，最终死亡。
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讨论
TK家族通常分为受体和非受体两类。非受体类TK参与细胞内信号传递，它包括4个相互独立的成员TEC、BTK、TXK及ITK，分别表达于造血干细胞、B及T淋巴细胞。BMX与上述4种非受体TK的序列70%同源，其上游区均含有SH3和SH2序列，除TXK外其它成员还含一个PH序列。BMX SH3序列的C-末端与其它TK不同，它含有两个富含丝氨酸和谷氨酸残基的亲水区，是BMX区别于其它非受体TK的一大特征[1]。对以上4种非受体TK在白血病中的表达有较多报道[5-8]，而对BMX基因表达与白血病关系的研究甚少[3]。我们采用半定量RT-PCR方法测定了急性白血病BMX基因的相对表达水平，结果表明,AML患者的表达水平显著高于正常对照，而ALL无此基因表达,提示BMX基因表达是AML的一种重要分子标志。BMX基因表达与AML某些临床指标的相关性分析显示，表达减低者较增高者的CR率高。动态观察4例AML患者，CR时该基因表达减低，复发时表达又增高；未达CR者表达水平较化疗前无显著降低，表明部分AML的发病机制可能与BMX基因异常表达引起造血细胞恶性转化有关，并提示该基因表达水平显著增高与AML的预后不良有一定关系，但由于观察例数较少，明确的结论及其机制尚须深入研究。
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参 考 文 献
1，Tamagnone L,Lahtinen I,Mustonen T,et al.BMX,a novel nonreceptor tyrosine kinase gene of the BTK/ITK/TEC/TXK family located in chromosome Xp22.2.Oncogene,1994,9:3683-3688.
2，Ekman N,Lymboussaki A,Vastrik I,et al. BMX tyrosine kinase is specifically expressed in the endocardium and the endothelum of large arteries.Circulation,1997,96:1729-1732.
3，Kaukonen J,Lahtinen I,Laine S,et al.BMX tyrosine kinase gene is expressed in granulocytes and myeloid leukemias.Br J Haematol,1996,94:455-460.
, 百拇医药
4，Noonan KE,Beck C,Holzmayer TA, et al.Quantitative analysis of MDRI gene expression in human tumors by PCR. Proc Natl Acad Sci U S A,1990,87:7160-7164.
5，Mano H, Mano K, Tank B, et al. Expression of a novel form of Tec kinase in hematopoietic cells and mapping of the gene to chromosome 5 near kit. Oncogene, 1993, 8:417-424.
6，Yamada N, Kawakami Y, Kimura H, et al. Structure and expression of novel protein-tyrosine kinase, Emb and Emt, in hematopoietic cells. Biochem Biophys Res Commun,1993, 92:231-240.
, 百拇医药
7，Haire RN, Ohta Y, Lewis JE, et al. TXK, a novel human tyrosine kinase expressed in T-cells shaves sequence indentity with Tec family kinase and maps to 4q12. Hum Mol Genet, 1994, 3:897-901.
8，SiciLiano JD, Morrow TA, Desiderio SV. Itk, a T-cell-specific tyrosine kinase gene inducible by interleukin 2. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992, 89:11194-11198.
(收稿日期：1999-06-14), http://www.100md.com
单位：李栋梁 宣宝和 余裕炉 张建平(050082 石家庄，解放军白求恩国际和平医院)；张静(解放军第二六○医院)
关键词：
中华血液学杂志000916 酪氨酸激酶(TK)是造血细胞信号传导的主要成分，在调节细胞增殖及分化方面具有重要意义，其异常高表达与多种造血系统肿瘤的发生有关。BMX是在人骨髓细胞RNA中发现的一种新的非受体TK基因，定位于染色体Xp22.2，其mRNA长度2.7kb，编码一相对分子质量为80×103的蛋白质[1]。我们应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测了34例急性白血病患者的BMX基因表达水平，并将检测结果与某些临床指标作相关性分析，以探讨此基因表达在白血病发病中的作用及临床意义。
病例和方法
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1 研究对象 初诊急性白血病患者34例，其中急性髓系白血病(AML)25例(M1 3例、M2 5例、M3 4例、M4 5例、M5 6例、M6 2例)，急性淋巴细胞白血病(ALL)9例。男21例，女13例。年龄13～71岁，平均39岁。正常对照10名，男5名，女5名，年龄21～59岁，平均34岁。
2 引物合成 根据BMX基因序列[2]设计合成的引物顺序如下：有义链5′-AACATGCAGTATATTCCA-3′,反义链5′-AGAGGAAAACCTGGATG-3′。此为对应于BMX基因SH3序列的特异性引物，扩增片段长度188bp[3]。实验设内对照为β2微球蛋白(β2M)基因引物顺序为：有义链5′-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3′, 反义链5′-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3′,此扩增片段为120bp[3]。上述引物由北京赛百盛生物公司合成并纯化。
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3 骨髓细胞总RNA提取 取骨髓液2ml,肝素抗凝，生理盐水稀释4倍后，加入4～5ml Ficoll淋巴细胞分离液，取界面层单个核细胞, 然后按基因释放(Gene ReleaserTM)试剂盒说明书提取骨髓细胞总RNA。
4 半定量RT-PCR
4.1 逆转录反应：取1.0μg细胞总RNA，20pmol随机引物，加入反应液(含逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP、Mg2+、缓冲液)管内，补加去离子水至20μl。57℃ 10min，42℃ 60min，94℃ 5min，4℃保存备用。
4.2 聚合酶链反应：取逆转录产物5μl,20pmol BMX或β2M引物,加入反应液(含Taq DNA聚合酶、dNTP、Mg2+等)管内，补加去离子水至50μl。94℃预变性5min后，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环30次。
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4.3 半定量分析：取PCR产物5μl行20g/L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶在紫外灯下观察并照相，并用Eagle EyeⅡ凝胶系统计算机分析仪(Stratagene公司生产)对电泳条带行半定量分析。
5 统计学处理 t检验，相关分析。
结果
1 正常对照BMX基因的表达 以BMX/β2M表示BMX的相对表达水平。10名正常对照均扩增出特异性BMX和β2M片段，BMX/β2M为0.70±0.04 。取BMX/β2M=0.70作为BMX基因相对正常表达值。
2 白血病患者BMX的表达 25例初诊AML患者均扩增出特异性BMX及β2M 基因片段，其BMX/β2M为1.33±0.58, 较正常对照组明显增高(P<0.05);而9例ALL患者均未扩出特异性BMX基因片段(图1)。
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M：分子量标志；1，2，3：BMX(188bp)及β2M(120bp) mRNA表达产物；
4，5：仅为BMX(188bp)的高表达产物
图1 AML的BMX序列RT-PCR结果
3 BMX基因表达与AML临床特征的关系 将25例AML患者分为BMX/β2M<1.0和>1.0两组,BMX/β2M<1.0 11例，其中7例经化疗达CR(63.6%); BMX/β2M>1.0 14例，5例经化疗达CR(35.7%)，两组间CR率差异有显著性(P<0.05)。两组患者的年龄，出血情况，肝、脾、淋巴结肿大，外周血白细胞计数及幼稚细胞数，骨髓原始(幼稚)细胞数，FAB分型等临床指标之间差异无显著性。对4例AML患者化疗前后BMX表达水平进行了动态观察，其中2例化疗前BMX表达均<1.0，化疗达CR后表达仍<1.0，发病至今已分别为13，18个月，仍处于CR期；1例化疗前BMX表达为1.53，化疗后CR时降为1.12，但4个月后复发时升至1.75，经化疗未缓解而死亡；另1例化疗前BMX表达为1.68，化疗后未缓解，此时表达值为1.59，最终死亡。
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讨论
TK家族通常分为受体和非受体两类。非受体类TK参与细胞内信号传递，它包括4个相互独立的成员TEC、BTK、TXK及ITK，分别表达于造血干细胞、B及T淋巴细胞。BMX与上述4种非受体TK的序列70%同源，其上游区均含有SH3和SH2序列，除TXK外其它成员还含一个PH序列。BMX SH3序列的C-末端与其它TK不同，它含有两个富含丝氨酸和谷氨酸残基的亲水区，是BMX区别于其它非受体TK的一大特征[1]。对以上4种非受体TK在白血病中的表达有较多报道[5-8]，而对BMX基因表达与白血病关系的研究甚少[3]。我们采用半定量RT-PCR方法测定了急性白血病BMX基因的相对表达水平，结果表明,AML患者的表达水平显著高于正常对照，而ALL无此基因表达,提示BMX基因表达是AML的一种重要分子标志。BMX基因表达与AML某些临床指标的相关性分析显示，表达减低者较增高者的CR率高。动态观察4例AML患者，CR时该基因表达减低，复发时表达又增高；未达CR者表达水平较化疗前无显著降低，表明部分AML的发病机制可能与BMX基因异常表达引起造血细胞恶性转化有关，并提示该基因表达水平显著增高与AML的预后不良有一定关系，但由于观察例数较少，明确的结论及其机制尚须深入研究。
, 百拇医药
参 考 文 献
1，Tamagnone L,Lahtinen I,Mustonen T,et al.BMX,a novel nonreceptor tyrosine kinase gene of the BTK/ITK/TEC/TXK family located in chromosome Xp22.2.Oncogene,1994,9:3683-3688.
2，Ekman N,Lymboussaki A,Vastrik I,et al. BMX tyrosine kinase is specifically expressed in the endocardium and the endothelum of large arteries.Circulation,1997,96:1729-1732.
3，Kaukonen J,Lahtinen I,Laine S,et al.BMX tyrosine kinase gene is expressed in granulocytes and myeloid leukemias.Br J Haematol,1996,94:455-460.
, 百拇医药
4，Noonan KE,Beck C,Holzmayer TA, et al.Quantitative analysis of MDRI gene expression in human tumors by PCR. Proc Natl Acad Sci U S A,1990,87:7160-7164.
5，Mano H, Mano K, Tank B, et al. Expression of a novel form of Tec kinase in hematopoietic cells and mapping of the gene to chromosome 5 near kit. Oncogene, 1993, 8:417-424.
6，Yamada N, Kawakami Y, Kimura H, et al. Structure and expression of novel protein-tyrosine kinase, Emb and Emt, in hematopoietic cells. Biochem Biophys Res Commun,1993, 92:231-240.
, 百拇医药
7，Haire RN, Ohta Y, Lewis JE, et al. TXK, a novel human tyrosine kinase expressed in T-cells shaves sequence indentity with Tec family kinase and maps to 4q12. Hum Mol Genet, 1994, 3:897-901.
8，SiciLiano JD, Morrow TA, Desiderio SV. Itk, a T-cell-specific tyrosine kinase gene inducible by interleukin 2. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992, 89:11194-11198.
(收稿日期：1999-06-14), http://www.100md.com