鼠源性抗人成骨肉瘤抗体轻链基因克隆及其结构分析
鼠源性抗人成骨肉瘤抗体轻链基因克隆及其结构分析
苏海川 范清宇 张惠中 裘秀春 何大为
摘 要: 目的 扩增与人成骨肉瘤细胞特异结合的鼠源性单克隆抗体轻链基因,并对其基因序列进行分析. 方法 用RT-PCR方法从分泌鼠源抗人成骨肉瘤单克隆抗体的杂交瘤细胞(7F6B)扩增出抗体轻链基因, 克隆到pGEM-T载体, 以全自动测序仪测定其轻链基因序列并对其结构进行分析. 结果 7F6B轻链基因由656 bp组成,编码218个氨基酸,序列分析证实该基因可变区序列符合小鼠Ig 轻链基因的氨基酸序列特征. 结论 获得的鼠源性抗成骨肉瘤抗体轻链基因为κⅢ家族,该结果为进一步探讨人成骨肉瘤的免疫治疗研究奠定了基础.
关键词：成骨肉瘤；抗体；杂交瘤
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0 引言
成骨肉瘤是常见的恶性程度极高的骨源性肿瘤，患者往往在术前就已有了微小肺转移灶，加之局部复发，成骨肉瘤患者的预后很差，长期存活率低于60%[1]. 化疗有其局限性，尚不能完全解决转移和复发的问题. 肿瘤的免疫治疗是一种极具潜力的辅助疗法，为探讨单链抗体技术在该肿瘤治疗中的应用意义，我们用RT-PCR方法进行了抗人成骨肉瘤单克隆抗体轻链基因的克隆及分析.
1 材料和方法
1.1 材料 小鼠杂交瘤细胞系7F6B为本室制备,该细胞可分泌抗人成骨肉瘤OS-9607细胞mAb[2], 常规培养于100 mL.L-1小牛血清的RPMI 1640培养液中. 扩增鼠源性抗体轻链基因的PCR引物合成于上海生物工程有限公司(5端引物为2条， P1： 5-CCAG(TA)T(CG)(CT)GAGCTC(GC)(TA)(GC)(AC)T(GC)AC(CA)CAG(AT) CTCCA-3， 5-CCAGTTCCGAGCTCGT(TG)(GT)TGAC(GT)CAG(GC)(AC)(AG)(TC)C(TC)-3; 3端引物为： 5-GCGCCGTCTAGAATTAACA-CTCATTCCTGTTGA-3). 逆转录酶及PCR所用试剂均为 Gibco公司产品. pGEM-T载体为Pro-mega公司产品.
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1.2 方法 取2×107杂交瘤细胞，TRIzol法提取细胞总RNA (Gibco Inc kit,及实验指南). 以细胞总RNA为模板进行cDNA第一链的合成： 3.5 μL RNA, 2 μL 5倍逆转录缓冲液，1 μL Oligo(dT)12,70℃保温10 min,冰浴2 min，加入1 μL 100 mmol.L-1 DTT, 1 μL dNTP, 1 μL RNase inhibitor, 0.5 μL Moloney鼠白血病病毒逆转录酶，37℃反应1 h. 以cDNA第1链为模板，PCR扩增7F6B抗体轻链基因. PCR反应体系为：模板RNA 5 μL，10×PCR缓冲液5 μL, 2.5 mmol.L-1 dNTP 5 μL, 5 μmol.L-1引物5 μL, Taq DNA聚合酶1 μL, 加水至50 μL; 94℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 40 s,反应30个循环. 15 g.L-1琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物. 上述PCR产物于15 g.L-1低熔点琼脂糖凝胶电泳分离后, 切取650 bp大小左右的条带, Wazard Miniprep柱(Promega Inc Kit)回收纯化, 取0.3～0.5 μg回收的PCR产物与100 ng pGEM-T载体进行连接反应,16℃连接16 h. 转化JM109感受态细菌并经蓝白筛选挑取阳性克隆进行扩大培养. 提取重组质粒进行XbaI及SacI双酶切鉴定,同时进行序列测定及分析.
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2 结果
2.1 7F6B mAb轻链基因扩增 应用针对鼠抗体轻链基因5端及3端设计的引物,从7F6B杂交瘤细胞扩增出约650 bp的DNA片段(Fig 1),其DNA片段的大小与预期鼠源性抗体轻链基因大小一致.
2.2 7F6B mAb轻链基因扩增产物的克隆及鉴定 将7F6B轻链基因与pGEM-T载体的连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞, 得到数十个白色转化菌落.挑选十个白色菌落, 提取质粒DNA, 经XbaI及SacI双酶切鉴定,可得到656 bp大小的插入片段(Fig 2).
2.3 7F6B轻链基因测序结果 7F6B轻链基因测序结果表明, 该基因为开放读框,编码218个氨基酸, 与Gene Bank中已发表的序列比较未发现有与其序列相同的基因，说明其为新发现的基因序列. 该基因属于鼠Ig轻链κⅢ家族成员，有明确的4个FR区和3个CDR区， 并有维持抗体可变区空间结构所必需的两个特征性的半胱氨酸残基(序列如下)，表明所得基因序列符合鼠的轻链基因.
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图1 7F6B轻链基因RT-PCR扩增结果
Fig 1 RT-PCR amplification of 7F6B Ab light chain gene
Lane 1: PCR marker; 2: Light chain gene.
图2 重组pGEM-T质粒的XbaI及SacI酶切鉴定
Fig 2 XbaI and SacI enzyme digestion of recombinant pGEM-T plasmid
Lane 1: PCR marker; 2～10: Recombinant plasmid from different colonies digested with XbaI and SacI enzyme.
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3 讨论
骨肉瘤是一种常见恶性程度极高的骨源性肿瘤，易发生肺转移且多发于青少年，严重危害青少年健康和生命，迄今尚无理想的治疗手段. 随着现代分子生物学和免疫学的发展，基因工程抗体的诞生为肿瘤的诊断和治疗带来了希望，尤其是单链抗体的应用成为肿瘤免疫基因治疗的热点. 我们利用本室制备的产生抗人成骨肉瘤细胞的鼠源性杂交瘤成功地克隆了抗人成骨肉瘤的轻链基因. 单链抗体的应用，无论在细胞内封闭癌蛋白还是体内杀伤肿瘤细胞方面均显示了广泛的应用前景[3,4]. 该方法的优势在于单链抗体分子量小、穿透力强、较好保持抗原亲和性及特异性、免疫原性低、体内半衰期短，易与效应分子相连构成多种新功能的抗体分子如产生双特性Ab及构建免疫毒素等，本结果为骨肉瘤免疫基因治疗的进一步研究奠定了基础.
作者简介:苏海川(1970-), 男(汉族), 辽宁省海城市人. 硕士生(导师范清宇). Tel.(029)3577591(O)
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苏海川(第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所，陕西 西安 710038)
范清宇(第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所，陕西 西安 710038)
张惠中(第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所，陕西 西安 710038)
裘秀春(第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所，陕西 西安 710038)
何大为(第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所，陕西 西安 710038)
参考文献：
[1] Uchida A, Myoui A, Araki N et al. Neoadiunant chemotherapy for pediatric osteosarcoma patients [J]. Cancer, 1997; 79(2):411-415.
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[2] 杨彤涛, 范清宇, 张殿忠et al. 一株人成骨肉瘤细胞系的建立及其特性观察[J]. 第四军医大学学报, 1998;19(3):264.
[3] Werge TM, Baldaari CT, Telford JL. Intracellular single chain Fv antibody inhibits Ras activity in T-cell antigen receptor stimulated jurkat cells [J]. FEBS, 1994;351(1):393-396.
[4] Montano X, Jimenez A. Intracellular expression of the monoclonal anti-ras antibody Y13-259 blocks the transforming activity of ras oncogenes [J]. Cell Growth Different, 1995;6(2): 597-605., 百拇医药
苏海川 范清宇 张惠中 裘秀春 何大为
摘 要: 目的 扩增与人成骨肉瘤细胞特异结合的鼠源性单克隆抗体轻链基因,并对其基因序列进行分析. 方法 用RT-PCR方法从分泌鼠源抗人成骨肉瘤单克隆抗体的杂交瘤细胞(7F6B)扩增出抗体轻链基因, 克隆到pGEM-T载体, 以全自动测序仪测定其轻链基因序列并对其结构进行分析. 结果 7F6B轻链基因由656 bp组成,编码218个氨基酸,序列分析证实该基因可变区序列符合小鼠Ig 轻链基因的氨基酸序列特征. 结论 获得的鼠源性抗成骨肉瘤抗体轻链基因为κⅢ家族,该结果为进一步探讨人成骨肉瘤的免疫治疗研究奠定了基础.
关键词：成骨肉瘤；抗体；杂交瘤
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0 引言
成骨肉瘤是常见的恶性程度极高的骨源性肿瘤，患者往往在术前就已有了微小肺转移灶，加之局部复发，成骨肉瘤患者的预后很差，长期存活率低于60%[1]. 化疗有其局限性，尚不能完全解决转移和复发的问题. 肿瘤的免疫治疗是一种极具潜力的辅助疗法，为探讨单链抗体技术在该肿瘤治疗中的应用意义，我们用RT-PCR方法进行了抗人成骨肉瘤单克隆抗体轻链基因的克隆及分析.
1 材料和方法
1.1 材料 小鼠杂交瘤细胞系7F6B为本室制备,该细胞可分泌抗人成骨肉瘤OS-9607细胞mAb[2], 常规培养于100 mL.L-1小牛血清的RPMI 1640培养液中. 扩增鼠源性抗体轻链基因的PCR引物合成于上海生物工程有限公司(5端引物为2条， P1： 5-CCAG(TA)T(CG)(CT)GAGCTC(GC)(TA)(GC)(AC)T(GC)AC(CA)CAG(AT) CTCCA-3， 5-CCAGTTCCGAGCTCGT(TG)(GT)TGAC(GT)CAG(GC)(AC)(AG)(TC)C(TC)-3; 3端引物为： 5-GCGCCGTCTAGAATTAACA-CTCATTCCTGTTGA-3). 逆转录酶及PCR所用试剂均为 Gibco公司产品. pGEM-T载体为Pro-mega公司产品.
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1.2 方法 取2×107杂交瘤细胞，TRIzol法提取细胞总RNA (Gibco Inc kit,及实验指南). 以细胞总RNA为模板进行cDNA第一链的合成： 3.5 μL RNA, 2 μL 5倍逆转录缓冲液，1 μL Oligo(dT)12,70℃保温10 min,冰浴2 min，加入1 μL 100 mmol.L-1 DTT, 1 μL dNTP, 1 μL RNase inhibitor, 0.5 μL Moloney鼠白血病病毒逆转录酶，37℃反应1 h. 以cDNA第1链为模板，PCR扩增7F6B抗体轻链基因. PCR反应体系为：模板RNA 5 μL，10×PCR缓冲液5 μL, 2.5 mmol.L-1 dNTP 5 μL, 5 μmol.L-1引物5 μL, Taq DNA聚合酶1 μL, 加水至50 μL; 94℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 40 s,反应30个循环. 15 g.L-1琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物. 上述PCR产物于15 g.L-1低熔点琼脂糖凝胶电泳分离后, 切取650 bp大小左右的条带, Wazard Miniprep柱(Promega Inc Kit)回收纯化, 取0.3～0.5 μg回收的PCR产物与100 ng pGEM-T载体进行连接反应,16℃连接16 h. 转化JM109感受态细菌并经蓝白筛选挑取阳性克隆进行扩大培养. 提取重组质粒进行XbaI及SacI双酶切鉴定,同时进行序列测定及分析.
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2 结果
2.1 7F6B mAb轻链基因扩增 应用针对鼠抗体轻链基因5端及3端设计的引物,从7F6B杂交瘤细胞扩增出约650 bp的DNA片段(Fig 1),其DNA片段的大小与预期鼠源性抗体轻链基因大小一致.
2.2 7F6B mAb轻链基因扩增产物的克隆及鉴定 将7F6B轻链基因与pGEM-T载体的连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞, 得到数十个白色转化菌落.挑选十个白色菌落, 提取质粒DNA, 经XbaI及SacI双酶切鉴定,可得到656 bp大小的插入片段(Fig 2).
2.3 7F6B轻链基因测序结果 7F6B轻链基因测序结果表明, 该基因为开放读框,编码218个氨基酸, 与Gene Bank中已发表的序列比较未发现有与其序列相同的基因，说明其为新发现的基因序列. 该基因属于鼠Ig轻链κⅢ家族成员，有明确的4个FR区和3个CDR区， 并有维持抗体可变区空间结构所必需的两个特征性的半胱氨酸残基(序列如下)，表明所得基因序列符合鼠的轻链基因.
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图1 7F6B轻链基因RT-PCR扩增结果
Fig 1 RT-PCR amplification of 7F6B Ab light chain gene
Lane 1: PCR marker; 2: Light chain gene.
图2 重组pGEM-T质粒的XbaI及SacI酶切鉴定
Fig 2 XbaI and SacI enzyme digestion of recombinant pGEM-T plasmid
Lane 1: PCR marker; 2～10: Recombinant plasmid from different colonies digested with XbaI and SacI enzyme.
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3 讨论
骨肉瘤是一种常见恶性程度极高的骨源性肿瘤，易发生肺转移且多发于青少年，严重危害青少年健康和生命，迄今尚无理想的治疗手段. 随着现代分子生物学和免疫学的发展，基因工程抗体的诞生为肿瘤的诊断和治疗带来了希望，尤其是单链抗体的应用成为肿瘤免疫基因治疗的热点. 我们利用本室制备的产生抗人成骨肉瘤细胞的鼠源性杂交瘤成功地克隆了抗人成骨肉瘤的轻链基因. 单链抗体的应用，无论在细胞内封闭癌蛋白还是体内杀伤肿瘤细胞方面均显示了广泛的应用前景[3,4]. 该方法的优势在于单链抗体分子量小、穿透力强、较好保持抗原亲和性及特异性、免疫原性低、体内半衰期短，易与效应分子相连构成多种新功能的抗体分子如产生双特性Ab及构建免疫毒素等，本结果为骨肉瘤免疫基因治疗的进一步研究奠定了基础.
作者简介:苏海川(1970-), 男(汉族), 辽宁省海城市人. 硕士生(导师范清宇). Tel.(029)3577591(O)
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苏海川(第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所，陕西 西安 710038)
范清宇(第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所，陕西 西安 710038)
张惠中(第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所，陕西 西安 710038)
裘秀春(第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所，陕西 西安 710038)
何大为(第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所，陕西 西安 710038)
参考文献：
[1] Uchida A, Myoui A, Araki N et al. Neoadiunant chemotherapy for pediatric osteosarcoma patients [J]. Cancer, 1997; 79(2):411-415.
, http://www.100md.com
[2] 杨彤涛, 范清宇, 张殿忠et al. 一株人成骨肉瘤细胞系的建立及其特性观察[J]. 第四军医大学学报, 1998;19(3):264.
[3] Werge TM, Baldaari CT, Telford JL. Intracellular single chain Fv antibody inhibits Ras activity in T-cell antigen receptor stimulated jurkat cells [J]. FEBS, 1994;351(1):393-396.
[4] Montano X, Jimenez A. Intracellular expression of the monoclonal anti-ras antibody Y13-259 blocks the transforming activity of ras oncogenes [J]. Cell Growth Different, 1995;6(2): 597-605., 百拇医药