小儿隐孢子虫病的实验诊断研究
小儿隐孢子虫病的实验诊断研究
郑成中 李为明 崔凤文 崔守信 杨颍
摘要 目的：探讨不同检测方法对小儿腹泻粪便中隐孢子虫卵囊(CSO)的诊断效果。方法：对649例急性腹泻患儿的粪便采用7种方法检测CSO：(1)番红-美兰染色法(SMB)；(2)改良抗酸染色法(MAF)；(3)蔗糖漂浮(SSF)后SMB染色法；(4)PBS-乙醚(PBS-E)离心沉淀后MAF染色法；(5)聚蔗糖-泛影酸钠(FSD)纯化后扫描电镜法(SEM)；(6)FSD或Percoll纯化后免疫组化法(ABC)；(7)Percoll纯化后间接免疫荧光法(IFA)。对649例患儿的新鲜粪便标本同时采用前4种方法检测，而对患儿的经预处理低温存放的710份标本(已知阳性86份，已知阴性624份)同时采用7种方法检测。结果：共检出隐孢子虫腹泻病 26例，阳检率4.0 %。SMB和MAF(SMB+MAF)方法的敏感性、特异性分别为80.2 %和94.1 %、61.6 %和98.4 % (P<0.01)，它们的检测准确性分别为92.4 %和93.9 %(P>0.05), SSF+SMB、PBS-E法+MAF法及ABC法的敏感性、特异性、准确性均为100 %，与SMB、MAF法相比较均有非常显著性意义(P<0.01)。结论：粪便直接涂片SMB法阳检率高，假阳性也高，适宜筛查；MAF法与之相反，漏诊率高；ABC法与金标准IFA法检测效果与IFA法一样，但方法繁琐造价高；SSF或PBS-E法浓集CSO后SMB、MAF法的检测效果与IFA法相似，且经济、简便，是检测粪便中CSO较理想的方法。
, 百拇医药
关键词：隐孢子虫病；儿童；荧光免疫测定；抗体，单克隆
1976年，Nime等[1] 首次报道了人隐孢子虫性腹泻病(CSS)，目前普遍认为是一种世界范围的人兽共患疾病，小儿发病率较高，80年代以后相继创建了不少从粪便中检测隐孢子虫卵囊(CSO)技术[2，3]，但这些方法的敏感性、特异性和准确性尚待进一步研究。本研究着重对前人介绍的及我们改良组建的粪便检查技术进行评估，以期寻找经济简便、敏感性高、特异性强、适宜推广的诊断方法。
对象与方法
一、 研究对象
选择以腹泻为主诉，1989年5月～1990年7月初次到第三军医大学新桥医院儿科就诊或住院的12 岁以下小儿为筛查对象，共检测649例。
, 百拇医药
二、 粪便标本预处理及保存
所有新鲜粪便标本经浓集纯化或检测后，分别以10 %甲醛和2.5 % 重铬酸钾预处理，2～8℃下保存待进一步检测。
三、 诊断标准
1.具有腹泻临床表现。
2.粪便经常规检查、细菌培养(用SS及麦康凯培养基)及轮状病毒检测(ELISA法)，除外其它感染性及食饵性腹泻病。
3.粪便检查CSO阳性，全玻片发现一个以上典型CSO者为阳性，基于抗CSO壁单克隆抗体的间接免疫荧光法(IFA)(美国Meridian Diagnostics公司)按试剂提供的阳性、阴性对照试剂判断(此法为诊断金标准)。
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四、实验方法
1.直接粪涂片番红-美兰染色法(SMB) 及甲醛沉淀后改良抗酸染色法(MAF)筛查。参照Baxby等[4]的SMB法及 Garcia等[5]介绍的MAF法染色，加以改良，两法同时对腹泻患儿筛查。新鲜粪便涂片光镜下观察，SMB法使CSO染成明亮的橙红色，呈球形或卵圆形，直径4～6 μm,甲醛沉淀后MAF法染色CSO为红色，CSO 浓度较低。
2.蔗糖漂浮法(SSF)浓集CSO+SMB染色法检查：在Current等[6]的技术基础上设计SSF法，将2.5 %重铬酸钾保存的粪标本经两层纱布过滤，取15 ml加入盛有40 ml饱和蔗糖液的塑胶瓶内，混匀， 650×g 离心10 min，取表层液以PBS(pH值 7.2)离心清洗3次，然后行SMB 法染色镜检。SSF法浓集可提高CSO浓度15～40倍，大部分粪渣、真菌、白细胞被去除，浓集后标本经SMB染色法，CSO具有典型的染色特征，每个高倍视野下可见数个至数十个CSO，很容易识别。
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3.PBS-E 离心沉淀法浓集CSO加MAF 染色检查： 取过滤后的CSO悬液3 ml，加PBS 6 ml、乙醚1～2 ml，混匀，静置3～5 min,500×g 离心5 min，去除上三层(乙醚、粪渣固体栓、PBS层),沉淀部分以PBS清洗3次，然后进行MAF 染色镜检或4℃存放待进一步纯化处理。PBS-E浓集效果与SSF法相当。
4.聚蔗糖-泛影酸钠密度梯度离心法(FSD)纯化CSO后行扫描电镜(SEM) 观察: PBS-E初步浓集后，参照Lumb 等[7]的FSD法进一步纯化，取纯化后的CSO悬液制备SEM 标本，使用Amray-1000B型扫描电镜观察，测微器直接测CSO大小(μm)。FSD 法使CSO集中在0.5 %聚蔗糖表层条带内，可提高CSO浓度50倍以上,SEM观察CSO形态完整，呈球形或椭球形，测微器测量CSO直径4.1～6.7 μm,偶见脱囊现象(子孢子从囊内脱出)。
5.亲合素-生物素-过氧化酶复合物技术(ABC)检测CSO：FSD或Percoll密度梯度离心法提纯CSO后进行免疫组化染色。以抗CSO 壁单克隆抗体(meridian Diagnostics Inc.)为第一抗体，生物素标记的抗鼠抗体为第二抗体，Vectastain ABC复合液为第三抗体，二氨基联苯胺(DAB)显色，光镜下观察。ABC法使CSO染成棕红色或古铜色，周边着色浓，中心淡，内部隐约可见新月状结构(SZ)，无形态、大小、着色与CSO相似的颗粒样结构，使结果更易判断。
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6.间接免疫荧光法(IFA)鉴定CSO: 用Percoll 密度梯度离心法纯化后，CSO集中在第2、3 条带内[8]。取10 μl加在标有“病人”字样的玻片孔内，加抗隐孢子虫卵囊壁单克隆抗体50 μl，室温下湿盒内孵育30 min，置入PBS液(0.01 mol,pH7.6)内浸洗5 min;再加荧光抗体，孵育、浸洗、封片，每批同时做阴性、阳性对照各一孔。用荧光显微镜检测CSO。处理后标本更纯净、CSO浓度更高(100倍以上) 。IFA检查CSO呈现黄绿色荧光，直径2～6 μm ，每高倍显微镜视野见20～100个CSO, 单克隆抗体与其它寄生虫卵、细菌无交叉反应，这些病原体不出现特异性荧光。
五、 实验分组
1.对649例腹泻患儿随机采集的新鲜粪便标本同时运用4种方法检测，即：直接SMB法、直接MAF法、SSF+SMB法、PBS-E+MAF法检测，任一种阳性者，以SEM法、IFA法鉴定确认。
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2.取经预处理低温保存的649例患儿的陈旧标本710份，同时采用上述7种方法检测。
六、 统计学处理
对各种检测方法的敏感性、特异性、准确性，采用专用公式进行u检验[9](u=1p1-p21/S(p1-p2)。
结果
一、 临床资料及一般检测结果
对649例急性腹泻患儿的新鲜粪便标本逐一进行4种方法同时检测，直接SMB、直接MAF、SSF+SMB、PBS-E+MAF 法的阳检率分别为7.1 %、4.6 %、4.0 %和4.0 %，经SEM、IFA法鉴定，共确诊CSS 26例，占小儿腹泻中的4.0 %(26/649)。CSS患儿年龄3个月～8岁(平均3岁)，婴幼儿占58 %(15/26)，6、7、8月份检出18例(69 %)。所有隐孢子虫病患儿未发现明显免疫功能缺陷及营养不良，粪培养及轮状病毒检测均为阴性。
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二、7种方法检测CSO的敏感性、特异性和准确性的结果
同时采用SMB、MAF、ABC、IFA法检测62份标本(其中已知阳性标本11份，另随机采集新标本51份，表1)，结果提示：SMB 和MAF法的敏感性、特异性、准确性分别为93.3 %和73.3 %,89.4 %和97.9 %,90.3 %和91.9 %， ABC法均为100 %。
取预处理后低温存储的陈旧粪便标本 710份(含26例CSS的已知阳性粪便86份，已知阴性624份)采用7种方法单盲法批量检测。结果表明(表2)： SMB法(69/86)比MAF法阳性率高，假阳性率也较高(37/624)。ABC法、SSF+SMB或PBS-E浓集后MAF染色的86份已知阳性标本均呈阳性结果，无假阳性或假阴性。
表1 62份粪便标本4种检测方法的敏感性和
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特异性比较(%)
方法
阳性数
假阳性数
假阴数性
敏感性
特异性
准确性
SMB
14
5
1
93.3
, 百拇医药
89.4
90.3
MAF
11
1
4
73.3
97.9
91.9
ABC
15
0
0
, http://www.100md.com 100.0
100.0
100.0
IFA
15
0
0
100.0
100.0
100.0
注：其中已知阳性标本11份，随机采集新标本51份,新检出阳性标本4份；SMB：直接粪涂片番红-美兰染色法，MAF：及甲醛沉淀后改良抗酸染色法，ABC：亲合素-生物素-过氧化酶复合物技术，IFA：间接免疫荧光法，下同 三、各种方法的敏感性、特异性、准确性的统计学处理结果
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SMB法与MAF法、SMB+ MAF法、SSF+ SMB法、PBS-E+MAF法及ABC法，除前两者的准确性差异无显著性(P>0.05)外，其余两种方法的敏感性、特异性及准确性相比差异均有显著性(P<0.01)。MAF法与ABC法、SSF+ SMB法及PBS-E+MAF法的敏感性、特异性及准确性相比差异均有显著性(P<0.01),表3。
讨论
一、小儿CSS的发病情况及特点
隐孢子虫感染在不发达地区很常见，占小儿腹泻的3 %～13 %[2，3，10]，本组报告26例，占小儿腹泻的4.0 %，比南京报道[11]的(1 %)阳性率高。夏季高发，这可能与：地区流行差异，检测CSO的方法不同，敏感性不同或重庆温暖潮湿气候特点有关。婴幼儿易感且症状明显。病程1～3周，腹泻停止后持续排CSO 2～4周。
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二、 直接SMB与MAF 染色评估
表2 710份粪便标本7种检测方法结果比较
方法
标本数
真阳性数
假阳性数
假阴性数
敏感性(%)
特异性(%)
准确性(%)
+PV(%)
-PV(%)
, 百拇医药
SMB
710
69
37
17
80.2
94.1
92.4
65.1
97.2
MAF
710
53
, 百拇医药
10
33
61.6
98.4
93.9
88.9
94.4
SMB+MAF
710
53
10
33
61.6
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98.4
93.9
88.9
94.4
SSF+SMB
710
86
0
0
100.0
100.0
100.0
100.0
, 百拇医药
100.0
PBS-E+MAF
710
86
0
0
100.0
100.0
100.0
100.0
100.0
FSD+ABC
710
, http://www.100md.com
86
0
0
100.0
100.0
100.0
100.0
100.0
IFA
710
86
0
0
, 百拇医药
100.0
100.0
100.0
100.0
100.0
注：其中已知阳性标本86份，已知阴性标本624份;+PV:阳性预告值，-PV:阴性预告值，SSF：蔗糖漂浮法，PBS-E：离心沉淀法，FSD：密度梯度离心法，下同表3 各种检测方法敏感性、特异性、准确性统计学分析
方法比较
敏感性
特异性
准确性比较
, 百拇医药
u值
P值
u值
P值
u值
P值
SMB与MAF
2.66
<0.01
3.80
<0.01
0.93
>0.05
, 百拇医药
SMB与SMB+MAF
2.66
<0.01
3.80
<0.01
0.93
>0.05
SMB与SSF+SMB
4.35
<0.01
6.14
<0.01
8.25
, http://www.100md.com
<0.01
SMB与PBS-E+MAF
4.35
<0.01
6.14
<0.01
8.25
<0.01
SMB与ABC
4.35
<0.01
6.14
<0.01
, 百拇医药
8.25
<0.01
MAF与ABC
6.39
<0.01
3.57
<0.01
8.09
<0.01
MAF与SSF+SMB
6.39
<0.01
3.57
, http://www.100md.com
<0.01
8.09
<0.01
MAF与PBS-E+MAF
6.39
<0.01
3.57
<0.01
8.09
<0.01
直接粪涂片SMB染色法敏感性较高(阳检率高)，特异性差(阳性结果的验后概率仅为65.1 %)，适用于筛查患儿，MAF法与之相反，漏诊率高，但综合考虑敏感性和特异性时，二者的诊断准确性比较差异无显著性(P>0.05),两法结合可取长补短，可用于初诊患儿。
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三、 SSF、PBS-E集卵SMB、MAF染色评价
经SSF、PBS-E处理后，大部分粪渣、细菌、白细胞及其它“抗酸体”被去除，CSO着色良好，每显微镜视野可见数十个大小、形态、着色一致的CSO，使结果很易判断。我们改良组建的SSF、PBS-E浓集加SMB、MAF染色法，浓集和检测效果明显优于甲醛沉淀后加MAF法，SSF、浓集加SMB检测与直接SMB法相比阳性预告值提高了35 %(即降低了假阳性率)，PBS-E浓集加MAF检测，提高了CSO浓度，可弥补直接MAF法敏感性低的缺陷，其敏感性、特异性和准确性均为100 %，特别适用于粪便中CSO含量较少的标本检测，检测效果与金标准(IFA)相当，且经济简便，有临床应用价值。
四、 SEM观察进一步确认CSO
SEM所见与Reduker等[12]观察结果一致，证实了光镜下的CSO存在，有条件时，SEM观察也是较可靠的诊断方法之一。
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五、 IFA法的诊断意义
基于单克隆抗体的IFA法无假阳性和假阴性结果[13]，是目前最理想的诊断方法，对首次发现或可疑CSO可提供准确无误的鉴定。但造价高，需有荧光显微镜等设备。
六、 ABC染色检测效果
ABC染色技术用于检测粪便中CSO的报道极少，我们建立的ABC法使CSO着色好，背景淡，对比度好，容易辨认。因生物素与亲合素之间有高度亲和力(比抗原-抗体的亲和力大100万倍)，具有层层放大效应，敏感性高、特异性强，不需要荧光显微镜，是一种值得进一步研究评价的检测手段。
七、 各种纯化CSO技术的作用及意义
纯化后CSO浓度高、纯净，使染色检测容易判断；纯化后CSO仍具有感染活力，为深入进行超微结构、免疫微生物、建立动物模型进行发病机制或药物筛选等研究提供了必要前提。
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我们首次经SEM、单克隆抗体(IFA、ABC)鉴定，认为导致重庆地区小儿腹泻的CSO符合小球型(C.parvum)隐孢子虫特点。作者单位：郑成中(100101 北京，解放军第三○六医院儿科)
李为明(第三军医大学新桥医院儿科)
崔凤文(第三军医大学新桥医院儿科)
崔守信(第三军医大学新桥医院儿科)
杨颍(第三军医大学新桥医院儿科)
参考文献
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5，Garcia LS,Bruckner DA,Brewer TC,et al. Techniques for the recovery and identification of cryptosporidium oocysts from stool specimens. J Clin Microbiol, 1983,18:185-190.
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11，韩范.我国发现婴幼儿隐孢子虫病.中华儿科杂志，1989,27:75-76.
12，Reduker DW,Speer CA,Blixt JA. Ultrastructure of cryptosporidium parvum oocysts and excysting sporozoites as revealed by high resolution scanning electron microscopy.J Protozool,1985,32:708-711.
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郑成中 李为明 崔凤文 崔守信 杨颍
摘要 目的：探讨不同检测方法对小儿腹泻粪便中隐孢子虫卵囊(CSO)的诊断效果。方法：对649例急性腹泻患儿的粪便采用7种方法检测CSO：(1)番红-美兰染色法(SMB)；(2)改良抗酸染色法(MAF)；(3)蔗糖漂浮(SSF)后SMB染色法；(4)PBS-乙醚(PBS-E)离心沉淀后MAF染色法；(5)聚蔗糖-泛影酸钠(FSD)纯化后扫描电镜法(SEM)；(6)FSD或Percoll纯化后免疫组化法(ABC)；(7)Percoll纯化后间接免疫荧光法(IFA)。对649例患儿的新鲜粪便标本同时采用前4种方法检测，而对患儿的经预处理低温存放的710份标本(已知阳性86份，已知阴性624份)同时采用7种方法检测。结果：共检出隐孢子虫腹泻病 26例，阳检率4.0 %。SMB和MAF(SMB+MAF)方法的敏感性、特异性分别为80.2 %和94.1 %、61.6 %和98.4 % (P<0.01)，它们的检测准确性分别为92.4 %和93.9 %(P>0.05), SSF+SMB、PBS-E法+MAF法及ABC法的敏感性、特异性、准确性均为100 %，与SMB、MAF法相比较均有非常显著性意义(P<0.01)。结论：粪便直接涂片SMB法阳检率高，假阳性也高，适宜筛查；MAF法与之相反，漏诊率高；ABC法与金标准IFA法检测效果与IFA法一样，但方法繁琐造价高；SSF或PBS-E法浓集CSO后SMB、MAF法的检测效果与IFA法相似，且经济、简便，是检测粪便中CSO较理想的方法。
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关键词：隐孢子虫病；儿童；荧光免疫测定；抗体，单克隆
1976年，Nime等[1] 首次报道了人隐孢子虫性腹泻病(CSS)，目前普遍认为是一种世界范围的人兽共患疾病，小儿发病率较高，80年代以后相继创建了不少从粪便中检测隐孢子虫卵囊(CSO)技术[2，3]，但这些方法的敏感性、特异性和准确性尚待进一步研究。本研究着重对前人介绍的及我们改良组建的粪便检查技术进行评估，以期寻找经济简便、敏感性高、特异性强、适宜推广的诊断方法。
对象与方法
一、 研究对象
选择以腹泻为主诉，1989年5月～1990年7月初次到第三军医大学新桥医院儿科就诊或住院的12 岁以下小儿为筛查对象，共检测649例。
, 百拇医药
二、 粪便标本预处理及保存
所有新鲜粪便标本经浓集纯化或检测后，分别以10 %甲醛和2.5 % 重铬酸钾预处理，2～8℃下保存待进一步检测。
三、 诊断标准
1.具有腹泻临床表现。
2.粪便经常规检查、细菌培养(用SS及麦康凯培养基)及轮状病毒检测(ELISA法)，除外其它感染性及食饵性腹泻病。
3.粪便检查CSO阳性，全玻片发现一个以上典型CSO者为阳性，基于抗CSO壁单克隆抗体的间接免疫荧光法(IFA)(美国Meridian Diagnostics公司)按试剂提供的阳性、阴性对照试剂判断(此法为诊断金标准)。
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四、实验方法
1.直接粪涂片番红-美兰染色法(SMB) 及甲醛沉淀后改良抗酸染色法(MAF)筛查。参照Baxby等[4]的SMB法及 Garcia等[5]介绍的MAF法染色，加以改良，两法同时对腹泻患儿筛查。新鲜粪便涂片光镜下观察，SMB法使CSO染成明亮的橙红色，呈球形或卵圆形，直径4～6 μm,甲醛沉淀后MAF法染色CSO为红色，CSO 浓度较低。
2.蔗糖漂浮法(SSF)浓集CSO+SMB染色法检查：在Current等[6]的技术基础上设计SSF法，将2.5 %重铬酸钾保存的粪标本经两层纱布过滤，取15 ml加入盛有40 ml饱和蔗糖液的塑胶瓶内，混匀， 650×g 离心10 min，取表层液以PBS(pH值 7.2)离心清洗3次，然后行SMB 法染色镜检。SSF法浓集可提高CSO浓度15～40倍，大部分粪渣、真菌、白细胞被去除，浓集后标本经SMB染色法，CSO具有典型的染色特征，每个高倍视野下可见数个至数十个CSO，很容易识别。
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3.PBS-E 离心沉淀法浓集CSO加MAF 染色检查： 取过滤后的CSO悬液3 ml，加PBS 6 ml、乙醚1～2 ml，混匀，静置3～5 min,500×g 离心5 min，去除上三层(乙醚、粪渣固体栓、PBS层),沉淀部分以PBS清洗3次，然后进行MAF 染色镜检或4℃存放待进一步纯化处理。PBS-E浓集效果与SSF法相当。
4.聚蔗糖-泛影酸钠密度梯度离心法(FSD)纯化CSO后行扫描电镜(SEM) 观察: PBS-E初步浓集后，参照Lumb 等[7]的FSD法进一步纯化，取纯化后的CSO悬液制备SEM 标本，使用Amray-1000B型扫描电镜观察，测微器直接测CSO大小(μm)。FSD 法使CSO集中在0.5 %聚蔗糖表层条带内，可提高CSO浓度50倍以上,SEM观察CSO形态完整，呈球形或椭球形，测微器测量CSO直径4.1～6.7 μm,偶见脱囊现象(子孢子从囊内脱出)。
5.亲合素-生物素-过氧化酶复合物技术(ABC)检测CSO：FSD或Percoll密度梯度离心法提纯CSO后进行免疫组化染色。以抗CSO 壁单克隆抗体(meridian Diagnostics Inc.)为第一抗体，生物素标记的抗鼠抗体为第二抗体，Vectastain ABC复合液为第三抗体，二氨基联苯胺(DAB)显色，光镜下观察。ABC法使CSO染成棕红色或古铜色，周边着色浓，中心淡，内部隐约可见新月状结构(SZ)，无形态、大小、着色与CSO相似的颗粒样结构，使结果更易判断。
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6.间接免疫荧光法(IFA)鉴定CSO: 用Percoll 密度梯度离心法纯化后，CSO集中在第2、3 条带内[8]。取10 μl加在标有“病人”字样的玻片孔内，加抗隐孢子虫卵囊壁单克隆抗体50 μl，室温下湿盒内孵育30 min，置入PBS液(0.01 mol,pH7.6)内浸洗5 min;再加荧光抗体，孵育、浸洗、封片，每批同时做阴性、阳性对照各一孔。用荧光显微镜检测CSO。处理后标本更纯净、CSO浓度更高(100倍以上) 。IFA检查CSO呈现黄绿色荧光，直径2～6 μm ，每高倍显微镜视野见20～100个CSO, 单克隆抗体与其它寄生虫卵、细菌无交叉反应，这些病原体不出现特异性荧光。
五、 实验分组
1.对649例腹泻患儿随机采集的新鲜粪便标本同时运用4种方法检测，即：直接SMB法、直接MAF法、SSF+SMB法、PBS-E+MAF法检测，任一种阳性者，以SEM法、IFA法鉴定确认。
, http://www.100md.com
2.取经预处理低温保存的649例患儿的陈旧标本710份，同时采用上述7种方法检测。
六、 统计学处理
对各种检测方法的敏感性、特异性、准确性，采用专用公式进行u检验[9](u=1p1-p21/S(p1-p2)。
结果
一、 临床资料及一般检测结果
对649例急性腹泻患儿的新鲜粪便标本逐一进行4种方法同时检测，直接SMB、直接MAF、SSF+SMB、PBS-E+MAF 法的阳检率分别为7.1 %、4.6 %、4.0 %和4.0 %，经SEM、IFA法鉴定，共确诊CSS 26例，占小儿腹泻中的4.0 %(26/649)。CSS患儿年龄3个月～8岁(平均3岁)，婴幼儿占58 %(15/26)，6、7、8月份检出18例(69 %)。所有隐孢子虫病患儿未发现明显免疫功能缺陷及营养不良，粪培养及轮状病毒检测均为阴性。
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二、7种方法检测CSO的敏感性、特异性和准确性的结果
同时采用SMB、MAF、ABC、IFA法检测62份标本(其中已知阳性标本11份，另随机采集新标本51份，表1)，结果提示：SMB 和MAF法的敏感性、特异性、准确性分别为93.3 %和73.3 %,89.4 %和97.9 %,90.3 %和91.9 %， ABC法均为100 %。
取预处理后低温存储的陈旧粪便标本 710份(含26例CSS的已知阳性粪便86份，已知阴性624份)采用7种方法单盲法批量检测。结果表明(表2)： SMB法(69/86)比MAF法阳性率高，假阳性率也较高(37/624)。ABC法、SSF+SMB或PBS-E浓集后MAF染色的86份已知阳性标本均呈阳性结果，无假阳性或假阴性。
表1 62份粪便标本4种检测方法的敏感性和
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特异性比较(%)
方法
阳性数
假阳性数
假阴数性
敏感性
特异性
准确性
SMB
14
5
1
93.3
, 百拇医药
89.4
90.3
MAF
11
1
4
73.3
97.9
91.9
ABC
15
0
0
, http://www.100md.com 100.0
100.0
100.0
IFA
15
0
0
100.0
100.0
100.0
注：其中已知阳性标本11份，随机采集新标本51份,新检出阳性标本4份；SMB：直接粪涂片番红-美兰染色法，MAF：及甲醛沉淀后改良抗酸染色法，ABC：亲合素-生物素-过氧化酶复合物技术，IFA：间接免疫荧光法，下同 三、各种方法的敏感性、特异性、准确性的统计学处理结果
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SMB法与MAF法、SMB+ MAF法、SSF+ SMB法、PBS-E+MAF法及ABC法，除前两者的准确性差异无显著性(P>0.05)外，其余两种方法的敏感性、特异性及准确性相比差异均有显著性(P<0.01)。MAF法与ABC法、SSF+ SMB法及PBS-E+MAF法的敏感性、特异性及准确性相比差异均有显著性(P<0.01),表3。
讨论
一、小儿CSS的发病情况及特点
隐孢子虫感染在不发达地区很常见，占小儿腹泻的3 %～13 %[2，3，10]，本组报告26例，占小儿腹泻的4.0 %，比南京报道[11]的(1 %)阳性率高。夏季高发，这可能与：地区流行差异，检测CSO的方法不同，敏感性不同或重庆温暖潮湿气候特点有关。婴幼儿易感且症状明显。病程1～3周，腹泻停止后持续排CSO 2～4周。
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二、 直接SMB与MAF 染色评估
表2 710份粪便标本7种检测方法结果比较
方法
标本数
真阳性数
假阳性数
假阴性数
敏感性(%)
特异性(%)
准确性(%)
+PV(%)
-PV(%)
, 百拇医药
SMB
710
69
37
17
80.2
94.1
92.4
65.1
97.2
MAF
710
53
, 百拇医药
10
33
61.6
98.4
93.9
88.9
94.4
SMB+MAF
710
53
10
33
61.6
, http://www.100md.com
98.4
93.9
88.9
94.4
SSF+SMB
710
86
0
0
100.0
100.0
100.0
100.0
, 百拇医药
100.0
PBS-E+MAF
710
86
0
0
100.0
100.0
100.0
100.0
100.0
FSD+ABC
710
, http://www.100md.com
86
0
0
100.0
100.0
100.0
100.0
100.0
IFA
710
86
0
0
, 百拇医药
100.0
100.0
100.0
100.0
100.0
注：其中已知阳性标本86份，已知阴性标本624份;+PV:阳性预告值，-PV:阴性预告值，SSF：蔗糖漂浮法，PBS-E：离心沉淀法，FSD：密度梯度离心法，下同表3 各种检测方法敏感性、特异性、准确性统计学分析
方法比较
敏感性
特异性
准确性比较
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u值
P值
u值
P值
u值
P值
SMB与MAF
2.66
<0.01
3.80
<0.01
0.93
>0.05
, 百拇医药
SMB与SMB+MAF
2.66
<0.01
3.80
<0.01
0.93
>0.05
SMB与SSF+SMB
4.35
<0.01
6.14
<0.01
8.25
, http://www.100md.com
<0.01
SMB与PBS-E+MAF
4.35
<0.01
6.14
<0.01
8.25
<0.01
SMB与ABC
4.35
<0.01
6.14
<0.01
, 百拇医药
8.25
<0.01
MAF与ABC
6.39
<0.01
3.57
<0.01
8.09
<0.01
MAF与SSF+SMB
6.39
<0.01
3.57
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<0.01
8.09
<0.01
MAF与PBS-E+MAF
6.39
<0.01
3.57
<0.01
8.09
<0.01
直接粪涂片SMB染色法敏感性较高(阳检率高)，特异性差(阳性结果的验后概率仅为65.1 %)，适用于筛查患儿，MAF法与之相反，漏诊率高，但综合考虑敏感性和特异性时，二者的诊断准确性比较差异无显著性(P>0.05),两法结合可取长补短，可用于初诊患儿。
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三、 SSF、PBS-E集卵SMB、MAF染色评价
经SSF、PBS-E处理后，大部分粪渣、细菌、白细胞及其它“抗酸体”被去除，CSO着色良好，每显微镜视野可见数十个大小、形态、着色一致的CSO，使结果很易判断。我们改良组建的SSF、PBS-E浓集加SMB、MAF染色法，浓集和检测效果明显优于甲醛沉淀后加MAF法，SSF、浓集加SMB检测与直接SMB法相比阳性预告值提高了35 %(即降低了假阳性率)，PBS-E浓集加MAF检测，提高了CSO浓度，可弥补直接MAF法敏感性低的缺陷，其敏感性、特异性和准确性均为100 %，特别适用于粪便中CSO含量较少的标本检测，检测效果与金标准(IFA)相当，且经济简便，有临床应用价值。
四、 SEM观察进一步确认CSO
SEM所见与Reduker等[12]观察结果一致，证实了光镜下的CSO存在，有条件时，SEM观察也是较可靠的诊断方法之一。
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五、 IFA法的诊断意义
基于单克隆抗体的IFA法无假阳性和假阴性结果[13]，是目前最理想的诊断方法，对首次发现或可疑CSO可提供准确无误的鉴定。但造价高，需有荧光显微镜等设备。
六、 ABC染色检测效果
ABC染色技术用于检测粪便中CSO的报道极少，我们建立的ABC法使CSO着色好，背景淡，对比度好，容易辨认。因生物素与亲合素之间有高度亲和力(比抗原-抗体的亲和力大100万倍)，具有层层放大效应，敏感性高、特异性强，不需要荧光显微镜，是一种值得进一步研究评价的检测手段。
七、 各种纯化CSO技术的作用及意义
纯化后CSO浓度高、纯净，使染色检测容易判断；纯化后CSO仍具有感染活力，为深入进行超微结构、免疫微生物、建立动物模型进行发病机制或药物筛选等研究提供了必要前提。
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我们首次经SEM、单克隆抗体(IFA、ABC)鉴定，认为导致重庆地区小儿腹泻的CSO符合小球型(C.parvum)隐孢子虫特点。作者单位：郑成中(100101 北京，解放军第三○六医院儿科)
李为明(第三军医大学新桥医院儿科)
崔凤文(第三军医大学新桥医院儿科)
崔守信(第三军医大学新桥医院儿科)
杨颍(第三军医大学新桥医院儿科)
参考文献
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