耐药逆转剂联合应用对肾癌细胞多药耐药性的逆转作用
作者：余玉明 苏泽轩
单位：余玉明(解放军第157医院泌尿外科 广州 510510)；苏泽轩(暨南大学医学院第一附属医院泌尿外科)
关键词：耐药性；肾肿瘤；癌；环孢素A；丁硫氨酸亚矾胺
中国现代医学杂志001025 目的：探讨肾癌细胞多药耐药的机理及克服耐药的方法。方法：通过肾癌细胞体外实验观察两种逆转剂单独或联合应用对多药耐药的逆转作用。结果：环孢素A(CsA)小剂量(≤1mg/L)单独应用可以逆转RCC925肾癌细胞对阿霉素和长春新碱的耐药，丁硫氨酸亚矾胺(BSO)在无细胞毒性剂量下(<56μM)单独应用可以逆转RCC925细胞对阿霉素的耐药，但对长春新碱无效。28μM的丁硫氨酸亚矾胺和小剂量环孢素A联合应用逆转效果优于单独应用。结论：针对不同耐药机制的逆转剂联合应用是克服肾癌细胞多药耐药的有益尝试。
分类号 R737.11
, 百拇医药
肾癌细胞的多药耐药性是肾癌化疗失败的主要原因。耐药逆转剂的应用是目前克服肿瘤细胞多经药耐药的一个研究方向。Larsson[1]等曾把CsA和BSO联合应用作用于耐药小细胞肺癌，取得较好的逆转效果，但未见用于肾癌细胞，我们把二者联合应用来逆转肾癌细胞对阿霉素(ADM)和长春新碱(VCR)的耐药，取得了较好效果。
1 材料和方法
1.1 材料
RCC925肾癌细胞系由南京大学医学院惠赠，该细胞具有天然药物耐药性，对ADM低度耐药，对VCR高度耐药[2]。CsA购自Sandoz公司；BSO和MTT购自Sigma公司。
1.2 体外细胞毒实验
取对数生长期的RCC925细胞，常规消化计数，接种至96孔细胞培养板，每孔细胞数为5×103，培养24h后每孔加入不同浓度的药物及逆转剂，继续培养48h，以MTT法检测细胞存活率。
, 百拇医药
1.3 MTT检测方法
细胞和药物共同孵育48h后加入MTT溶液(5mg/ml)20μl/孔，继续培养4h后，弃去上清，加入10%SDS200μl/孔，充分溶解甲瓒结晶后，酶联仪测OD值。计算细胞存活率。
1.4 结果统计分析
本实验数据均以
±sd表达，统计学分析应用SPSS软件包，采用正交设计的方差分析法。P<0.05为显著性标准。
2 结果
2.1 CsA及BSO对RCC925细胞存活率的影响
浓度0.125mg/L、0.25mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L的CsA和RCC925细胞共孵育48h后，细胞存活率大于91.2%，表明CsA浓度在2mg/L以下对细胞生长无明显抑制作用。
, 百拇医药
浓度分别为7μM、14μM、28μM、56μM的BSO和RCC925细胞孵育后细胞存活率分别率大于92.4%，表明BSO浓度在56μM以下对细胞生长无明显抑制作用。
2.2 ADM与不同逆转剂组联合应用对RCC925细胞存活率的影响
ADM浓度取4mg/L,CsA取0mg/L、0.25mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L，BSO取0、7μM、14μM、28μM。
表1 ADM与不同逆转联合应用对RCC925细胞存活率的影响 BSO(μM)
CsA(mg/L)
0
0.25
0.5
, 百拇医药
1.0
0
82.0±2.00
57.1±0.611)
47.8±1.851)
42.6±2.061)
7
77.1±1.961)
56.6±2.952)
41.4±0.352)3)
, 百拇医药
39.5±1.622)
14
76.2±2.571)
56.3±2.312)
42.0±1.502)3)
39.3±0.922)
28
72.5±1.061)
48.0±2.272)3)
41.1±0.232)3)
, http://www.100md.com
33.2±0.232)3)
注：1)与只加ADM组比较P<0.05
2)与ADM加单种组逆转剂BSO组比较P<0.05
3)与ADM加单种组逆转剂CsA组比较P<0.05
由表1可知，单独应用逆转剂CsA或BSO都能逆转RCC925细胞对ADM的耐药(P<0.05)。CsA和BSO联合应用效果均优于单独应用BSO(P<0.05)，浓度为0.5mg/L的CsA与不同剂量的BSO联合应用效果优于单独应用CsA(P<0.05)。CsA和浓度为28μMBSO联用效果优于单独应用(P<0.05)。
2.3 VCR与不同逆转剂联合应用时RCC925细胞存活率的影响
, 百拇医药 VCR浓度取4mg/L，CsA取0、0.25mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L，BSO取0、7μΜ、14μΜ、28μΜ。
表2 VCR与不同逆转剂联合应用时RCC925细胞的存活率 BSO(μM)
CsA(mg/L)
0
0.25
0.5
1.0
0
90.6±1.88
85.0±0.191)
, 百拇医药
69.7±1.821)
65.7±2.591)
7
90.6±0.86
80.4±1.582)3)
69.2±2.692)
64.2±0.702)
14
90.4±1.93
78.9±1.762)3)
, http://www.100md.com
68.4±0.582)
63.8±2.992)
28
88.4±2.82
73.9±0.702)3)
64.1±2.252)3)
57.7±0.352)3)
注：1)与只加ADM组比较P<0.05
2)与ADM加单种组逆转剂BSO组比较P<0.05
3)与ADM加单种组逆转剂CsA组比较P<0.05
, 百拇医药
由表2可知，单独应用CsA可以逆转RCC925细胞对VCR的耐药性(P<0.05)，单独应用BSO无逆转作用。CsA和BSO联合应用效果优于单独应用BSO(P<0.05)，0.25mg/L的CsA和BSO联合应用效果优于单独应用CsA或BSO(P<0.05)，28μM/L的BSO和CsA联合应用时效果优于单独应用CsA或BSO(P<0.05)。
3 讨论
近年来，国内外学者针对肿瘤细胞的不同耐药机制进行了较广泛的研究，研究的共同特点是应用针对某种单一耐药机制的逆转剂或单种逆转剂和生物制剂联用，因逆转剂用量较大，本身的毒副作用已限制了其应用，再者多药耐药性的多机制特点也使单种逆转剂的效果受到限制。
本实验发现，小剂量的环孢素A(≤1mg/L)可以逆转肾癌细胞对阿霉素和长春新碱的耐药。γ-谷氨酰环化酶抑制剂BSO在无细胞毒性剂量(56μM/L)下可逆转肾细胞癌对ADM的耐药，但对VCR却无作用。小计量的CsA和BSO联合应用取得了优于单种逆转剂的效果，两种逆转剂的计旦均接近人体的耐受范围。环孢素A的逆转作用可能与其阻断P糖蛋白转运途径相关，BSO的逆转作用可能与其降低癌细胞内GSH有关[3]。有报道指出，BSO可能影响多药耐药的另一机制多药耐药相关蛋白(MRP)途径[4]，因此也不排除通过MRP起作用的可能。本实验提示，针对不同或多种耐药机制的逆转剂联合应用不失为克服多药耐药的一种有益尝试，肾癌细胞的多药耐药有多种机制参与，具体机理有待进一步研究。
, http://www.100md.com
参考文献
1，Larsson R,Bergh J,Nygren P.Combination of cyclosporin A and buthioine sulfoximine(BSO) as a pharmacological strategy for circumuention of multidrug resitstance in small cell lung cancer lines slected for esistance to doxorubicin.Anticancer-Res,1991;11:455
2，李 楠，于励民，周志耀，等.环孢素A对肾癌细胞多重耐药性的逆转作用.中华泌尿外科杂志，1996；17：286～287
3，Mickisch G,Bier H,Bergler W,et al.P-170 glycoprotein,glutathione and associated enzymes in relation to chemoresistance of primary human renal cell carcinomas.Urol Int,1990;45:170
4，Zaman GJ,Lankelma J,Van Teuingen O,et al.Role of glutathione in the export of compounds from cells by the multidrug-resistance-associated protein.Proc-Natl-Acad-sci USA,1995;92:7690
(1999-12-27收稿), 百拇医药
单位：余玉明(解放军第157医院泌尿外科 广州 510510)；苏泽轩(暨南大学医学院第一附属医院泌尿外科)
关键词：耐药性；肾肿瘤；癌；环孢素A；丁硫氨酸亚矾胺
中国现代医学杂志001025 目的：探讨肾癌细胞多药耐药的机理及克服耐药的方法。方法：通过肾癌细胞体外实验观察两种逆转剂单独或联合应用对多药耐药的逆转作用。结果：环孢素A(CsA)小剂量(≤1mg/L)单独应用可以逆转RCC925肾癌细胞对阿霉素和长春新碱的耐药，丁硫氨酸亚矾胺(BSO)在无细胞毒性剂量下(<56μM)单独应用可以逆转RCC925细胞对阿霉素的耐药，但对长春新碱无效。28μM的丁硫氨酸亚矾胺和小剂量环孢素A联合应用逆转效果优于单独应用。结论：针对不同耐药机制的逆转剂联合应用是克服肾癌细胞多药耐药的有益尝试。
分类号 R737.11
, 百拇医药
肾癌细胞的多药耐药性是肾癌化疗失败的主要原因。耐药逆转剂的应用是目前克服肿瘤细胞多经药耐药的一个研究方向。Larsson[1]等曾把CsA和BSO联合应用作用于耐药小细胞肺癌，取得较好的逆转效果，但未见用于肾癌细胞，我们把二者联合应用来逆转肾癌细胞对阿霉素(ADM)和长春新碱(VCR)的耐药，取得了较好效果。
1 材料和方法
1.1 材料
RCC925肾癌细胞系由南京大学医学院惠赠，该细胞具有天然药物耐药性，对ADM低度耐药，对VCR高度耐药[2]。CsA购自Sandoz公司；BSO和MTT购自Sigma公司。
1.2 体外细胞毒实验
取对数生长期的RCC925细胞，常规消化计数，接种至96孔细胞培养板，每孔细胞数为5×103，培养24h后每孔加入不同浓度的药物及逆转剂，继续培养48h，以MTT法检测细胞存活率。
, 百拇医药
1.3 MTT检测方法
细胞和药物共同孵育48h后加入MTT溶液(5mg/ml)20μl/孔，继续培养4h后，弃去上清，加入10%SDS200μl/孔，充分溶解甲瓒结晶后，酶联仪测OD值。计算细胞存活率。
1.4 结果统计分析
本实验数据均以
±sd表达，统计学分析应用SPSS软件包，采用正交设计的方差分析法。P<0.05为显著性标准。2 结果
2.1 CsA及BSO对RCC925细胞存活率的影响
浓度0.125mg/L、0.25mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L的CsA和RCC925细胞共孵育48h后，细胞存活率大于91.2%，表明CsA浓度在2mg/L以下对细胞生长无明显抑制作用。
, 百拇医药
浓度分别为7μM、14μM、28μM、56μM的BSO和RCC925细胞孵育后细胞存活率分别率大于92.4%，表明BSO浓度在56μM以下对细胞生长无明显抑制作用。
2.2 ADM与不同逆转剂组联合应用对RCC925细胞存活率的影响
ADM浓度取4mg/L,CsA取0mg/L、0.25mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L，BSO取0、7μM、14μM、28μM。
表1 ADM与不同逆转联合应用对RCC925细胞存活率的影响 BSO(μM)
CsA(mg/L)
0
0.25
0.5
, 百拇医药
1.0
0
82.0±2.00
57.1±0.611)
47.8±1.851)
42.6±2.061)
7
77.1±1.961)
56.6±2.952)
41.4±0.352)3)
, 百拇医药
39.5±1.622)
14
76.2±2.571)
56.3±2.312)
42.0±1.502)3)
39.3±0.922)
28
72.5±1.061)
48.0±2.272)3)
41.1±0.232)3)
, http://www.100md.com
33.2±0.232)3)
注：1)与只加ADM组比较P<0.05
2)与ADM加单种组逆转剂BSO组比较P<0.05
3)与ADM加单种组逆转剂CsA组比较P<0.05
由表1可知，单独应用逆转剂CsA或BSO都能逆转RCC925细胞对ADM的耐药(P<0.05)。CsA和BSO联合应用效果均优于单独应用BSO(P<0.05)，浓度为0.5mg/L的CsA与不同剂量的BSO联合应用效果优于单独应用CsA(P<0.05)。CsA和浓度为28μMBSO联用效果优于单独应用(P<0.05)。
2.3 VCR与不同逆转剂联合应用时RCC925细胞存活率的影响
, 百拇医药 VCR浓度取4mg/L，CsA取0、0.25mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L，BSO取0、7μΜ、14μΜ、28μΜ。
表2 VCR与不同逆转剂联合应用时RCC925细胞的存活率 BSO(μM)
CsA(mg/L)
0
0.25
0.5
1.0
0
90.6±1.88
85.0±0.191)
, 百拇医药
69.7±1.821)
65.7±2.591)
7
90.6±0.86
80.4±1.582)3)
69.2±2.692)
64.2±0.702)
14
90.4±1.93
78.9±1.762)3)
, http://www.100md.com
68.4±0.582)
63.8±2.992)
28
88.4±2.82
73.9±0.702)3)
64.1±2.252)3)
57.7±0.352)3)
注：1)与只加ADM组比较P<0.05
2)与ADM加单种组逆转剂BSO组比较P<0.05
3)与ADM加单种组逆转剂CsA组比较P<0.05
, 百拇医药
由表2可知，单独应用CsA可以逆转RCC925细胞对VCR的耐药性(P<0.05)，单独应用BSO无逆转作用。CsA和BSO联合应用效果优于单独应用BSO(P<0.05)，0.25mg/L的CsA和BSO联合应用效果优于单独应用CsA或BSO(P<0.05)，28μM/L的BSO和CsA联合应用时效果优于单独应用CsA或BSO(P<0.05)。
3 讨论
近年来，国内外学者针对肿瘤细胞的不同耐药机制进行了较广泛的研究，研究的共同特点是应用针对某种单一耐药机制的逆转剂或单种逆转剂和生物制剂联用，因逆转剂用量较大，本身的毒副作用已限制了其应用，再者多药耐药性的多机制特点也使单种逆转剂的效果受到限制。
本实验发现，小剂量的环孢素A(≤1mg/L)可以逆转肾癌细胞对阿霉素和长春新碱的耐药。γ-谷氨酰环化酶抑制剂BSO在无细胞毒性剂量(56μM/L)下可逆转肾细胞癌对ADM的耐药，但对VCR却无作用。小计量的CsA和BSO联合应用取得了优于单种逆转剂的效果，两种逆转剂的计旦均接近人体的耐受范围。环孢素A的逆转作用可能与其阻断P糖蛋白转运途径相关，BSO的逆转作用可能与其降低癌细胞内GSH有关[3]。有报道指出，BSO可能影响多药耐药的另一机制多药耐药相关蛋白(MRP)途径[4]，因此也不排除通过MRP起作用的可能。本实验提示，针对不同或多种耐药机制的逆转剂联合应用不失为克服多药耐药的一种有益尝试，肾癌细胞的多药耐药有多种机制参与，具体机理有待进一步研究。
, http://www.100md.com
参考文献
1，Larsson R,Bergh J,Nygren P.Combination of cyclosporin A and buthioine sulfoximine(BSO) as a pharmacological strategy for circumuention of multidrug resitstance in small cell lung cancer lines slected for esistance to doxorubicin.Anticancer-Res,1991;11:455
2，李 楠，于励民，周志耀，等.环孢素A对肾癌细胞多重耐药性的逆转作用.中华泌尿外科杂志，1996；17：286～287
3，Mickisch G,Bier H,Bergler W,et al.P-170 glycoprotein,glutathione and associated enzymes in relation to chemoresistance of primary human renal cell carcinomas.Urol Int,1990;45:170
4，Zaman GJ,Lankelma J,Van Teuingen O,et al.Role of glutathione in the export of compounds from cells by the multidrug-resistance-associated protein.Proc-Natl-Acad-sci USA,1995;92:7690
(1999-12-27收稿), 百拇医药