氧化砷诱导耐药MR2细胞凋亡的机理研究
作者：王学文 庄昱洲 孙桂勤 吴波 钱晓萍 吴直江
单位：王学文 庄昱洲 孙桂勤 吴波(210002 南京军区南京总医院)；钱晓萍(现在南京大学附属鼓楼医院肿瘤科)；吴直江(上海细胞生物研究所)
关键词：氧化砷；白血病；细胞凋亡；P糖蛋白；拓扑异构酶Ⅱ
江苏医药001011 【摘要】 目的 探讨As2O3诱导耐药急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞凋亡的机制。方法 以耐维甲酸早幼粒白血病细胞株MR2为研究对象，非耐药早幼粒细胞白血病NB4为对照组，利用流式细胞仪、DNA电泳、免疫组化等手段，观察As2O3治疗耐药APL细胞的效应途径。结果 As2O3能显著诱导MR2细胞凋亡。MR2细胞P-糖蛋白(PgP)表达(30%～40%)较NB4细胞(10%～20%)明显增强(P<0.001)，MR2细胞topoⅡβ表达(17.6±6.18～26.5±10.01)较NB4细胞(28.8±3.37～38.3±9.28)明显降低(P<0.05)。0.5～2.0μmol/L As2O3能显著降低MR2细胞PgP表达和增强topoⅡβ表达(P均<0.05)。结论 topoⅡβ表达降低和PgP高表达可能参与维甲酸耐药机制。调节topoⅡβ和PgP表达可能是As2O3诱导MR2细胞凋亡的机制之一。
, http://www.100md.com
Study on the mechanisms of arsenic trioxide(As2O3) induced apoptosis in the resistant cell line(MR2)
QIAN Xiaoping WANG Xueweng ZHUANG Yuzhou et al.
(Nanjing General Hospital of PLA，Nanjing 210002)
【Abstract】 Objective To investigate the possible mechanisms of arsenic trioxide-induced apoptosis of retinoic acid(RA) resistant to acute promyelocytic leukemia(APL).Methods APL cell line MR2 resistant to RA was used for in vitro studies.APL cell line NB4 was used for control.The effect of As2O3 on MR-2 cell line was observed by using flow cytometry，DNA electrophoresis，and immunocytochemical assays.Results As2O3 could induced apoptosis of MR2 cell.The P-glycoprotein(PgP) expression rates were significantly higher in MR2 cell line(30%～40%)than in NB4 cell line(10%～20%)(P<0.001).The expressions of DNA topoisomerase Ⅱβ(topoⅡβ)were significantly lower in MR2 cell line(17.6±6.18～26.5±10.01)than in NB4 cell line(28.8±3.37～38.3±9.28)(P<0.05).0.5～2.0μmol/L As2O3 significantly decreased the PgP expression and increased topoⅡβ expression in MR2 cell line.(P<0.05).Conclusions The lower expression of topoⅡβ and the higher expression of PgP might take part in the retinoic acid resistant leukemia mechanisms.Regulation of the expression of topoⅡβ and of PgP might be one of the mechanisms of As2O3 induced MR2 cell apoptosis.
, 百拇医药
【Key words】 Arsenic trioxide Leukemia Apoptosis P-glycoprotein Topoisomerase Ⅱ
近年来张鹏等报道As2O3治疗复发和难治性APL完全缓解(CR)率已达52.3%～93.3%[1，2]。陈国强实验证实As2O3具有诱导细胞凋亡作用[3]。我们用As2O3诱导耐维甲酸MR2细胞凋亡，观察其topoⅡα和β亚型及PgP的变化，对As2O3治疗耐维甲酸APL作用机理进行探讨，现报告如下。
材料和方法
一、试剂
0.1%As2O3溶液由钟山制药厂提供，以磷酸盐缓冲液(PBS)配制成1mmol/L的氧化砷贮存液。PgP单抗及免疫组化SP-Kit购自福州迈新公司，topoⅡα和β单抗为美国NEOMARKERS公司产品。
, 百拇医药
二、细胞培养
NB4为APL细胞株，MR2为维甲酸耐药株，均由上海第二医科大学陈竺院士馈赠。细胞于含10%小牛血清RPMI1640中常规传代培养。实验用细胞均处于对数生长期。
三、DNA电泳
细胞经As2O3处理48小时后，PBS(pH7.4)清洗两遍，加入两倍体积裂解液(75μM NaCl，10mM Tris，pH 8.0，10mM EDTA，0.5%SDS，proteinase K0.15mg/ml)50℃，3小时。13 000rpm，10分钟，取上清，等体积酚/氯仿抽提一次，加入两倍体积纯酒精，-20℃过夜。离心，弃上清。70%酒精漂洗两次，自然干燥。加入含100μg/ml RNAse的TE缓冲液50μ1，65℃30min。加入10μl上样液，2%琼脂糖凝胶电泳，60V，1小时。溴化乙啶染色，紫外线下拍照记录结果。
, 百拇医药
四、细胞形态观察和流式细胞仪检测
细胞经As2O3处理，瑞-姬染色，镜下观察并拍照。细胞用PBS清洗2次，加入无水乙醇固定24小时以上(4℃)，清洗细胞，与含1%RNA酶的Tris-HCL缓冲液(pH7.4)共同孵育(37℃)30分钟，后用碘化丙锭进行DNA染色。用流式细胞仪分析不同DNA含量的细胞分布。每份标本检测10 000个细胞。资料均经lysisⅡ软件收集、贮存和分析。
五、免疫组化分析
收集经As2O3不同处理的NB4、MR2细胞涂片，凉干后经丙酮4℃固定15分钟，并依次与鼠抗人PgP、topoⅡα和β抗体4℃孵育24小时。然后再与酶偶联的鼠抗二抗在37℃孵育30分钟。用0.5%DAB底物反应显色，PgP抗体标本用苏木素染料复染，topoⅡα和topoⅡβ抗体标本用伊红复染。PgP阳性染色标准为计数200个细胞，以阳性细胞数<10%，10%～19%，20%～29%，30%～39%，≥40%来半定量为0，1，2，3，4级。topoⅡα和topoⅡβ结果用HPIAS-500型图像分析仪根据染色绝对灰度定量分析。
, 百拇医药
六、统计学处理
结果以
±s表示，PgP和topoⅡα、topoⅡβ数据为3次重复独立实验结果。topoⅡα、topoⅡβ数据采用统计软件STATISTICA5.0版本进行方差(ANOVA)分析，PgP数据采用统计软件STATISTICA进行非参数Mann-white U检验。
结果
一、As2O3能诱导NB4、MR2细胞凋亡
0.5～2μmol/LAs2O3诱导NB4、MR2细胞48～72小时后显示典型的凋亡形态学特征：
1.胞体皱缩，核深染，出现凋亡小体(图1)。
, 百拇医药
2.0.5～2μmol/L As2O3诱导NB4、MR2细胞48小时后，2%琼脂糖凝胶电泳显现出明显的梯状泳带(图2)。
图1 1.0μmol/L As2O3处理MR2细胞72小时，胞体变小，核碎裂，可见凋亡小体(瑞氏-吉姆萨染色，×100)
图2 As2O3处理NB4，MR2细胞DNA电泳图
NB4(1～4)As2O3浓度为0.5、1.0、2.0、0μmol/L
, http://www.100md.com
MR2(5～8)As2O3浓度为2.0、1.0、0.5、0μmol/L
3.用流式细胞仪分析细胞DNA含量分布，显示典型的凋亡细胞群。其DNA含量低于G1期细胞，PI染色经lysis Ⅱ软件分析凋亡细胞的数量显示呈时间和剂量依赖性，见表1。
二、As2O3诱导NB4、MR2细胞后PgP改变
未经As2O3诱导时，MR2较NB4细胞PgP表达明显增强(P<0.001)。经0.5～2.0μmol/L As2O3诱导2～6天后，随着As2O3浓度增加、时间延长，MR2细胞PgP表达明显减弱，见表2。
, http://www.100md.com 表1 流式细胞仪分析As2O3诱导NB4、MR2细胞凋亡(%) 时间(天)
NB4(μmol/L)
MR2(μmol/L)
0
0.25
0.5
1.0
2.0
0
0.25
0.5
1.0
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2.0
0
1.8
3.5
3.6
3.2
5.4
5.8
8.5
7.5
7.8
7.8
1
, 百拇医药 3.5
5.8
8.7
17.8
15.0
7.4
10.2
9.5
9.8
12.2
2
8.0
7.4
, 百拇医药 8.7
19.9
26.8
8.6
10.2
11.1
11.7
15.5
3
55.8
48.3
62.6
67.8
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77.4
8.1
14.9
21.6
22.7
28.7
4
65.5
73.1
73.9
80.5
81.7
12.3
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21.9
42.0
45.2
55.1
5
74.3
80.9
79.5
78.7
87.3
30.2
40.3
88.2
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88.2
88.3
6
77.5
78.7
81.5
91.6
88.9
66.0
89.1
89.8
89.8
90.2
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表2 As2O3诱导NB4、MR2细胞后PgP蛋白表达(半定量分析) 时间(天)
NB4(μmol/L)
MR2(μmol/L)
0
0.25
0.5
1.0
2.0
0
0.25
0.5
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2.0
1
1
1
1
0
1
3
3
2
2
2
2
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1
1
0
1
1
3
3
2
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1
3
1
0
1
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1
0
3
2
1
1
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4
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0
1
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3
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2
2
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0
5
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1
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0
3
2
2
1
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0
6
1
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1
0
0
3
3
2
1
0
三、As2O3诱导NB4、MR2细胞后topoⅡα、topoⅡβ改变
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1.未经As2O3诱导时，MR2较NB4细胞topoⅡβ表达明显降低(P<0.05)。经0.5～2.0μmol/L As2O3诱导2～5天后，随着As2O3浓度增加，MR2细胞topoⅡβ表达明显增强，高峰期在第2、3天，持续5天。见表3。
2.经0.25～2.0μmol/L As2O3诱导NB4、MR2细胞1～6天后，各组topoⅡα表达均在30.1±5.25～35.3±7.38之间，topoⅡα表达与As2O3作用浓度及时间无关。表3 As2O3诱导NB4、MR2细胞后topoⅡβ蛋白表达(±s) 时间(天)
, 百拇医药
NB4(μmol/L)
MR2(μmol/L)
0
0.25
0.5
1.0
2.0
0
0.25
0.5
1.0
2.0
1
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30.7±7.5
33.3±5.2
36.2±9.4
33.3±10.2
35.5±4.1
17.6±6.2
21.1±4.6
24.4±4.42
25.2±3.57
27.8±5.77
2
33.2±8.7
, 百拇医药
38.0±9.1
38.6±8.9
45.7±2.8
20.7±9.4
20.7±9.4
21.6±12.4
37.3±12.3
41.8±9.9
51.0±18.6
3
38.8±9.3
39.4±14.9
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39.8±10.6
50.7±11.2
66.7±13.1
26.5±10.0
29.3±14.3
35.8±9.4
48.9±18.9
54.4±12.3
4
30.9±4.2
31.0±11.8
34.3±15.6
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46.7±10.2
51.3±12.2
17.9±2.9
21.2±12.5
35.3±13.5
46.7±8.8
51.8±11.7
5
30.5±5.5
30.8±7.7
33.6±8.7
44.5±9.6
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50.1±7.7
20.5±5.5
21.5±8.9
38.5±7.2
43.4±9.8
54.9±9.3
6
28.8±3.4
28.9±10.1
29.4±5.9
33.7±5.9
35.7±7.4
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19.7±9.9
20.9±8.4
28.5±6.7
29.8±8.3
33.3±8.1
讨论
As2O3作为治疗耐药APL有效药物为肿瘤的治疗开创了新的途径。并已实验证实细胞凋亡为As2O3治疗耐药APL的机制[3，4]。我们的实验也进一步证实了As2O3能诱导APL NB4和耐维甲酸MR2细胞凋亡，且呈时间和剂量依赖性。
PgP高表达是多药耐药的主要机制[5]。本组试验显示耐维甲酸MR2细胞PgP表达明显高于非耐药NB4细胞，0.5～2μmol/L As2O3能明显降低耐维甲酸MR2细胞PgP表达，PgP表达与浓度呈负相关。表明PgP高表达可能参与维甲酸耐药机制。
, 百拇医药
topo酶Ⅱ是调控DNA拓扑构象的酶，分为topoⅡα和β亚型，参与DNA复制、转录、重组等许多重要活动。topoⅡβ与药物耐药的关系越来越受到重视。Herzog等在人白血病HL-60/AMSA耐药细胞中发现topoⅡβ表达较HL-60细胞明显减少[6]。Aoyama等用全反式维甲酸(RA)诱导HL-60细胞分化，发现RA诱导48小时时，topoⅡα和topoⅡβ蛋白分别增加2～4倍和4～8倍，并持续96小时[7]。显示肿瘤细胞耐药性与topoⅡβ表达降低有关，诱导白血病细胞分化可与能topoⅡβ增加有关。本组资料显示，耐RA的MR2细胞topoⅡβ表达降低，As2O3可增加topoⅡβ表达。在一定浓度范围内，其表达与药物浓度成正相关。
以上结果表明：topoⅡβ表达降低与PgP高表达共同参与APL耐维甲酸机制。As2O3可能通过增加topoⅡβ表达与降低PgP高表达来诱导耐维甲酸APL细胞凋亡。
, 百拇医药
(志谢：衷心感谢上海血液病研究所陈竺院士、陈国强副教授，南京铁道医学院陈宝安副教授在实验中给予大力支持。)
参考文献
1，张鹏，王树叶，胡龙虎，等.三氧化二砷注射液治疗72例急性早幼粒细胞白血病.中华血液学杂志，1996，17：58-60.
2，Shou ZX，Chen GQ，Ni JH，et al.Use of arsenic trioxide (As2O3) in the treatment of APL：Ⅱ. clinical efficacy and pharmacokinetic in relapsed patients.Blood，1997，89：3354-3360.
3，Chen GQ，Zhu J，Shi XG，et al.In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide (As2O3) in the treatment of acute promyelocytic leukemia：As2O3 induces NB4 cell apoptosis with downregulation of bc1-2 expression and modulation of PML-RAR α/PML proteins.Blood，1996，88：1052-1061.
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4，蔡循，贾培敏，石学耕，等.氧化砷诱导维甲酸耐药早幼粒细胞白血病细胞(MR2)凋亡的体外研究.中华血液学杂志，1998，19：339-341.
5，Leith C.Multidrug resistance in leukemia.Cuor opin Hematol，1998，5：287-291.
6，Herzog CE，Holes KA，Taschong LM，et al.Absence of topoisomerase Ⅱ beta in an amsacrine-resistant human leukemia cell line with mutant topoisomerase Ⅱ alpha.Cancer Res， 1998，58：5298-5300.
7，Aoyama M，Grabowski DR，Lsaacs RJ，et al.Altered expression and activity of topoisomerases during all-trans retinoic acid-induced differentiation of HL-60 cells.Blood，1998，92：2863-2870.
收稿：1999-10-12
修回：2000-03-06, 百拇医药
单位：王学文 庄昱洲 孙桂勤 吴波(210002 南京军区南京总医院)；钱晓萍(现在南京大学附属鼓楼医院肿瘤科)；吴直江(上海细胞生物研究所)
关键词：氧化砷；白血病；细胞凋亡；P糖蛋白；拓扑异构酶Ⅱ
江苏医药001011 【摘要】 目的 探讨As2O3诱导耐药急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞凋亡的机制。方法 以耐维甲酸早幼粒白血病细胞株MR2为研究对象，非耐药早幼粒细胞白血病NB4为对照组，利用流式细胞仪、DNA电泳、免疫组化等手段，观察As2O3治疗耐药APL细胞的效应途径。结果 As2O3能显著诱导MR2细胞凋亡。MR2细胞P-糖蛋白(PgP)表达(30%～40%)较NB4细胞(10%～20%)明显增强(P<0.001)，MR2细胞topoⅡβ表达(17.6±6.18～26.5±10.01)较NB4细胞(28.8±3.37～38.3±9.28)明显降低(P<0.05)。0.5～2.0μmol/L As2O3能显著降低MR2细胞PgP表达和增强topoⅡβ表达(P均<0.05)。结论 topoⅡβ表达降低和PgP高表达可能参与维甲酸耐药机制。调节topoⅡβ和PgP表达可能是As2O3诱导MR2细胞凋亡的机制之一。
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Study on the mechanisms of arsenic trioxide(As2O3) induced apoptosis in the resistant cell line(MR2)
QIAN Xiaoping WANG Xueweng ZHUANG Yuzhou et al.
(Nanjing General Hospital of PLA，Nanjing 210002)
【Abstract】 Objective To investigate the possible mechanisms of arsenic trioxide-induced apoptosis of retinoic acid(RA) resistant to acute promyelocytic leukemia(APL).Methods APL cell line MR2 resistant to RA was used for in vitro studies.APL cell line NB4 was used for control.The effect of As2O3 on MR-2 cell line was observed by using flow cytometry，DNA electrophoresis，and immunocytochemical assays.Results As2O3 could induced apoptosis of MR2 cell.The P-glycoprotein(PgP) expression rates were significantly higher in MR2 cell line(30%～40%)than in NB4 cell line(10%～20%)(P<0.001).The expressions of DNA topoisomerase Ⅱβ(topoⅡβ)were significantly lower in MR2 cell line(17.6±6.18～26.5±10.01)than in NB4 cell line(28.8±3.37～38.3±9.28)(P<0.05).0.5～2.0μmol/L As2O3 significantly decreased the PgP expression and increased topoⅡβ expression in MR2 cell line.(P<0.05).Conclusions The lower expression of topoⅡβ and the higher expression of PgP might take part in the retinoic acid resistant leukemia mechanisms.Regulation of the expression of topoⅡβ and of PgP might be one of the mechanisms of As2O3 induced MR2 cell apoptosis.
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【Key words】 Arsenic trioxide Leukemia Apoptosis P-glycoprotein Topoisomerase Ⅱ
近年来张鹏等报道As2O3治疗复发和难治性APL完全缓解(CR)率已达52.3%～93.3%[1，2]。陈国强实验证实As2O3具有诱导细胞凋亡作用[3]。我们用As2O3诱导耐维甲酸MR2细胞凋亡，观察其topoⅡα和β亚型及PgP的变化，对As2O3治疗耐维甲酸APL作用机理进行探讨，现报告如下。
材料和方法
一、试剂
0.1%As2O3溶液由钟山制药厂提供，以磷酸盐缓冲液(PBS)配制成1mmol/L的氧化砷贮存液。PgP单抗及免疫组化SP-Kit购自福州迈新公司，topoⅡα和β单抗为美国NEOMARKERS公司产品。
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二、细胞培养
NB4为APL细胞株，MR2为维甲酸耐药株，均由上海第二医科大学陈竺院士馈赠。细胞于含10%小牛血清RPMI1640中常规传代培养。实验用细胞均处于对数生长期。
三、DNA电泳
细胞经As2O3处理48小时后，PBS(pH7.4)清洗两遍，加入两倍体积裂解液(75μM NaCl，10mM Tris，pH 8.0，10mM EDTA，0.5%SDS，proteinase K0.15mg/ml)50℃，3小时。13 000rpm，10分钟，取上清，等体积酚/氯仿抽提一次，加入两倍体积纯酒精，-20℃过夜。离心，弃上清。70%酒精漂洗两次，自然干燥。加入含100μg/ml RNAse的TE缓冲液50μ1，65℃30min。加入10μl上样液，2%琼脂糖凝胶电泳，60V，1小时。溴化乙啶染色，紫外线下拍照记录结果。
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四、细胞形态观察和流式细胞仪检测
细胞经As2O3处理，瑞-姬染色，镜下观察并拍照。细胞用PBS清洗2次，加入无水乙醇固定24小时以上(4℃)，清洗细胞，与含1%RNA酶的Tris-HCL缓冲液(pH7.4)共同孵育(37℃)30分钟，后用碘化丙锭进行DNA染色。用流式细胞仪分析不同DNA含量的细胞分布。每份标本检测10 000个细胞。资料均经lysisⅡ软件收集、贮存和分析。
五、免疫组化分析
收集经As2O3不同处理的NB4、MR2细胞涂片，凉干后经丙酮4℃固定15分钟，并依次与鼠抗人PgP、topoⅡα和β抗体4℃孵育24小时。然后再与酶偶联的鼠抗二抗在37℃孵育30分钟。用0.5%DAB底物反应显色，PgP抗体标本用苏木素染料复染，topoⅡα和topoⅡβ抗体标本用伊红复染。PgP阳性染色标准为计数200个细胞，以阳性细胞数<10%，10%～19%，20%～29%，30%～39%，≥40%来半定量为0，1，2，3，4级。topoⅡα和topoⅡβ结果用HPIAS-500型图像分析仪根据染色绝对灰度定量分析。
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六、统计学处理
结果以
±s表示，PgP和topoⅡα、topoⅡβ数据为3次重复独立实验结果。topoⅡα、topoⅡβ数据采用统计软件STATISTICA5.0版本进行方差(ANOVA)分析，PgP数据采用统计软件STATISTICA进行非参数Mann-white U检验。结果
一、As2O3能诱导NB4、MR2细胞凋亡
0.5～2μmol/LAs2O3诱导NB4、MR2细胞48～72小时后显示典型的凋亡形态学特征：
1.胞体皱缩，核深染，出现凋亡小体(图1)。
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2.0.5～2μmol/L As2O3诱导NB4、MR2细胞48小时后，2%琼脂糖凝胶电泳显现出明显的梯状泳带(图2)。
图1 1.0μmol/L As2O3处理MR2细胞72小时，胞体变小，核碎裂，可见凋亡小体(瑞氏-吉姆萨染色，×100)
图2 As2O3处理NB4，MR2细胞DNA电泳图
NB4(1～4)As2O3浓度为0.5、1.0、2.0、0μmol/L
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MR2(5～8)As2O3浓度为2.0、1.0、0.5、0μmol/L
3.用流式细胞仪分析细胞DNA含量分布，显示典型的凋亡细胞群。其DNA含量低于G1期细胞，PI染色经lysis Ⅱ软件分析凋亡细胞的数量显示呈时间和剂量依赖性，见表1。
二、As2O3诱导NB4、MR2细胞后PgP改变
未经As2O3诱导时，MR2较NB4细胞PgP表达明显增强(P<0.001)。经0.5～2.0μmol/L As2O3诱导2～6天后，随着As2O3浓度增加、时间延长，MR2细胞PgP表达明显减弱，见表2。
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NB4(μmol/L)
MR2(μmol/L)
0
0.25
0.5
1.0
2.0
0
0.25
0.5
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22.7
28.7
4
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12.3
, http://www.100md.com
21.9
42.0
45.2
55.1
5
74.3
80.9
79.5
78.7
87.3
30.2
40.3
88.2
, 百拇医药
88.2
88.3
6
77.5
78.7
81.5
91.6
88.9
66.0
89.1
89.8
89.8
90.2
, 百拇医药
表2 As2O3诱导NB4、MR2细胞后PgP蛋白表达(半定量分析) 时间(天)
NB4(μmol/L)
MR2(μmol/L)
0
0.25
0.5
1.0
2.0
0
0.25
0.5
, http://www.100md.com 1.0
2.0
1
1
1
1
0
1
3
3
2
2
2
2
, 百拇医药
1
1
0
1
1
3
3
2
1
1
3
1
0
1
, 百拇医药
1
0
3
2
1
1
1
4
1
1
0
1
1
3
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2
2
1
0
5
1
1
1
1
0
3
2
2
1
, 百拇医药
0
6
1
1
1
0
0
3
3
2
1
0
三、As2O3诱导NB4、MR2细胞后topoⅡα、topoⅡβ改变
, http://www.100md.com
1.未经As2O3诱导时，MR2较NB4细胞topoⅡβ表达明显降低(P<0.05)。经0.5～2.0μmol/L As2O3诱导2～5天后，随着As2O3浓度增加，MR2细胞topoⅡβ表达明显增强，高峰期在第2、3天，持续5天。见表3。
2.经0.25～2.0μmol/L As2O3诱导NB4、MR2细胞1～6天后，各组topoⅡα表达均在30.1±5.25～35.3±7.38之间，topoⅡα表达与As2O3作用浓度及时间无关。表3 As2O3诱导NB4、MR2细胞后topoⅡβ蛋白表达(
±s) 时间(天), 百拇医药
NB4(μmol/L)
MR2(μmol/L)
0
0.25
0.5
1.0
2.0
0
0.25
0.5
1.0
2.0
1
, http://www.100md.com
30.7±7.5
33.3±5.2
36.2±9.4
33.3±10.2
35.5±4.1
17.6±6.2
21.1±4.6
24.4±4.42
25.2±3.57
27.8±5.77
2
33.2±8.7
, 百拇医药
38.0±9.1
38.6±8.9
45.7±2.8
20.7±9.4
20.7±9.4
21.6±12.4
37.3±12.3
41.8±9.9
51.0±18.6
3
38.8±9.3
39.4±14.9
, 百拇医药
39.8±10.6
50.7±11.2
66.7±13.1
26.5±10.0
29.3±14.3
35.8±9.4
48.9±18.9
54.4±12.3
4
30.9±4.2
31.0±11.8
34.3±15.6
, 百拇医药
46.7±10.2
51.3±12.2
17.9±2.9
21.2±12.5
35.3±13.5
46.7±8.8
51.8±11.7
5
30.5±5.5
30.8±7.7
33.6±8.7
44.5±9.6
, 百拇医药
50.1±7.7
20.5±5.5
21.5±8.9
38.5±7.2
43.4±9.8
54.9±9.3
6
28.8±3.4
28.9±10.1
29.4±5.9
33.7±5.9
35.7±7.4
, 百拇医药
19.7±9.9
20.9±8.4
28.5±6.7
29.8±8.3
33.3±8.1
讨论
As2O3作为治疗耐药APL有效药物为肿瘤的治疗开创了新的途径。并已实验证实细胞凋亡为As2O3治疗耐药APL的机制[3，4]。我们的实验也进一步证实了As2O3能诱导APL NB4和耐维甲酸MR2细胞凋亡，且呈时间和剂量依赖性。
PgP高表达是多药耐药的主要机制[5]。本组试验显示耐维甲酸MR2细胞PgP表达明显高于非耐药NB4细胞，0.5～2μmol/L As2O3能明显降低耐维甲酸MR2细胞PgP表达，PgP表达与浓度呈负相关。表明PgP高表达可能参与维甲酸耐药机制。
, 百拇医药
topo酶Ⅱ是调控DNA拓扑构象的酶，分为topoⅡα和β亚型，参与DNA复制、转录、重组等许多重要活动。topoⅡβ与药物耐药的关系越来越受到重视。Herzog等在人白血病HL-60/AMSA耐药细胞中发现topoⅡβ表达较HL-60细胞明显减少[6]。Aoyama等用全反式维甲酸(RA)诱导HL-60细胞分化，发现RA诱导48小时时，topoⅡα和topoⅡβ蛋白分别增加2～4倍和4～8倍，并持续96小时[7]。显示肿瘤细胞耐药性与topoⅡβ表达降低有关，诱导白血病细胞分化可与能topoⅡβ增加有关。本组资料显示，耐RA的MR2细胞topoⅡβ表达降低，As2O3可增加topoⅡβ表达。在一定浓度范围内，其表达与药物浓度成正相关。
以上结果表明：topoⅡβ表达降低与PgP高表达共同参与APL耐维甲酸机制。As2O3可能通过增加topoⅡβ表达与降低PgP高表达来诱导耐维甲酸APL细胞凋亡。
, 百拇医药
(志谢：衷心感谢上海血液病研究所陈竺院士、陈国强副教授，南京铁道医学院陈宝安副教授在实验中给予大力支持。)
参考文献
1，张鹏，王树叶，胡龙虎，等.三氧化二砷注射液治疗72例急性早幼粒细胞白血病.中华血液学杂志，1996，17：58-60.
2，Shou ZX，Chen GQ，Ni JH，et al.Use of arsenic trioxide (As2O3) in the treatment of APL：Ⅱ. clinical efficacy and pharmacokinetic in relapsed patients.Blood，1997，89：3354-3360.
3，Chen GQ，Zhu J，Shi XG，et al.In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide (As2O3) in the treatment of acute promyelocytic leukemia：As2O3 induces NB4 cell apoptosis with downregulation of bc1-2 expression and modulation of PML-RAR α/PML proteins.Blood，1996，88：1052-1061.
, http://www.100md.com
4，蔡循，贾培敏，石学耕，等.氧化砷诱导维甲酸耐药早幼粒细胞白血病细胞(MR2)凋亡的体外研究.中华血液学杂志，1998，19：339-341.
5，Leith C.Multidrug resistance in leukemia.Cuor opin Hematol，1998，5：287-291.
6，Herzog CE，Holes KA，Taschong LM，et al.Absence of topoisomerase Ⅱ beta in an amsacrine-resistant human leukemia cell line with mutant topoisomerase Ⅱ alpha.Cancer Res， 1998，58：5298-5300.
7，Aoyama M，Grabowski DR，Lsaacs RJ，et al.Altered expression and activity of topoisomerases during all-trans retinoic acid-induced differentiation of HL-60 cells.Blood，1998，92：2863-2870.
收稿：1999-10-12
修回：2000-03-06, 百拇医药