牛煅烧骨与体外培养兔骨膜成骨细胞的相容性
许永华 施新猷 胡蕴玉 刘健 顾为望 彭磊 刘丹平
摘 要：目的 观察煅烧骨与培养的兔骨膜成骨细胞的组织相容性,为将 复合物植入骨缺损提供实验依据. 方法 采用取材丰富的牛松质骨经脱脂 、脱蛋白、煅烧等工艺处理制成的煅 烧骨(true bone ceramic，TBC)为载体，将体外培养的兔骨膜成骨细胞复合到TBC，4，1 0和20 d取材，行扫描电镜观察，设对照组. 结果 4 d后，煅烧骨面及 孔内即有了细胞贴附 生长，20 d全部长满，有胶原纤维形成，对照组则没有. 结论 煅烧骨与 成骨细胞有良好的组织相容性.
关键词：煅烧骨；成骨细胞
0 引言
目前，骨和软骨组织工程的研究主要集中在细胞种植基质材料的研究开发，种子细胞性 质的研究；组织培养中各种因子的调控作用. 其中，细胞种植基质材料的相容性研究又是组 织工程研究的重点，也是能否应用于临床的重要因素. 我们采用煅烧骨做为载体，与体外培 养的成骨细胞 复合，观察其组织相容性以期达到植骨目的.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 采取健康的成年牛松质骨，经脱脂、脱蛋白、 煅烧(800℃，3 h)等工艺制成煅烧骨(true bone ceramic TBC)，经X线衍射分析和扫描电镜(scanning electro n microscope, SEM)观察证实，TBC的主要成分是羟基磷灰石(HA)，纯度高，质量可靠 ，有天然的高密度网状孔隙结构. X-射线能谱分析结果表明，TBC载体钙磷原子数量比为1 ∶1.67. 接近于人骨钙磷比值，根据动物模型设计将TBC制成相应的大小形态. 经高压蒸气 消毒后涂鼠尾胶原备用. 鼠尾胶原制备,见文献[1].
1.2 方法
1.2.1 兔骨膜成骨细胞的制备 骨膜的取材和细胞培养：实验用健康新西兰兔，雌 雄不限，4 mo龄，体质量800 g，30 g.L-1戊巴比妥钠30 mg.kg-1, iv 麻醉 ，无菌操作下切取胫骨骨膜进行体外培养[2].
, 百拇医药
1.2.2 TBC与成骨细胞的复合 将传代成骨细胞制成1×1011个.L -1成骨细胞悬液，将上述煅烧 骨，放入24孔板中，每孔1块. 同滴管将细胞悬液滴入骨块中，待骨块被细胞悬液浸满并滋 生少许后加入含200 mL.L-1FBS 1640培养液，每孔2 mL，于37℃，50 mL.L-1 CO2，饱合温度条件下 培养24 h，再分别将骨块移入另一孔并加入新的培养液，此后每1～2 d换液1次，并于4， 10，20 d分别取材，扫描电镜(SEM)下观察.
2 结果
2.1 未复合细胞载体表面SEM观察 经煅烧的牛松质骨外观形态不变， 色灰白，载体表面 光滑，载体孔隙300～700 μm，壁厚60～300 μm，孔隙率为85%，连续放大500倍，清楚 看清牛松质骨载体表面的结构，孔壁上未见细胞贴附生长(Fig 1).
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2.2 复合细胞载体表面SEM观察 在培养4 d的载体上可见有少量 细胞生长，形态不规则(Fig 2)，培养10 d的载体细胞明 显增多，培养20 d载体表面细胞生长密集，胞体呈不规则半球状，从胞体伸出的细胞突起长 短不一，有的与其他胞体相连，细胞在孔洞中几乎长满(Fig 3)有明显的胶原纤维分泌(F ig 4). 上述观察结果提示：①复合细胞已在载体表面成活并贴壁生长，②细胞已发挥其合 成胶原纤维的功能，表明牛松质骨经高温煅烧再加胶原处理后，有较好的生物相容性.
图 1 经煅烧的牛松质骨载体电镜观察
Fig 1 Structure of calcined cattle cancellas bone as a vector under SEM
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图 2 复合细胞4d的载体电镜观察
Fig 2 On the 4 d situation of compounded cells on the vector under SEM
图 3 复合细胞20 d的载体电镜观察
Fig 3 Change of compounded cells on the vector under SEM on the 20th day
, 百拇医药
图 4 载体上细胞胶原分泌电镜观察
Fig 4 Situation of collagenic secretion by cells on the vector under SEM calcined cattle
3 讨论
目前用于细胞种植的基质材料有聚乙酸(polyglycolic acid,PGA)和聚乙烯，聚乳酸( polylactic acid, PLA),磷酸三钙(tricalcium phosphate, TCP)，羟基磷灰石(hydroxyapa tite,HA)，煅烧膏(plaster of paris,pp)，聚酣(polyanhydrides)等，其中以PGA和PLA两 种有机分子聚合物应用最广，具有较好的生物相容性，可降解性及可吸收性，但其存在费用 昂 贵，降解率、可塑性低等不令人满意的缺点，特别应当指出的是PGA和PLA降解后的酸性代谢 产物会降低聚合物周围pH值，从而影响细胞和组织生长[3]，还可引起纤维化及可 能发生周 围组织的免疫反应[4]. 异种骨取自动物，来源广，取材方便. 异种骨的不同构成 对骨缺损 修复有很大影响，松质骨其结构疏松，易于吸收替代长入新骨[5]. 我们用经高温 煅烧的牛 松质骨作为载体，复合细胞后继续培养. 实验结果表明细胞在该载体上可以良好的贴附，伸 展，生长.
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细胞载体表面的贴附生长是其发挥功能的前提条件[6]. 与其他材料相比，煅 烧骨具有 明显的优点，经高温煅烧，可以彻底消除其抗原性，同时保留了骨的形状，骨内天然多孔结 构具有很大的内表面积，有利于细胞的植入与贴附，以及细胞营养成分的渗入和细胞代谢产 物的排出. 充分利用了HA良好的生物相容性、骨传导性、机械承载能力、细胞易于贴附和可 控降解速度等特性[7，8]. 扫描电镜证实，该材料具有原骨的骨小梁、小梁间隙及 骨内管腔 系统，空隙率为85%，孔径大小为450 μm，其大小适合肉芽组织长入和软骨分化形成，有利 于传导成骨；解决了化学合成人工骨的空隙率，空隙交通孔径大小等方面制作难题. 煅烧骨 经我们用胶原处理后，具有良好的细胞界面，利于细胞的贴附，并为细胞在其表面生长，增 殖，分化基质，提供良好的微环境；煅烧骨有一定的降解性[9]，载体制作方法简 单，组织 相容性较好，不必象其他载体那样通过复杂的制作技术提高其性能，是组织较为理想的载体 之一. 我们采用组织工程学方法，将成骨细胞种植于煅烧骨上，在体外进行三维立体培养，使成骨 细胞在载体上增殖，分化成熟，在扫描电镜(SEM)下观察了煅烧骨载体，以及复合的成骨 细胞生长情况及细胞学行为，为把煅烧骨载体作为骨组织工程材料，体外组装成骨细胞以期 达到植骨目的提供实验依据.
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作者简介：许永华(1956-)，女(汉族)，江苏省南京市人. 1986年新疆 医学院医疗系毕业,主管技师，科主任，发表文章12篇，参编专著2部. Tel.(0991)4992198
许永华(兰州 军区乌鲁木齐总医院动物实验科, 新疆 乌鲁木齐 830000,第四军医大学)
施新猷(兰州 军区乌鲁木齐总医院实验动物中心, 新疆 乌鲁木齐 830000,第四军医大学)
胡蕴玉(西京医院全军创伤骨科研究所)
彭磊(西京医院全军创伤骨科研究所)
刘丹平(西京医院全军创伤骨科研究所)
刘健(西京医院全军创伤骨科电镜中心)
, http://www.100md.com 顾为望(第一军医大学实验动物中心)
参考文献：
[1] 方福德，周 吕，丁 濂et al. 现代实验医学技巧全书[ M]. 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1996：442-443.
[2] 许永华，王 瑞，殷学军. 兔成骨细胞两种分离方法的比较[J]. 上海 实验动物科学，1999;1(2)：190-192.
[3] Sittinger M， Bujia J，Minuth WW et al. Engineering of cartila ge tissu e using bioresorbable polvmer carriers in perfusion culture[J].Biomaterials ，1994；15(6): 451-456.
, 百拇医药
[4] Sims CD, Butler PE, Cao YL et al. Tissue engineered neocartila ge us ing plasma derived polymer substrates and chondrocytes[J]. Plast Reconstr Su rg,1998;101(6):1580-1585.
[5] 胡蕴玉，陆裕朴，刘 伟. 异种骨移植修复骨缺损实验研究[J]. 中华 骨科杂志,1990;10(1):33-36.
[6] Nagahara S, Matsuda T. Cell Substrate and cell interactions d if ferently regulate cyloskeletal and extracellular matrix protein gene expression [J]. J Biomed mater Res,1996;32(6):677-686.
, http://www.100md.com
[7] Hoogendoorn HA. Renooij W. Akkermans LM et al. Longs lerm stud s o f large ceramic implants(porous hydroxyapatite)in dog femora[J]. Clin Orthop ，1984;187(4):281-288.
[8] Hollinger JO, Battistone CC. Biodegradable bone repair materials s ynthetic polymers and ceramics[J]. Clin Orthop，1986;207(1):290-305.
[9] 候希敏,活性煅烧骨的实验研究与临床应用[J]. 中华骨科杂志,1997; 17(11):699-701., http://www.100md.com
摘 要：目的 观察煅烧骨与培养的兔骨膜成骨细胞的组织相容性,为将 复合物植入骨缺损提供实验依据. 方法 采用取材丰富的牛松质骨经脱脂 、脱蛋白、煅烧等工艺处理制成的煅 烧骨(true bone ceramic，TBC)为载体，将体外培养的兔骨膜成骨细胞复合到TBC，4，1 0和20 d取材，行扫描电镜观察，设对照组. 结果 4 d后，煅烧骨面及 孔内即有了细胞贴附 生长，20 d全部长满，有胶原纤维形成，对照组则没有. 结论 煅烧骨与 成骨细胞有良好的组织相容性.
关键词：煅烧骨；成骨细胞
0 引言
目前，骨和软骨组织工程的研究主要集中在细胞种植基质材料的研究开发，种子细胞性 质的研究；组织培养中各种因子的调控作用. 其中，细胞种植基质材料的相容性研究又是组 织工程研究的重点，也是能否应用于临床的重要因素. 我们采用煅烧骨做为载体，与体外培 养的成骨细胞 复合，观察其组织相容性以期达到植骨目的.
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1 材料和方法
1.1 材料 采取健康的成年牛松质骨，经脱脂、脱蛋白、 煅烧(800℃，3 h)等工艺制成煅烧骨(true bone ceramic TBC)，经X线衍射分析和扫描电镜(scanning electro n microscope, SEM)观察证实，TBC的主要成分是羟基磷灰石(HA)，纯度高，质量可靠 ，有天然的高密度网状孔隙结构. X-射线能谱分析结果表明，TBC载体钙磷原子数量比为1 ∶1.67. 接近于人骨钙磷比值，根据动物模型设计将TBC制成相应的大小形态. 经高压蒸气 消毒后涂鼠尾胶原备用. 鼠尾胶原制备,见文献[1].
1.2 方法
1.2.1 兔骨膜成骨细胞的制备 骨膜的取材和细胞培养：实验用健康新西兰兔，雌 雄不限，4 mo龄，体质量800 g，30 g.L-1戊巴比妥钠30 mg.kg-1, iv 麻醉 ，无菌操作下切取胫骨骨膜进行体外培养[2].
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1.2.2 TBC与成骨细胞的复合 将传代成骨细胞制成1×1011个.L -1成骨细胞悬液，将上述煅烧 骨，放入24孔板中，每孔1块. 同滴管将细胞悬液滴入骨块中，待骨块被细胞悬液浸满并滋 生少许后加入含200 mL.L-1FBS 1640培养液，每孔2 mL，于37℃，50 mL.L-1 CO2，饱合温度条件下 培养24 h，再分别将骨块移入另一孔并加入新的培养液，此后每1～2 d换液1次，并于4， 10，20 d分别取材，扫描电镜(SEM)下观察.
2 结果
2.1 未复合细胞载体表面SEM观察 经煅烧的牛松质骨外观形态不变， 色灰白，载体表面 光滑，载体孔隙300～700 μm，壁厚60～300 μm，孔隙率为85%，连续放大500倍，清楚 看清牛松质骨载体表面的结构，孔壁上未见细胞贴附生长(Fig 1).
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2.2 复合细胞载体表面SEM观察 在培养4 d的载体上可见有少量 细胞生长，形态不规则(Fig 2)，培养10 d的载体细胞明 显增多，培养20 d载体表面细胞生长密集，胞体呈不规则半球状，从胞体伸出的细胞突起长 短不一，有的与其他胞体相连，细胞在孔洞中几乎长满(Fig 3)有明显的胶原纤维分泌(F ig 4). 上述观察结果提示：①复合细胞已在载体表面成活并贴壁生长，②细胞已发挥其合 成胶原纤维的功能，表明牛松质骨经高温煅烧再加胶原处理后，有较好的生物相容性.
图 1 经煅烧的牛松质骨载体电镜观察
Fig 1 Structure of calcined cattle cancellas bone as a vector under SEM
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图 2 复合细胞4d的载体电镜观察
Fig 2 On the 4 d situation of compounded cells on the vector under SEM
图 3 复合细胞20 d的载体电镜观察
Fig 3 Change of compounded cells on the vector under SEM on the 20th day
, 百拇医药
图 4 载体上细胞胶原分泌电镜观察
Fig 4 Situation of collagenic secretion by cells on the vector under SEM calcined cattle
3 讨论
目前用于细胞种植的基质材料有聚乙酸(polyglycolic acid,PGA)和聚乙烯，聚乳酸( polylactic acid, PLA),磷酸三钙(tricalcium phosphate, TCP)，羟基磷灰石(hydroxyapa tite,HA)，煅烧膏(plaster of paris,pp)，聚酣(polyanhydrides)等，其中以PGA和PLA两 种有机分子聚合物应用最广，具有较好的生物相容性，可降解性及可吸收性，但其存在费用 昂 贵，降解率、可塑性低等不令人满意的缺点，特别应当指出的是PGA和PLA降解后的酸性代谢 产物会降低聚合物周围pH值，从而影响细胞和组织生长[3]，还可引起纤维化及可 能发生周 围组织的免疫反应[4]. 异种骨取自动物，来源广，取材方便. 异种骨的不同构成 对骨缺损 修复有很大影响，松质骨其结构疏松，易于吸收替代长入新骨[5]. 我们用经高温 煅烧的牛 松质骨作为载体，复合细胞后继续培养. 实验结果表明细胞在该载体上可以良好的贴附，伸 展，生长.
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细胞载体表面的贴附生长是其发挥功能的前提条件[6]. 与其他材料相比，煅 烧骨具有 明显的优点，经高温煅烧，可以彻底消除其抗原性，同时保留了骨的形状，骨内天然多孔结 构具有很大的内表面积，有利于细胞的植入与贴附，以及细胞营养成分的渗入和细胞代谢产 物的排出. 充分利用了HA良好的生物相容性、骨传导性、机械承载能力、细胞易于贴附和可 控降解速度等特性[7，8]. 扫描电镜证实，该材料具有原骨的骨小梁、小梁间隙及 骨内管腔 系统，空隙率为85%，孔径大小为450 μm，其大小适合肉芽组织长入和软骨分化形成，有利 于传导成骨；解决了化学合成人工骨的空隙率，空隙交通孔径大小等方面制作难题. 煅烧骨 经我们用胶原处理后，具有良好的细胞界面，利于细胞的贴附，并为细胞在其表面生长，增 殖，分化基质，提供良好的微环境；煅烧骨有一定的降解性[9]，载体制作方法简 单，组织 相容性较好，不必象其他载体那样通过复杂的制作技术提高其性能，是组织较为理想的载体 之一. 我们采用组织工程学方法，将成骨细胞种植于煅烧骨上，在体外进行三维立体培养，使成骨 细胞在载体上增殖，分化成熟，在扫描电镜(SEM)下观察了煅烧骨载体，以及复合的成骨 细胞生长情况及细胞学行为，为把煅烧骨载体作为骨组织工程材料，体外组装成骨细胞以期 达到植骨目的提供实验依据.
, http://www.100md.com
作者简介：许永华(1956-)，女(汉族)，江苏省南京市人. 1986年新疆 医学院医疗系毕业,主管技师，科主任，发表文章12篇，参编专著2部. Tel.(0991)4992198
许永华(兰州 军区乌鲁木齐总医院动物实验科, 新疆 乌鲁木齐 830000,第四军医大学)
施新猷(兰州 军区乌鲁木齐总医院实验动物中心, 新疆 乌鲁木齐 830000,第四军医大学)
胡蕴玉(西京医院全军创伤骨科研究所)
彭磊(西京医院全军创伤骨科研究所)
刘丹平(西京医院全军创伤骨科研究所)
刘健(西京医院全军创伤骨科电镜中心)
, http://www.100md.com 顾为望(第一军医大学实验动物中心)
参考文献：
[1] 方福德，周 吕，丁 濂et al. 现代实验医学技巧全书[ M]. 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1996：442-443.
[2] 许永华，王 瑞，殷学军. 兔成骨细胞两种分离方法的比较[J]. 上海 实验动物科学，1999;1(2)：190-192.
[3] Sittinger M， Bujia J，Minuth WW et al. Engineering of cartila ge tissu e using bioresorbable polvmer carriers in perfusion culture[J].Biomaterials ，1994；15(6): 451-456.
, 百拇医药
[4] Sims CD, Butler PE, Cao YL et al. Tissue engineered neocartila ge us ing plasma derived polymer substrates and chondrocytes[J]. Plast Reconstr Su rg,1998;101(6):1580-1585.
[5] 胡蕴玉，陆裕朴，刘 伟. 异种骨移植修复骨缺损实验研究[J]. 中华 骨科杂志,1990;10(1):33-36.
[6] Nagahara S, Matsuda T. Cell Substrate and cell interactions d if ferently regulate cyloskeletal and extracellular matrix protein gene expression [J]. J Biomed mater Res,1996;32(6):677-686.
, http://www.100md.com
[7] Hoogendoorn HA. Renooij W. Akkermans LM et al. Longs lerm stud s o f large ceramic implants(porous hydroxyapatite)in dog femora[J]. Clin Orthop ，1984;187(4):281-288.
[8] Hollinger JO, Battistone CC. Biodegradable bone repair materials s ynthetic polymers and ceramics[J]. Clin Orthop，1986;207(1):290-305.
[9] 候希敏,活性煅烧骨的实验研究与临床应用[J]. 中华骨科杂志,1997; 17(11):699-701., http://www.100md.com