树突状细胞抑制结直肠癌术后复发和转移初探
树突状细胞抑制结直肠癌术后复发和转移初探
李明松 袁爱力 黄建翔 李国新 陈村龙 张振书
摘要 目的：观察肿瘤抗原激活的树突状细胞(dendritic cell,DC)增强结直肠癌患者抗肿瘤免疫功能，抑制术后复发和转移的可能性。方法：分离结直肠癌根治术后患者外周血单个核细胞(peripheral blood monocyte cell,PBMC)，以人大肠癌细胞系LOVO细胞抗原粗提物激发PBMC中DC，以粒/巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte/macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和白介素-4(interleukin 4,IL-4)联合刺激产生DC，将DC回输给结直肠癌患者，检测结直肠癌患者外周血癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)含量。结果：术后12个月，实验组12例患者的CEA含量为(3±1.4)ng/ml,未发现结直肠癌复发和转移；对照组13例外周血CEA含量为(39±22)ng/ml，其中5例外周血CEA含量较高的患者〔(99±47)ng/ml〕中3例发生结直肠癌转移和(或)复发(2例肝转移，1例复发并肝转移)。结论：肿瘤抗原激活的DC能够增强结直肠癌患者抗肿瘤免疫功能，抑制术后结直肠癌的复发和转移。
, 百拇医药
关键词：结肠肿瘤 复发 肿瘤转移
树突状细胞(dendritic cell,DC)在启动抗肿瘤免疫过程中起关键作用。初步的实验显示，肿瘤抗原激活的DC在黑色素瘤患者中能诱导出具有治疗作用的抗肿瘤免疫[1]。我们使用的DC细胞是在体外经结直肠癌细胞肿瘤抗原粗提物激活，并加入粒/巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte/ macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和白介素-4(interleukin 4,IL-4)，联合刺激结直肠癌根治术后患者外周血单个核细胞(peripheral blood monocyte cell,PBMC)，产生DC，再将DC回输结直肠癌患者，探讨DC能否在结直肠癌患者体内诱导出抑制术后结直肠癌复发和转移的抗肿瘤免疫。
资料与方法
一、临床资料
, 百拇医药
1997年2月至1998年4月经我院病理学诊断确诊的原发性结直肠癌、并行根治术后的患者25例，其中男15例，女10例，年龄32～66岁，平均年龄51岁。患者术前均诊断为Dukes C期和B期。所有患者均接受根治性手术治疗，术后半年内每月接受化疗1 个疗程：5-FU(0.5～0.75g)+四氢叶酸钙(100～200mg)，每天静脉滴注1次，连续5天。25例患者随机分为治疗组和对照组，其临床资料见表1。对照组术后均不再接受任何其他特异性抗肿瘤治疗。治疗组于术后第一周开始接受肿瘤细胞抗原粗提物激活的DC治疗，每周1次，连续3周。术后两组病理情况见表2。术后每3个月复查腹部CT、肠镜及外周血CEA一次，直到术后第12个月，以了解是否有肿瘤复发和转移。
表1 结肠癌患者临床资料
组别
例数
性别
, 百拇医药
平均
年龄
(岁)
外周血CEA含量(ng/ml)
男
女
术前1周
术后1周
对照组
13
9
4
51
, 百拇医药
32±28
3±1.9
实验组
12
8
4
49
39±26
3±1.4
表2 结肠癌患者肿瘤术后病理资料
组别
肿瘤位置
肿瘤
, http://www.100md.com
大小
(cm)
肿瘤分化
肿瘤浸润深度
肠周
淋巴结
转移
左半
结肠
右半
结肠
高
低
, 百拇医药 A
B
C
对照组
7
6
15±6
10
3
3
6
4
4
实验组
, 百拇医药
7
5
17±5
8
4
2
5
5
4
二、方法
1.以淋巴细胞分离液按密度梯度离心法自结直肠癌根治术后患者外周静脉血20ml中分离PBMC[2]。
2.常规培养人大肠癌细胞系LOVO细胞(购自中山医科大学病理研究所)，收集LOVO细胞并用超声细胞破碎仪粉碎，收集LOVO细胞碎片作为肿瘤抗原粗提物[3]。
, 百拇医药
3.肿瘤抗原粗提物(源于1×105个 LOVO细胞)与PBMC在37℃、5% CO2培养箱中培养24h，以激活PBMC 中的DC[3]。
4. PBMC与GM-CSF(600ng/ml)及IL-4(1000u/ml)(均为美国DAKO公司产品)于37℃、5% CO2 培养箱中培养24h，以促进PBMC中DC优势增殖[2]。以抗CD83 单克隆抗体(杜克大学 Thomas F.Tedder Ph.D.惠赠)特异显示增殖后DC(PBMC中仅DC表面特异性表达CD83)。
5.DC治疗结直肠癌根治术后患者：调节DC浓度为1×105个/ml；以患者双侧近趾脚背皮下为注射点，常规消毒，每侧注射0.5ml，1次/周,连续3周。
6.按CEA试剂盒(美国Boehringer mannheim公司产品)操作说明书检测外周血中CEA含量。
, http://www.100md.com
7.统计学方法以χ2检验分析各组间的差异性。
结果
一、经GM-CSF及IL-4联合刺激后，PBMC细胞数量由1×106增至1.8×106个,经抗CD83 单抗特异显示，联合刺激后PBMC中DC纯度为3%，表明联合刺激后PBMC中的DC优势增殖。
二、术后12个月，实验组患者12例外周血中CEA含量为(3±1.2)ng/ml，明显低于术前1周外周血中CEA含量(P<0.01)，腹部CT、肠镜及病理学检查均未发现结直肠癌复发和转移；对照组患者13例外周血中CEA含量为(39±22)ng/ml, 与术前1周外周血中CEA含量相比无明显差异(P>0.05)，但明显高于同期实验组(P<0.01)，其中5例患者外周血中CEA含量为(99±47)ng/ml，经腹部CT、肠镜及病理学检查发现前述5例患者中3例(术前均诊断为Duke C期，术后病理学均诊断为低分化腺癌)发生结直肠癌转移和/或复发(2例分别于术后6个月和9个月出现肝转移；1例于术后11个月复发并肝转移)。
, http://www.100md.com
讨论
经肿瘤细胞粗提物激活的DC治疗后，结直肠癌术后患者外周血中CEA阳性率低，复发和/或转移率亦相应降低，提示DC在结直肠癌患者体内能够诱导抗肿瘤免疫并能抑制直肠癌复发及转移。
CEA在预测结直肠癌复发和转移中有重要参考价值。术后CEA增高提示直肠癌患者可能发生复发和转移。近期实验显示，经TAA激发后， DC能够诱导自体混合T淋巴细胞增殖分化为细胞毒性T细胞(cytotoxical T lymphocyte，CTL)，该CTL及其上清液体外对相应肿瘤细胞有高效而特异的细胞毒作用，在体内不仅能抑制移植瘤生长，并能预防其发生[1,3,4]。表明DC在人和动物体内外均能诱导高效而特异的抗肿瘤免疫。有关肿瘤抗原激活的DC在患者体内诱导的抗肿瘤免疫，抑制结直肠癌复发及转移，其具体机制目前仍不十分清楚。推测可能是经肿瘤抗原激发的DC回输后，在患者体内转移至相关的淋巴结，诱导静止状态的T淋巴细胞增殖分化为CTL，从而启动宿主免疫系统产生抗肿瘤免疫反应[1,5]。
, 百拇医药
结直肠癌术后复发及转移作为恶性肿瘤的生物学特性之一，具有极大的危害。术后化疗虽可部分预防及治疗复发及转移，但化疗药物具有的毒副作用及肿瘤细胞对化疗药物的耐药性使目前化疗效果仍不理想。本文结果显示，经肿瘤抗原激活的DC在肿瘤患者体内诱导的抗肿瘤免疫能抑制结直肠癌术后复发和转移，表明DC有可能在临床抑制肿瘤术后复发和转移中发挥重要作用[5]。
作者单位：李明松(510515 广州，第一军医大学南方医院消化科)
袁爱力(510515 广州，第一军医大学南方医院消化科)
参考文献
1 Nestle FO,Burg G,Dummer R.New perspectives on immunobiology and immunotherapy of melanoma.Immunol Today,1999,20:5-7.
, 百拇医药
2 李明松,袁爱力,赖卓胜,等.GM-CSF及IL-4增强大肠癌患者树突状细胞免疫功能.中国肿瘤临床与康复,1999,6:1-3.
3 李明松,袁爱力,张万岱,等.树突状细胞诱导的抗肿瘤免疫诱导移植瘤细胞调亡并抑制其增殖.世界华人消化杂志, 2000,8:56-58.
4 Celuzzi,CM,Mayordomo JI,Storkus WJ,et al.Peptide-pulsed dendritic cells induce antigen-specific,cytotoxic T lymphocyte mediated protective tumor immunity.J Exp Med,1996,183:283-287.
5 Timmerman JM,Levy R.Dendritic cell vaccines for cancer immunotherapy.Annu Rev Med, 1999,50:507-529., 百拇医药
李明松 袁爱力 黄建翔 李国新 陈村龙 张振书
摘要 目的：观察肿瘤抗原激活的树突状细胞(dendritic cell,DC)增强结直肠癌患者抗肿瘤免疫功能，抑制术后复发和转移的可能性。方法：分离结直肠癌根治术后患者外周血单个核细胞(peripheral blood monocyte cell,PBMC)，以人大肠癌细胞系LOVO细胞抗原粗提物激发PBMC中DC，以粒/巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte/macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和白介素-4(interleukin 4,IL-4)联合刺激产生DC，将DC回输给结直肠癌患者，检测结直肠癌患者外周血癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)含量。结果：术后12个月，实验组12例患者的CEA含量为(3±1.4)ng/ml,未发现结直肠癌复发和转移；对照组13例外周血CEA含量为(39±22)ng/ml，其中5例外周血CEA含量较高的患者〔(99±47)ng/ml〕中3例发生结直肠癌转移和(或)复发(2例肝转移，1例复发并肝转移)。结论：肿瘤抗原激活的DC能够增强结直肠癌患者抗肿瘤免疫功能，抑制术后结直肠癌的复发和转移。
, 百拇医药
关键词：结肠肿瘤 复发 肿瘤转移
树突状细胞(dendritic cell,DC)在启动抗肿瘤免疫过程中起关键作用。初步的实验显示，肿瘤抗原激活的DC在黑色素瘤患者中能诱导出具有治疗作用的抗肿瘤免疫[1]。我们使用的DC细胞是在体外经结直肠癌细胞肿瘤抗原粗提物激活，并加入粒/巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte/ macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和白介素-4(interleukin 4,IL-4)，联合刺激结直肠癌根治术后患者外周血单个核细胞(peripheral blood monocyte cell,PBMC)，产生DC，再将DC回输结直肠癌患者，探讨DC能否在结直肠癌患者体内诱导出抑制术后结直肠癌复发和转移的抗肿瘤免疫。
资料与方法
一、临床资料
, 百拇医药
1997年2月至1998年4月经我院病理学诊断确诊的原发性结直肠癌、并行根治术后的患者25例，其中男15例，女10例，年龄32～66岁，平均年龄51岁。患者术前均诊断为Dukes C期和B期。所有患者均接受根治性手术治疗，术后半年内每月接受化疗1 个疗程：5-FU(0.5～0.75g)+四氢叶酸钙(100～200mg)，每天静脉滴注1次，连续5天。25例患者随机分为治疗组和对照组，其临床资料见表1。对照组术后均不再接受任何其他特异性抗肿瘤治疗。治疗组于术后第一周开始接受肿瘤细胞抗原粗提物激活的DC治疗，每周1次，连续3周。术后两组病理情况见表2。术后每3个月复查腹部CT、肠镜及外周血CEA一次，直到术后第12个月，以了解是否有肿瘤复发和转移。
表1 结肠癌患者临床资料
组别
例数
性别
, 百拇医药
平均
年龄
(岁)
外周血CEA含量(ng/ml)
男
女
术前1周
术后1周
对照组
13
9
4
51
, 百拇医药
32±28
3±1.9
实验组
12
8
4
49
39±26
3±1.4
表2 结肠癌患者肿瘤术后病理资料
组别
肿瘤位置
肿瘤
, http://www.100md.com
大小
(cm)
肿瘤分化
肿瘤浸润深度
肠周
淋巴结
转移
左半
结肠
右半
结肠
高
低
, 百拇医药 A
B
C
对照组
7
6
15±6
10
3
3
6
4
4
实验组
, 百拇医药
7
5
17±5
8
4
2
5
5
4
二、方法
1.以淋巴细胞分离液按密度梯度离心法自结直肠癌根治术后患者外周静脉血20ml中分离PBMC[2]。
2.常规培养人大肠癌细胞系LOVO细胞(购自中山医科大学病理研究所)，收集LOVO细胞并用超声细胞破碎仪粉碎，收集LOVO细胞碎片作为肿瘤抗原粗提物[3]。
, 百拇医药
3.肿瘤抗原粗提物(源于1×105个 LOVO细胞)与PBMC在37℃、5% CO2培养箱中培养24h，以激活PBMC 中的DC[3]。
4. PBMC与GM-CSF(600ng/ml)及IL-4(1000u/ml)(均为美国DAKO公司产品)于37℃、5% CO2 培养箱中培养24h，以促进PBMC中DC优势增殖[2]。以抗CD83 单克隆抗体(杜克大学 Thomas F.Tedder Ph.D.惠赠)特异显示增殖后DC(PBMC中仅DC表面特异性表达CD83)。
5.DC治疗结直肠癌根治术后患者：调节DC浓度为1×105个/ml；以患者双侧近趾脚背皮下为注射点，常规消毒，每侧注射0.5ml，1次/周,连续3周。
6.按CEA试剂盒(美国Boehringer mannheim公司产品)操作说明书检测外周血中CEA含量。
, http://www.100md.com
7.统计学方法以χ2检验分析各组间的差异性。
结果
一、经GM-CSF及IL-4联合刺激后，PBMC细胞数量由1×106增至1.8×106个,经抗CD83 单抗特异显示，联合刺激后PBMC中DC纯度为3%，表明联合刺激后PBMC中的DC优势增殖。
二、术后12个月，实验组患者12例外周血中CEA含量为(3±1.2)ng/ml，明显低于术前1周外周血中CEA含量(P<0.01)，腹部CT、肠镜及病理学检查均未发现结直肠癌复发和转移；对照组患者13例外周血中CEA含量为(39±22)ng/ml, 与术前1周外周血中CEA含量相比无明显差异(P>0.05)，但明显高于同期实验组(P<0.01)，其中5例患者外周血中CEA含量为(99±47)ng/ml，经腹部CT、肠镜及病理学检查发现前述5例患者中3例(术前均诊断为Duke C期，术后病理学均诊断为低分化腺癌)发生结直肠癌转移和/或复发(2例分别于术后6个月和9个月出现肝转移；1例于术后11个月复发并肝转移)。
, http://www.100md.com
讨论
经肿瘤细胞粗提物激活的DC治疗后，结直肠癌术后患者外周血中CEA阳性率低，复发和/或转移率亦相应降低，提示DC在结直肠癌患者体内能够诱导抗肿瘤免疫并能抑制直肠癌复发及转移。
CEA在预测结直肠癌复发和转移中有重要参考价值。术后CEA增高提示直肠癌患者可能发生复发和转移。近期实验显示，经TAA激发后， DC能够诱导自体混合T淋巴细胞增殖分化为细胞毒性T细胞(cytotoxical T lymphocyte，CTL)，该CTL及其上清液体外对相应肿瘤细胞有高效而特异的细胞毒作用，在体内不仅能抑制移植瘤生长，并能预防其发生[1,3,4]。表明DC在人和动物体内外均能诱导高效而特异的抗肿瘤免疫。有关肿瘤抗原激活的DC在患者体内诱导的抗肿瘤免疫，抑制结直肠癌复发及转移，其具体机制目前仍不十分清楚。推测可能是经肿瘤抗原激发的DC回输后，在患者体内转移至相关的淋巴结，诱导静止状态的T淋巴细胞增殖分化为CTL，从而启动宿主免疫系统产生抗肿瘤免疫反应[1,5]。
, 百拇医药
结直肠癌术后复发及转移作为恶性肿瘤的生物学特性之一，具有极大的危害。术后化疗虽可部分预防及治疗复发及转移，但化疗药物具有的毒副作用及肿瘤细胞对化疗药物的耐药性使目前化疗效果仍不理想。本文结果显示，经肿瘤抗原激活的DC在肿瘤患者体内诱导的抗肿瘤免疫能抑制结直肠癌术后复发和转移，表明DC有可能在临床抑制肿瘤术后复发和转移中发挥重要作用[5]。
作者单位：李明松(510515 广州，第一军医大学南方医院消化科)
袁爱力(510515 广州，第一军医大学南方医院消化科)
参考文献
1 Nestle FO,Burg G,Dummer R.New perspectives on immunobiology and immunotherapy of melanoma.Immunol Today,1999,20:5-7.
, 百拇医药
2 李明松,袁爱力,赖卓胜,等.GM-CSF及IL-4增强大肠癌患者树突状细胞免疫功能.中国肿瘤临床与康复,1999,6:1-3.
3 李明松,袁爱力,张万岱,等.树突状细胞诱导的抗肿瘤免疫诱导移植瘤细胞调亡并抑制其增殖.世界华人消化杂志, 2000,8:56-58.
4 Celuzzi,CM,Mayordomo JI,Storkus WJ,et al.Peptide-pulsed dendritic cells induce antigen-specific,cytotoxic T lymphocyte mediated protective tumor immunity.J Exp Med,1996,183:283-287.
5 Timmerman JM,Levy R.Dendritic cell vaccines for cancer immunotherapy.Annu Rev Med, 1999,50:507-529., 百拇医药