苯乙酸对胶质瘤细胞G1期的增殖抑制作用
苯乙酸对胶质瘤细胞G1期的增殖抑制作用
田宇 陈宝琴 赵丛海 田洋 王校复 周建
关键词；苯乙酸；胶质瘤；细胞G1期
恶性胶质瘤是神经系统最常见的原发肿瘤，多种疗法均不能治愈。有研究表明，诱导分化疗法对恶性胶质瘤的生长及恶性度的转化有重要作用。苯乙酸(phenylacetate, PA)在有效剂量范围内，对人体无毒副作用，并可特异地结合血浆中胶质瘤细胞生长所依赖的谷氨酰氨，因而被视为潜在的抗胶质瘤治疗靶点[1]。
近年来研究表明，PA对胶质瘤、乳腺癌、白血病有较强的增殖抑制，并有向分化程度高的方向转化的作用。PA作用的机制，尤其是对细胞周期的影响，目前尚无研究。本实验观察了PA抑制胶质瘤C6细胞增殖及对细胞周期的特殊作用方式，在细胞水平上探讨了PA的作用机理。
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一、材料与方法
1.试剂来源和细胞培养：PA及IMDM培养基为美国Fluka公司产品，小牛血清为长春生物制品所生产，胰蛋白酶为Sigma公司产品。胶质瘤C6细胞株购自美国ATCC(Pockvi, MD)，接种于25 cm2培养瓶中单层培养。培养基含10%热灭活小牛血清(BCS)，加入NaHCO3 2 g/L，青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/L，置于37℃ CO2恒温恒湿培养箱中。
2.细胞增殖：消化培养瓶中处于对数生长期的细胞，制成5×104细胞/ml的细胞悬液，在24孔培养板中每孔接种5×104细胞。24 h后分别加入PA 0，2.5，5.0 mmol/L，分别于以后5 d逐日计数。每日收集细胞的8 h前，每孔加入46.25 kBq[3H]-TdR(中国原子能研究所)，共5 d，测每分钟同位素脉冲数(即CPM值)。
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3.细胞周期：C6细胞接种于24孔培养板，2×104细胞/孔。24 h后分别加入上述各浓度NaPA，在其后第1，3天，采用碘化啶(PI)染色处理，经流式细胞仪(FCM)分析细胞周期各时相的变化。
二、结果
应用PA 1～5 d，各用药组细胞数及细胞CPM值逐日降低，对细胞的增殖抑制率PA 5.0 mmol/L组第5天达95.0%，其效果明显优于2.5，1.25 mmol/L组(74.7%，46.7%)，差异有显著性。表明PA是剂量和时间依赖型且作用极强的诱导分化剂。
FCM定量分析结果表明，在应用PA 24 h后，PA 5.0，2.5 mmol/L组和对照组在G0/G1期比例分别为31.3%、45.1%和56.3%；72 h后，分别为31.4%、56.2%和58.2%。5.0 mmol/L组与对照组比较，差异有显著性(24 h及72 h，P<0.01)，2.5 mmol/L组与对照组比较，24 h时差异有显著性(P<0.05)。G2+M期两组用药组数值持续下降，与对照组比较，差异有显著性(72 h，P<0.01，P<0.05)；S期24 h后，上述各组比例分别为63.3%、45.4%和33.2%；72 h后分别为64.8%、39.0%和30.8%。两用药组与对照组比较，差异有显著性(24 h及72 h，P<0.01，P<0.05)。
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三、讨论
众多研究表明，应用诱导分化剂提高癌细胞分化程度，抑制增殖循环周期，使肿瘤细胞堆积于细胞周期中某一固定时相，是目前降低肿瘤恶性度、减少其转移和复发的最为有效的治疗方法[2]。本实验证实，PA对胶质瘤细胞C6有极明显的增殖抑制作用。用药后CPM值降低，说明肿瘤细胞DNA合成总量减少。FCM研究发现，PA对癌细胞增殖周期的抑制方式与众多S期抑制药物不同，PA主要降低C6细胞G0/G1期和G2+M期的比例。众所周知，处于G0期的细胞为暂时脱离细胞周期不进行增殖的休眠细胞，因此PA抑制G0/G1比例，主要是抑制G1期的细胞。G1期是从有丝分裂完成到DNA复制之前的复制前期，制造产生rRNA、mRNA、tRNA和核蛋白体；G2+M期是RNA和蛋白质的合成期。有研究表明，抑制癌细胞蛋白体合成，可减少胶质瘤细胞U251 isoprenylation蛋白合成。本实验结果表明，PA同时具有抑制C6细胞RNA合成的作用。RNA合成受抑制，可导致细胞结构蛋白和酶蛋白形成的抑制，mRNA是RNA转录过程的重要成分，在PA作用下，癌细胞中的原癌基因mRNA合成受抑制，从而导致转录过程受阻，最终使细胞DNA复制减少。转录过程开始于G1期末期，这一时期是细胞周期运行的关键时刻，也是PA作用的敏感点。同时，RNA作为DNA合成原料的RNA减少，可导致细胞进入S期后，因原料不充足而不能完成所有DNA复制，细胞堆积于S期，使进入G2+M期的细胞数减少，DNA合成总量随之减少。本实验中，PA 2.5 mmol/L组在用药72 h后，G0/G1期回升，接近对照组，说明2.5 mmol/L组对G1期抑制作用较5.0 mmol/L组弱，部分细胞72 h后经DNA修复，重新进入细胞循环周期。
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细胞周期中G0/G1期下降，相对的S期比例升高。而受到致死性损伤的细胞在崩解之前难于与活细胞区别，因此FCM显示S期用药后升高，但此时并不能准确代表癌细胞DNA合成总量增多。PA这种抑制G1期作用方式，与Bacon等[3]应用2-n-丙基戊酸(valproicacid，VA)抑制胶质瘤细胞C6和Stephan等[4]应用hexahydrocolupulone(HHC，25 mmol/L)抑制乳腺癌细胞MCF-7时所报道的作用方式相一致。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39900152)；吉林省科委资助项目(970567-4)
作者单位：田宇(130031 长春，白求恩医科大学中日联谊医院神经外科)
赵丛海(130031 长春，白求恩医科大学中日联谊医院神经外科)
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陈宝琴(吉林省人民医院)
田洋(吉林省中医中药研究院)
王校复(白求恩医科大学附属第二医院)
周建(白求恩医科大学附属第二医院)
参考文献
1.Neish W. Phenylacetic acid as a potential therapeutic agent for the treatment of humen cancer. Experientia (Basel), 1971, 27: 860-862.
2.Dvorit S, Zvi R, Robert H, et al. Selective activity of phenylacetate against malignant glioma: resemblance to fetal brain damage in phenylketonuria. Cancer Res, 1994, 54: 891-895.
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3.Bacon CL, 0′Driscoll E, Regan CM. Valproic acid suppresses G1 phase-dependent sialylation of a 65KDa glycoprotein in the C6 glioma cell cycle. Int J Dev Neurosci, 1997, 15: 777-784.
4 .Stephan TE, Ngo EO, Nutter LM. Hexahydrocolupulone and its antitumor cell proliferation activity in vitro. Biochem Pharmacol, 1998, 55: 505-514., http://www.100md.com(苯乙酸对胶质瘤细胞G1期的增殖抑制作用)
田宇 陈宝琴 赵丛海 田洋 王校复 周建
关键词；苯乙酸；胶质瘤；细胞G1期
恶性胶质瘤是神经系统最常见的原发肿瘤，多种疗法均不能治愈。有研究表明，诱导分化疗法对恶性胶质瘤的生长及恶性度的转化有重要作用。苯乙酸(phenylacetate, PA)在有效剂量范围内，对人体无毒副作用，并可特异地结合血浆中胶质瘤细胞生长所依赖的谷氨酰氨，因而被视为潜在的抗胶质瘤治疗靶点[1]。
近年来研究表明，PA对胶质瘤、乳腺癌、白血病有较强的增殖抑制，并有向分化程度高的方向转化的作用。PA作用的机制，尤其是对细胞周期的影响，目前尚无研究。本实验观察了PA抑制胶质瘤C6细胞增殖及对细胞周期的特殊作用方式，在细胞水平上探讨了PA的作用机理。
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一、材料与方法
1.试剂来源和细胞培养：PA及IMDM培养基为美国Fluka公司产品，小牛血清为长春生物制品所生产，胰蛋白酶为Sigma公司产品。胶质瘤C6细胞株购自美国ATCC(Pockvi, MD)，接种于25 cm2培养瓶中单层培养。培养基含10%热灭活小牛血清(BCS)，加入NaHCO3 2 g/L，青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/L，置于37℃ CO2恒温恒湿培养箱中。
2.细胞增殖：消化培养瓶中处于对数生长期的细胞，制成5×104细胞/ml的细胞悬液，在24孔培养板中每孔接种5×104细胞。24 h后分别加入PA 0，2.5，5.0 mmol/L，分别于以后5 d逐日计数。每日收集细胞的8 h前，每孔加入46.25 kBq[3H]-TdR(中国原子能研究所)，共5 d，测每分钟同位素脉冲数(即CPM值)。
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3.细胞周期：C6细胞接种于24孔培养板，2×104细胞/孔。24 h后分别加入上述各浓度NaPA，在其后第1，3天，采用碘化啶(PI)染色处理，经流式细胞仪(FCM)分析细胞周期各时相的变化。
二、结果
应用PA 1～5 d，各用药组细胞数及细胞CPM值逐日降低，对细胞的增殖抑制率PA 5.0 mmol/L组第5天达95.0%，其效果明显优于2.5，1.25 mmol/L组(74.7%，46.7%)，差异有显著性。表明PA是剂量和时间依赖型且作用极强的诱导分化剂。
FCM定量分析结果表明，在应用PA 24 h后，PA 5.0，2.5 mmol/L组和对照组在G0/G1期比例分别为31.3%、45.1%和56.3%；72 h后，分别为31.4%、56.2%和58.2%。5.0 mmol/L组与对照组比较，差异有显著性(24 h及72 h，P<0.01)，2.5 mmol/L组与对照组比较，24 h时差异有显著性(P<0.05)。G2+M期两组用药组数值持续下降，与对照组比较，差异有显著性(72 h，P<0.01，P<0.05)；S期24 h后，上述各组比例分别为63.3%、45.4%和33.2%；72 h后分别为64.8%、39.0%和30.8%。两用药组与对照组比较，差异有显著性(24 h及72 h，P<0.01，P<0.05)。
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三、讨论
众多研究表明，应用诱导分化剂提高癌细胞分化程度，抑制增殖循环周期，使肿瘤细胞堆积于细胞周期中某一固定时相，是目前降低肿瘤恶性度、减少其转移和复发的最为有效的治疗方法[2]。本实验证实，PA对胶质瘤细胞C6有极明显的增殖抑制作用。用药后CPM值降低，说明肿瘤细胞DNA合成总量减少。FCM研究发现，PA对癌细胞增殖周期的抑制方式与众多S期抑制药物不同，PA主要降低C6细胞G0/G1期和G2+M期的比例。众所周知，处于G0期的细胞为暂时脱离细胞周期不进行增殖的休眠细胞，因此PA抑制G0/G1比例，主要是抑制G1期的细胞。G1期是从有丝分裂完成到DNA复制之前的复制前期，制造产生rRNA、mRNA、tRNA和核蛋白体；G2+M期是RNA和蛋白质的合成期。有研究表明，抑制癌细胞蛋白体合成，可减少胶质瘤细胞U251 isoprenylation蛋白合成。本实验结果表明，PA同时具有抑制C6细胞RNA合成的作用。RNA合成受抑制，可导致细胞结构蛋白和酶蛋白形成的抑制，mRNA是RNA转录过程的重要成分，在PA作用下，癌细胞中的原癌基因mRNA合成受抑制，从而导致转录过程受阻，最终使细胞DNA复制减少。转录过程开始于G1期末期，这一时期是细胞周期运行的关键时刻，也是PA作用的敏感点。同时，RNA作为DNA合成原料的RNA减少，可导致细胞进入S期后，因原料不充足而不能完成所有DNA复制，细胞堆积于S期，使进入G2+M期的细胞数减少，DNA合成总量随之减少。本实验中，PA 2.5 mmol/L组在用药72 h后，G0/G1期回升，接近对照组，说明2.5 mmol/L组对G1期抑制作用较5.0 mmol/L组弱，部分细胞72 h后经DNA修复，重新进入细胞循环周期。
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细胞周期中G0/G1期下降，相对的S期比例升高。而受到致死性损伤的细胞在崩解之前难于与活细胞区别，因此FCM显示S期用药后升高，但此时并不能准确代表癌细胞DNA合成总量增多。PA这种抑制G1期作用方式，与Bacon等[3]应用2-n-丙基戊酸(valproicacid，VA)抑制胶质瘤细胞C6和Stephan等[4]应用hexahydrocolupulone(HHC，25 mmol/L)抑制乳腺癌细胞MCF-7时所报道的作用方式相一致。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39900152)；吉林省科委资助项目(970567-4)
作者单位：田宇(130031 长春，白求恩医科大学中日联谊医院神经外科)
赵丛海(130031 长春，白求恩医科大学中日联谊医院神经外科)
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陈宝琴(吉林省人民医院)
田洋(吉林省中医中药研究院)
王校复(白求恩医科大学附属第二医院)
周建(白求恩医科大学附属第二医院)
参考文献
1.Neish W. Phenylacetic acid as a potential therapeutic agent for the treatment of humen cancer. Experientia (Basel), 1971, 27: 860-862.
2.Dvorit S, Zvi R, Robert H, et al. Selective activity of phenylacetate against malignant glioma: resemblance to fetal brain damage in phenylketonuria. Cancer Res, 1994, 54: 891-895.
, 百拇医药
3.Bacon CL, 0′Driscoll E, Regan CM. Valproic acid suppresses G1 phase-dependent sialylation of a 65KDa glycoprotein in the C6 glioma cell cycle. Int J Dev Neurosci, 1997, 15: 777-784.
4 .Stephan TE, Ngo EO, Nutter LM. Hexahydrocolupulone and its antitumor cell proliferation activity in vitro. Biochem Pharmacol, 1998, 55: 505-514., http://www.100md.com(苯乙酸对胶质瘤细胞G1期的增殖抑制作用)