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编号:10207025
血小板纤维蛋白原结合试验及应用
http://www.100md.com 《江苏医药》 2000年第10期
     作者:韩悦 王兆钺 朱明清 耿美菊 阮长耿

    单位:(215006 苏州医学院附属第一医院、江苏省血液研究所)

    关键词:

    江苏医药001033 血小板的主要生理功能是参与止血与血栓形成。正常血液中,血小板处于“静息”状态,当血小板受到一定刺激时被活化,膜空间构形发生改变,GPⅡb-Ⅲa复合物的纤维蛋白原受体位点暴露,与纤维蛋白原结合导致血小板聚集。任何原因引起的GPⅡb-Ⅲa或纤维蛋白原本身的缺陷均可引起血小板膜纤维蛋白原结合的降低。我们利用抗纤维蛋白原单抗,建立在流式细胞仪上检测全血中血小板膜纤维蛋白原结合的方法,这对于出血性疾病的诊断以及抗栓药物监测都有重要意义。

    材料和方法

    一、标本来源
, 百拇医药
    12名血小板无力症(GT)患者均为我院门诊病人。其中男4例,女8例,中位年龄10岁,患者均有反复出血史,出血时间延长,ADP聚集缺陷,瑞斯托霉素聚集正常或接近正常。所有患者血小板膜糖蛋白GPⅠb正常,10名GPⅡb、Ⅲa明显减少甚至缺失(<25%),2名患者GPⅡb、Ⅲa仅部分减少。12名正常人为健康志愿者,年龄、性别与患者匹配。

    二、方法

    静脉(3.8%枸橼酸三钠抗凝,V∶V,1∶9)或末梢采血,取50μl以0.01M,pH 7.4的PBS 1∶10稀释,加入ADP(Sigma产品,终浓度10μM)刺激15分钟。

    1.血小板无力症检测

    间接法:50μlADP刺激稀释全血,分别加入含10μlPBS或抗纤维蛋白原单抗SZ65(本室研制)的塑料管中室温反应30分,PBS洗涤2次,加FITC-羊抗鼠IgG20μl(武汉生物公司产品),避光温育30分钟,洗涤2遍,PBS悬浮,待测。
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    直接法:50μlADP刺激稀释全血,分别加入含10μlFITC-鼠IgG及FITC-SZ65(本室研制)的塑料管中,避光温育30分钟,洗涤2遍,PBS悬浮、待测。

    2.抗血小板制剂药效检测

    正常ADP刺激稀释全血100μl,依次加入含20μlC7E3(比利时Coller博士馈赠,抗GPⅡb-Ⅲa复合物单抗),SZ21(本室研制,抗GPⅢa单抗)及474(加拿大与本室合作产品,抗GPⅡb-Ⅲa复合物单抗)的塑料管中温育30分钟。各自等分,分别加入10μlFITC-鼠IgG及FITC-SZ65,避光温育30分钟,洗涤2遍后PBS悬浮。

    3.血小板的流式细胞仪分析

    应用Epics-XL型流式细胞仪(美国Coulter公司),选择波长488nm的氩离子激发光,通过前向角散射与侧向角散射,将血小板群与其他颗粒及细胞区分,设置血小板门,收集5?000至10?000个血小板,测定荧光标记阳性的血小板百分率及平均荧光强度。
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    4.统计学处理

    数据以均数±标准差表示,显著性用t检验。

    结果

    一、正常组血小板膜纤维蛋白原结合范围:间接法,荧光阳性血小板百分率(89.75±8.54)%,平均荧光强度8.95±2.06。直接法,则分别为(80.6±10)%,2.08±0.34。

    二、12例患者纤维蛋白原结合均在正常范围低值以下,其中间接法荧光阳性血小板百分率(34.08±12.44)%,平均荧光强度0.88±0.40,直接法分别为(22.56±2.85)%,0.43±0.24,均明显低于正常组(P<0.01)。

    三、加入C7E3,SZ21,474等制剂血小板膜纤维蛋白原结合荧光阳性血小板百分率分别为(12.3±2.5)%,(25.8±4.8)%,(73±8)%,平均荧光强度则依次为0.36±0.12,0.58±0.18及1.89±0.35。与正常组直接法比较,C7E3及SZ21均使纤维蛋白原结合明显降低(P<0.01)。474亦使纤维蛋白原结合降低(P<0.05)。三种抑制剂对纤维蛋白原结合的这种抑制作用具有显著差异(P<0.01),C7E3明显强于SZ21,后者又强于474。
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    讨论

    血小板表面含有丰富的膜糖蛋白,这在血小板止血与血栓形成过程中起着重要的作用,其中血小板膜GPⅡb-Ⅲa复合物由GPⅡb和GPⅢa以1∶1的比例构成的粘附分子受体。当血小板活化时,GPⅡb-Ⅲa的空间构形发生改变,血小板表面出现较多的纤维蛋白原识别位点,导致纤维蛋白原GPⅡb-Ⅲa结合,促使血小板聚集。

    GT患者是GPⅡb-Ⅲa复合物质或量的异常导致血小板聚集功能障碍引起的出血性疾病。近年来随着流式细胞仪与GPⅡb、Ⅲa单抗的应用,血小板膜糖蛋白GPⅡb、Ⅲa量的缺陷快速检测成为可能。但是GPⅡb-Ⅲa复合物的缺陷导致的变异型GT临床难以快速诊断。这类病人血小板膜糖蛋白仅部分缺陷或接近正常,难以直接根据血小板膜糖蛋白的检测进行确诊。本组实验12例患者中有2例血小板膜糖蛋白GPⅡb、Ⅲa仅部分缺陷,但血小板膜纤维蛋白原结合明显降低,说明该试验对GT尤其是其变异型的诊断有重要意义。

, http://www.100md.com     抗血小板药物是抗血栓治疗的主要方法之一,其中阿司匹林、噻氯匹定已广泛用于血栓治疗与预防。C7E3是国际上一个新的抗血栓药物,作为抗GPⅡb-Ⅲa复合物的单抗,它能与GPⅡb-Ⅲa结合从而拮抗血小板与纤维蛋白原的作用来抑制血小板聚集,发挥抗栓作用,在PTCA与心绞痛治疗上已取得了满意的效果。我们在体外实验中亦证实C7E3明显抑制纤维蛋白原结合,SZ21、474也能抑制血栓的形成,但SZ21作为抗GPⅢa的单抗抑制血小板膜纤维蛋白原结合明显弱于C7E3,474的作用则更为微弱。因此纤维蛋白原结合试验能在抗栓药物研制过程中起重要作用。

    流式细胞仪作为一项新兴技术,结合单克隆抗体把灵敏、快速、特异的诊断措施引入临床。血小板膜纤维蛋白原结合试验的推广能为GT等出血性疾病的诊断及抗血栓药物的研制提供简捷、经济的新手段。, 百拇医药