叶绿素光敏剂诱导大鼠脑梗死模型
叶绿素光敏剂诱导大鼠脑梗死模型
徐莉 李玲 陈景藻 施新猷 郭振援 王斌 袁华 易南
摘 要： 目的 观察光敏剂叶绿素光化学诱导的大鼠脑梗死模型. 方法 大鼠60只随机分为8组：单纯光照组，单纯光敏剂组及6组不同光敏剂浓度(10, 20, 30, 40, 50和60 mg.kg-1)的光化学诱导组，不同的光敏剂浓度光化学诱导组给予静脉注射叶绿素衍生物四号(chlorophyll derivative IV, CPD4) 10 min后，He-Ne激光照射左侧大脑上下肢感觉、运动区，24 h后观察其神经行为学、梗死面积及组织病理学改变，以评估模型的可行性. 结果 CPD4 40, 50 mg.kg-1经He-Ne激光照射，可诱导大鼠脑梗死，且面积恒定，神经行为学评分及病理形态学改变明显. 结论 CPD4诱导的大鼠脑梗死模型稳定性，重复性好，梗死成功率高.
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关键词：叶绿素衍生物；大鼠；光化学法；激光；脑梗死
0 引言
在实验中，理想的动物模型是研究的关键，我们采用叶绿素衍生物四号作光敏剂，氦氖(He-Ne)激光作光源，制做光化学诱导的脑梗死模型，并计算梗死面积，进行神经功能评估及病理学方面的观察.
1 材料和方法
1.1 材料 CPD4粉剂由杭州民生药厂提供，批号930502于0～4℃避光保存，使用前用生理盐水稀释至所需浓度. 雄性SD大鼠，由本校实验动物中心提供，体质量(240±50) g，鼠龄12 wk左右，二级动物. 采用西安激光仪器厂生产的795B型氦氖激光双管治疗机，输出波长632.8 nm(可见红光)，采用原光束双管照射，输出功率8 mW.
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 动物分组 单纯光照组6只;单纯光敏剂组6只;光敏剂浓度为50 mg.kg-1;实验组按光敏剂的浓度分组：10 mg.kg-1组6只；20 mg.kg-1组6只；30 mg.kg-1组6只；40 mg.kg-1组10只；50 mg.kg-1组10只；60 mg.kg-1组10只.
1.2.2 模型制作方法 大鼠10 g.L-1戊巴比妥钠ip麻醉，尾iv CPD4后10 min内，将鼠俯卧位于脑立体固定仪上，沿头颅正中线偏右切开头皮暴露颅骨前沿部位，在前囟门后1.8 mm，正中线旁开约2 mm，即脑上下肢皮层感觉运动区，用黑色避光纸(中央有一8 mm×5 mm的小孔)遮避周围组织，He-Ne激光照射20 min，术后缝合头皮，避光24 h.
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1.2.3 神经症状评定 造模后24 h，按Bederson等[1]人制定的标准评分，共分4级. 0级：未见行为缺陷;1级：前肢屈曲(既提尾悬空试验阳性);2级：侧推抵抗力下降(即侧向推力试验阳性)，伴前肢屈曲，无转圈行为；3级：同2级行为，伴自发性悬转.
1.2.4 观察、取材及处理 实验后24 h进行Bederson神经功能评估，然后灌注取材，100 mL.L-1福尔马林液固定，在视交叉前后每间隔2 mm做6个脑冠状切片，进行计算机扫描，利用灰度对比，Photoshop软件图像处理计算梗死面积，然后石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察组织学变化.
统计学处理： 所有数据以X±s表示，组间比较采用两样本t检验.
2 结果
2.1 神经行为学改变 造模后24 h进行神经行为学评分，40, 50和60 mg.kg-1光化学诱导组的大鼠造模后24 h内有呃逆，呕吐等颅内高压征象，尤以60 mg.kg-1组的大鼠呕吐分泌物多，呼吸道易堵塞，神志极差，多在脑梗死后6～8 h内死亡. 脑梗死面积的测量 造模后24 h取材，经扫描仪扫描，计算机图像处理，结果表明，单纯光照组，单纯光敏剂，10 mg.kg-1组无明显梗死灶，20及30 mg.kg-1组仅有皮层表浅的梗死灶，40及50 mg.kg-1组有明显的梗死灶. 药物浓度与神经学评分及梗死面积关系如Fig 1, 2所示.
, 百拇医药
2.2 脑组织病理学改变 HE染色，光镜下单纯光照组，单光敏剂组无明显改变. 10 mg.kg-1组有个别神经元细胞固缩，其他大部分正常， 20， 30 mg.kg-1组可见小的缺血病灶区有神经元固缩，胞质红染，其余正常(Fig 1, 2). 40 mg.kg-1组局部脑组织有梗死灶，神经细胞固缩胞质红染，周围胶质癍痕形成，海马区有退变. 50 mg.kg-1组可见明显的梗死灶，灶区细胞变性坏死，神经元细胞肿胀或固缩，有的溶解消失，梗死区有小灶的中性粒细胞浸润(Fig 3, 4).
图1 单光照组细胞形态
, 百拇医药
Fig 1 Cell morphology in light group HE ×400
图2 单光敏组细胞形态
Fig 2 Cell morphology in group treated with photoseneitizing only HE ×400
图3 50 mg.kg-1组细胞形态
, 百拇医药 Fig 3 Cell morphology in 50 mg.kg-1 group HE ×200
图4 50 mg.kg-1组细胞形态
Fig 4 Cell morphology in 50 mg.kg-1 group HE ×400
3 讨论
国内外有不少造模方法有创伤大，需开颅，易感染，难以控制梗死面积等缺点； 光化学法诱导的脑梗死动物模型是1985年由Watson等[2]首先报道，其原理是注入动物体内的光敏染料，在特定波长的光源照射下，产生并释放单态氧，使血管内皮细胞膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，膜通透性增加，导致血管内皮损害，诱发血小板聚集，光照区血管内血栓形成，局部脑组织发生不可逆缺血性损伤[3]， 这可能与兼有缺血和血栓形成双重病理损害有关[4]， 鼠梗死形成与人类动脉血栓形成梗死的发病过程相似[5].
, 百拇医药
CPD4造影剂是从中药蚕纱中提取的一种新型光敏剂，由主要成分叶绿三酸的钠盐及其余部分胡萝卜素为主的黄色素组成，与血卟啉类光敏剂相比，CPD4具有体内排泄快，光毒反应小等优点，用药后避光仅需1 d，CPD4特征吸收峰就位于红光区，作用波长长，穿透深，因而较其他造影剂具有明显的优越性[6]. 以往研究显示[7]，CPD4损伤的靶部位是内皮细胞(EC)，首先产生单态氧或氧自由基对EC造成直接光毒损伤，随后血管内皮损伤导致的凝血因子释放，血管收缩，血栓形成使缺氧加重，血液停止，从而加速了血管组织的损伤. 实验结果显示，在照射时间相同的情况下，大鼠脑梗死与CPD4浓度相关. 其中CPD4 40， 50 mg.kg-1在照射后24 h梗死灶对侧肢体出现运动障碍，表明鼠感觉运动皮质区受损，光镜下感觉运动皮质区有不可逆的缺血性病理改变，梗死面积大;相比之下，单纯光照组，单纯光敏剂组未见行为学及病理学改变，光敏剂浓度10， 20和30 mg.kg-1的光化学诱导组，神经行为学及组织病理学改变较轻.
, 百拇医药
根据神经功能评分可反映缺血性损伤的程度，而且与皮质缺血性坏死神经元的数目密切相关[8，9]，我们采用Bederson神经功能评分反映大鼠脑皮质梗死前后神经行为方面的改变，发现不同浓度的CPD4经过光诱导形成一侧大脑皮质梗死后，出现不同程度的神经功能缺损，而且随着浓度的增加，神经功能评分增加，其梗死面积，缺血程度也相应加重；证实了不同的药物浓度与神经学评分及梗死面积成正相关(Fig 5，6)，光镜检查也说明了浓度越高，损伤程度越重，梗死灶区细胞明显变性，坏死，神经元细胞肿胀，萎缩，有的溶解消失，严重还可深入皮质下区域，如纹状体、海马、丘脑等其他底节区.
图5 不同的CPD4质量分数与梗死面积的关系
, 百拇医药 Fig 5 Relationship between mass fraction of CPD4 and the infarction size
总之，叶绿素诱导的脑梗死模型稳定性，重复性好，梗死成功率高，操作简单，可在指定的皮质区发生梗死，而不局限于大脑中动脉供血区，该方法光源成本低，单色性好，无须开颅，避免了手术对脑组织和血管的机械性损伤，对全身影响小，适宜大鼠行为障碍及功能定位研究. 由于该模型是终末动脉永久性闭塞，妨碍扩血管药物疗效的观察，不宜用于复制再灌注损伤的模型研究[10]，可用于脑血管病康复领域中脑可塑性等其他研究.
图6 不同CPD4质量分数与神经功能评分的关系
, 百拇医药
Fig 6 Relationship between mass fraction of CPD4 and the neurobehavoral evaluation
基金项目：军队留学人员回国启动基金(97卫科训字116号回国基金)
作者简介：徐 莉(1966-)， 女(汉族)， 陕西省紫阳县人. 主治医师， 硕士生(导师李 玲). Tel.(029)3375437(O) Email. Lilingdr@fmmu.edu.cn
徐莉(第四军医大学西京医院康复与理疗科)
李玲(第四军医大学西京医院康复与理疗科)
陈景藻(第四军医大学西京医院康复与理疗科)
, 百拇医药 施新猷(第四军医大学实验动物中心，陕西 西安 710033)
郭振援(解放军兰州军区临潼第二疗养院)
王斌(第四军医大学西京医院康复与理疗科)
袁华(第四军医大学西京医院康复与理疗科)
易南(第四军医大学西京医院康复与理疗科)
参考文献:
[1] Bederson JB, Pitts LH, Tsuji M. Rat middle cerebral artery occlusion: Evaluation of the model and development of a neurologic examination [J]. Stroke, 1986；17(3)：472-476.
, 百拇医药
[2] Watson BD, Dietrich WD, Busto R et al. Induction of reproduciole brain infarction by photochemically irritated thrombosis [J]. Ann Neurol, 1985；17(3)：97-504.
[3] Matsuno H, Umemura K. A simple and reproducible cerebral thrombosis model in rats induced by a photochemical reaction and the effect of plasminapen plasminafels activator chimera in this model [J]. J Pharmacol Toxicol Methods, 1993；29(30)：65-73.
[4] 王 伟， 董为伟， 傅雅各et al. 光化学诱导鼠大脑中动脉闭塞及再通模型[J]. 中国神经精神疾病杂志， 1996；22(1)：27-30.
, 百拇医药
[5] Furtell N. An improved photochemical model of embolic cerebral infarction in rats [J]. Stroke, 1999；22(2)：225-232.
[6] 王潭时， 杨永华， 郭 勇et al. 叶绿素光敏剂诊治恶性肿瘤[J]. 浙江中医学院学报，1988；12(4)：53-54.
[7] 杨耀武， 吕春莹， 吴 洋et al. 叶绿素光敏剂光动力治疗鲜红斑痔[J]. 第四军医大学学报，1997；18(6)：582-585.
[8] 李红戈， 张茂悦， 童萼塘et al. 光化学诱导大鼠脑皮质梗塞模型的研究[J]. 卒中与神经疾病，1996；3(3)：126-128.
[9] Garcia JH, Wagner S, Liu KF et al. Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats [J]. Stroke,1995；26(4)：627-632.
[10] 陈春富. 大鼠局灶性脑缺血模型研究进展[研究综述][J]. 国外医学 脑血管疾病分册， 1995；3(5)：227-230., http://www.100md.com
徐莉 李玲 陈景藻 施新猷 郭振援 王斌 袁华 易南
摘 要： 目的 观察光敏剂叶绿素光化学诱导的大鼠脑梗死模型. 方法 大鼠60只随机分为8组：单纯光照组，单纯光敏剂组及6组不同光敏剂浓度(10, 20, 30, 40, 50和60 mg.kg-1)的光化学诱导组，不同的光敏剂浓度光化学诱导组给予静脉注射叶绿素衍生物四号(chlorophyll derivative IV, CPD4) 10 min后，He-Ne激光照射左侧大脑上下肢感觉、运动区，24 h后观察其神经行为学、梗死面积及组织病理学改变，以评估模型的可行性. 结果 CPD4 40, 50 mg.kg-1经He-Ne激光照射，可诱导大鼠脑梗死，且面积恒定，神经行为学评分及病理形态学改变明显. 结论 CPD4诱导的大鼠脑梗死模型稳定性，重复性好，梗死成功率高.
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关键词：叶绿素衍生物；大鼠；光化学法；激光；脑梗死
0 引言
在实验中，理想的动物模型是研究的关键，我们采用叶绿素衍生物四号作光敏剂，氦氖(He-Ne)激光作光源，制做光化学诱导的脑梗死模型，并计算梗死面积，进行神经功能评估及病理学方面的观察.
1 材料和方法
1.1 材料 CPD4粉剂由杭州民生药厂提供，批号930502于0～4℃避光保存，使用前用生理盐水稀释至所需浓度. 雄性SD大鼠，由本校实验动物中心提供，体质量(240±50) g，鼠龄12 wk左右，二级动物. 采用西安激光仪器厂生产的795B型氦氖激光双管治疗机，输出波长632.8 nm(可见红光)，采用原光束双管照射，输出功率8 mW.
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1.2 方法
1.2.1 动物分组 单纯光照组6只;单纯光敏剂组6只;光敏剂浓度为50 mg.kg-1;实验组按光敏剂的浓度分组：10 mg.kg-1组6只；20 mg.kg-1组6只；30 mg.kg-1组6只；40 mg.kg-1组10只；50 mg.kg-1组10只；60 mg.kg-1组10只.
1.2.2 模型制作方法 大鼠10 g.L-1戊巴比妥钠ip麻醉，尾iv CPD4后10 min内，将鼠俯卧位于脑立体固定仪上，沿头颅正中线偏右切开头皮暴露颅骨前沿部位，在前囟门后1.8 mm，正中线旁开约2 mm，即脑上下肢皮层感觉运动区，用黑色避光纸(中央有一8 mm×5 mm的小孔)遮避周围组织，He-Ne激光照射20 min，术后缝合头皮，避光24 h.
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1.2.3 神经症状评定 造模后24 h，按Bederson等[1]人制定的标准评分，共分4级. 0级：未见行为缺陷;1级：前肢屈曲(既提尾悬空试验阳性);2级：侧推抵抗力下降(即侧向推力试验阳性)，伴前肢屈曲，无转圈行为；3级：同2级行为，伴自发性悬转.
1.2.4 观察、取材及处理 实验后24 h进行Bederson神经功能评估，然后灌注取材，100 mL.L-1福尔马林液固定，在视交叉前后每间隔2 mm做6个脑冠状切片，进行计算机扫描，利用灰度对比，Photoshop软件图像处理计算梗死面积，然后石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察组织学变化.
统计学处理： 所有数据以X±s表示，组间比较采用两样本t检验.
2 结果
2.1 神经行为学改变 造模后24 h进行神经行为学评分，40, 50和60 mg.kg-1光化学诱导组的大鼠造模后24 h内有呃逆，呕吐等颅内高压征象，尤以60 mg.kg-1组的大鼠呕吐分泌物多，呼吸道易堵塞，神志极差，多在脑梗死后6～8 h内死亡. 脑梗死面积的测量 造模后24 h取材，经扫描仪扫描，计算机图像处理，结果表明，单纯光照组，单纯光敏剂，10 mg.kg-1组无明显梗死灶，20及30 mg.kg-1组仅有皮层表浅的梗死灶，40及50 mg.kg-1组有明显的梗死灶. 药物浓度与神经学评分及梗死面积关系如Fig 1, 2所示.
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2.2 脑组织病理学改变 HE染色，光镜下单纯光照组，单光敏剂组无明显改变. 10 mg.kg-1组有个别神经元细胞固缩，其他大部分正常， 20， 30 mg.kg-1组可见小的缺血病灶区有神经元固缩，胞质红染，其余正常(Fig 1, 2). 40 mg.kg-1组局部脑组织有梗死灶，神经细胞固缩胞质红染，周围胶质癍痕形成，海马区有退变. 50 mg.kg-1组可见明显的梗死灶，灶区细胞变性坏死，神经元细胞肿胀或固缩，有的溶解消失，梗死区有小灶的中性粒细胞浸润(Fig 3, 4).
图1 单光照组细胞形态
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Fig 1 Cell morphology in light group HE ×400
图2 单光敏组细胞形态
Fig 2 Cell morphology in group treated with photoseneitizing only HE ×400
图3 50 mg.kg-1组细胞形态
, 百拇医药 Fig 3 Cell morphology in 50 mg.kg-1 group HE ×200
图4 50 mg.kg-1组细胞形态
Fig 4 Cell morphology in 50 mg.kg-1 group HE ×400
3 讨论
国内外有不少造模方法有创伤大，需开颅，易感染，难以控制梗死面积等缺点； 光化学法诱导的脑梗死动物模型是1985年由Watson等[2]首先报道，其原理是注入动物体内的光敏染料，在特定波长的光源照射下，产生并释放单态氧，使血管内皮细胞膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，膜通透性增加，导致血管内皮损害，诱发血小板聚集，光照区血管内血栓形成，局部脑组织发生不可逆缺血性损伤[3]， 这可能与兼有缺血和血栓形成双重病理损害有关[4]， 鼠梗死形成与人类动脉血栓形成梗死的发病过程相似[5].
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CPD4造影剂是从中药蚕纱中提取的一种新型光敏剂，由主要成分叶绿三酸的钠盐及其余部分胡萝卜素为主的黄色素组成，与血卟啉类光敏剂相比，CPD4具有体内排泄快，光毒反应小等优点，用药后避光仅需1 d，CPD4特征吸收峰就位于红光区，作用波长长，穿透深，因而较其他造影剂具有明显的优越性[6]. 以往研究显示[7]，CPD4损伤的靶部位是内皮细胞(EC)，首先产生单态氧或氧自由基对EC造成直接光毒损伤，随后血管内皮损伤导致的凝血因子释放，血管收缩，血栓形成使缺氧加重，血液停止，从而加速了血管组织的损伤. 实验结果显示，在照射时间相同的情况下，大鼠脑梗死与CPD4浓度相关. 其中CPD4 40， 50 mg.kg-1在照射后24 h梗死灶对侧肢体出现运动障碍，表明鼠感觉运动皮质区受损，光镜下感觉运动皮质区有不可逆的缺血性病理改变，梗死面积大;相比之下，单纯光照组，单纯光敏剂组未见行为学及病理学改变，光敏剂浓度10， 20和30 mg.kg-1的光化学诱导组，神经行为学及组织病理学改变较轻.
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根据神经功能评分可反映缺血性损伤的程度，而且与皮质缺血性坏死神经元的数目密切相关[8，9]，我们采用Bederson神经功能评分反映大鼠脑皮质梗死前后神经行为方面的改变，发现不同浓度的CPD4经过光诱导形成一侧大脑皮质梗死后，出现不同程度的神经功能缺损，而且随着浓度的增加，神经功能评分增加，其梗死面积，缺血程度也相应加重；证实了不同的药物浓度与神经学评分及梗死面积成正相关(Fig 5，6)，光镜检查也说明了浓度越高，损伤程度越重，梗死灶区细胞明显变性，坏死，神经元细胞肿胀，萎缩，有的溶解消失，严重还可深入皮质下区域，如纹状体、海马、丘脑等其他底节区.
图5 不同的CPD4质量分数与梗死面积的关系
, 百拇医药 Fig 5 Relationship between mass fraction of CPD4 and the infarction size
总之，叶绿素诱导的脑梗死模型稳定性，重复性好，梗死成功率高，操作简单，可在指定的皮质区发生梗死，而不局限于大脑中动脉供血区，该方法光源成本低，单色性好，无须开颅，避免了手术对脑组织和血管的机械性损伤，对全身影响小，适宜大鼠行为障碍及功能定位研究. 由于该模型是终末动脉永久性闭塞，妨碍扩血管药物疗效的观察，不宜用于复制再灌注损伤的模型研究[10]，可用于脑血管病康复领域中脑可塑性等其他研究.
图6 不同CPD4质量分数与神经功能评分的关系
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Fig 6 Relationship between mass fraction of CPD4 and the neurobehavoral evaluation
基金项目：军队留学人员回国启动基金(97卫科训字116号回国基金)
作者简介：徐 莉(1966-)， 女(汉族)， 陕西省紫阳县人. 主治医师， 硕士生(导师李 玲). Tel.(029)3375437(O) Email. Lilingdr@fmmu.edu.cn
徐莉(第四军医大学西京医院康复与理疗科)
李玲(第四军医大学西京医院康复与理疗科)
陈景藻(第四军医大学西京医院康复与理疗科)
, 百拇医药 施新猷(第四军医大学实验动物中心，陕西 西安 710033)
郭振援(解放军兰州军区临潼第二疗养院)
王斌(第四军医大学西京医院康复与理疗科)
袁华(第四军医大学西京医院康复与理疗科)
易南(第四军医大学西京医院康复与理疗科)
参考文献:
[1] Bederson JB, Pitts LH, Tsuji M. Rat middle cerebral artery occlusion: Evaluation of the model and development of a neurologic examination [J]. Stroke, 1986；17(3)：472-476.
, 百拇医药
[2] Watson BD, Dietrich WD, Busto R et al. Induction of reproduciole brain infarction by photochemically irritated thrombosis [J]. Ann Neurol, 1985；17(3)：97-504.
[3] Matsuno H, Umemura K. A simple and reproducible cerebral thrombosis model in rats induced by a photochemical reaction and the effect of plasminapen plasminafels activator chimera in this model [J]. J Pharmacol Toxicol Methods, 1993；29(30)：65-73.
[4] 王 伟， 董为伟， 傅雅各et al. 光化学诱导鼠大脑中动脉闭塞及再通模型[J]. 中国神经精神疾病杂志， 1996；22(1)：27-30.
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[5] Furtell N. An improved photochemical model of embolic cerebral infarction in rats [J]. Stroke, 1999；22(2)：225-232.
[6] 王潭时， 杨永华， 郭 勇et al. 叶绿素光敏剂诊治恶性肿瘤[J]. 浙江中医学院学报，1988；12(4)：53-54.
[7] 杨耀武， 吕春莹， 吴 洋et al. 叶绿素光敏剂光动力治疗鲜红斑痔[J]. 第四军医大学学报，1997；18(6)：582-585.
[8] 李红戈， 张茂悦， 童萼塘et al. 光化学诱导大鼠脑皮质梗塞模型的研究[J]. 卒中与神经疾病，1996；3(3)：126-128.
[9] Garcia JH, Wagner S, Liu KF et al. Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats [J]. Stroke,1995；26(4)：627-632.
[10] 陈春富. 大鼠局灶性脑缺血模型研究进展[研究综述][J]. 国外医学 脑血管疾病分册， 1995；3(5)：227-230., http://www.100md.com