针对肿瘤血管内皮细胞的抗癌治疗研究进展
作者：张莉 刘皋林
单位：张莉(第二军医大学长征医院药学部， 上海 200003)；刘皋林(第二军医大学长征医院药学部， 上海 200003)
关键词：血管肿瘤；基因疗法；抗肿瘤药
第二军医大学学报001028
[摘要] 肿瘤血管内皮细胞不易产生耐药性，药物 容易到达，少量破坏即可引起大量癌细胞死亡。以血管网络为靶子的抗癌治疗相关药物，如 细胞因子TNF-α、化疗制剂秋水仙碱、黄酮醋酸(FAA)、二甲基磺醌醋酸(DMXAA)、 combre tastatin-A4 phosphate等抗癌作用已经得到证实。毒性蛋白质基因，将无毒前药转变成有 毒产物的基因，经过特殊改造后能识别肿瘤血管内皮细胞的逆转录病毒和腺病毒载体，以及 肿瘤血管内皮细胞上特异性抗原决定簇的诱导等基因治疗研究显示出良好的抗癌前景。
, 百拇医药
[中图分类号] R 979.1 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)10-0987-04
实体肿瘤的生长依赖肿瘤内部血管网络的形成，在癌细胞和相关巨噬细胞释放的血管内 皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)促进下，大量新生血管形成 ，癌细胞持续增生，氧气和葡萄糖大量消耗，酸性代谢产物堆积，刺激新生血管形成[ 1]，新血管又促进癌细胞群体的迅速膨胀，循环往复。阻止血管的形成和功能将是肿瘤 治疗的重要途径。以肿瘤血管内皮细胞为靶子的基因治疗途径主要有两个，一是干扰新生血 管的形成；二是破坏肿瘤血管网络。在抗肿瘤新生血管形成上已经取得了引人瞩目的成绩。 如金属蛋白酶抑制因子、多硫戊聚糖、TNP-470抗血管生长制剂、flk-1酪氨酸激酶活性的 选择性抑制因子、血管生长抑制因子、VEGF受体以及属内皮细胞增生抑制因子的血管抑素(a ngiostatin)和内抑素(endostatin)等都被证实有较强的抗癌活性[2，3]。Angiost atin为第一个从肿瘤细胞中分离、具有强烈抑制血管生成作用的物质，它不是由肿瘤细胞直 接产生，某些肿瘤细胞如前列腺癌细胞可以产生或激活某些蛋白酶，由这些蛋白酶将纤维蛋 白溶酶原前体裂解并释放出多肽片段。Endostatin 是胶原ⅩⅧ的裂解片段，是具有高度特 异性的内皮细胞特异抑制因子。而破坏已经形成的血管网络的研究进展相对较少，本文仅就 以破坏癌组织内部已经形成的血管网络为手段的抗癌治疗研究现状作一综述。
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1 肿瘤内部血管网络在肿瘤生长消退中的作用
实体肿瘤的血管蒂扭曲、血管受损或某些细菌感染后引起的血栓形成，可诱发肿瘤消退 ，阻断血液供应，造成局部缺血，使癌细胞大量死亡。延长缺血时间，可将肿瘤治愈。破坏 肿瘤相关血管已成为肿瘤治疗的又一途径，它具有许多直接以癌细胞为靶子的抗癌治疗所不 具备的优势：第一、每个小血管供应数量庞大的细胞群，损伤少量的血管内皮细胞就可引起 大量癌细胞死亡，产生放大效应；第二、血管内皮细胞与血流接触紧密，克服了以癌细胞为 靶子时常见的药物传递困难；第三、血管内皮细胞是非转化性的，发生耐药性突变的机会较 少。以肿瘤血管作为靶子的成败的关键在于找出肿瘤血管与正常组织内部血管之间的差异 [2，3]。现有资料表明，与正常组织血管相比，肿瘤血管内皮细胞增生迅速，新生血 管多；对低氧环境和酸性代谢产物更加敏感。由于与癌细胞相互靠近，癌细胞又可能改变其 血管内皮细胞的特性，从而制备以肿瘤血管为特异攻击目标的化学和生物制剂成为可能。
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2 抗肿瘤血管网络细胞因子、化学制剂及抗体
2.1 细胞因子 肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor α， TNF-α)是一种由 于细胞感染或注射内毒素诱导机体产生的细胞因子，当TNF-α含量达到一定水平后，既能 够直接杀死癌细胞，还能够引起血管内皮细胞损伤，产生出血性和凝固性坏死，从而使肿瘤 消退[4]。由于TNF-α具有强烈毒副作用，最大耐受剂量与有效治疗剂量之间仅有 10倍的差异，全身给药时，难于取得理想的治疗效果，以局部灌注给药疗效良好。
2.2 化学制剂 黄酮醋酸(flavone acetic acid， FAA)和二甲基磺醌醋酸(dime thylxanthenone acetic acid， DMXAA) 是两个化学结构相似的化合物，具有选择性攻击和 损伤肿瘤血管的作用[5，6]，其作用机制尚不十分清楚。初步研究结果显示，DMXA A能够诱导人类和小鼠肿瘤组织内部激活的巨噬细胞释放TNF-α。FFA仅能诱导小鼠巨噬细 胞释放TNF-α。DMXAA治疗肿瘤的临床试验正在部分国家进行。
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2.3 微管蛋白聚合抑制因子 微管蛋白聚合(tubulin polymerization)抑制因子 对血管的作用已经引起了不少学者的注意[7，8]，秋水仙碱、长春新碱、长春碱( podophyllotoxin)等微管蛋白聚合抑制因子能引起肿瘤内部新生的毛细血管损伤，造成出 血性广泛坏死。Combretastin -A4磷酸酯显著改变新生血管内皮细胞的构象，改变毛细血 管血流量，暴露血管基底膜，引起广泛的出血和凝血，对处于分裂状态的内皮细胞具有强烈 的细胞毒和抗增生效应，而对处于静止状态的细胞无明显作用。有关详细机制正在研究之中 。
2.4 抗肿瘤血管内皮细胞抗体 以癌细胞为攻击目标的“生物导弹”的最大缺陷 之一是药物难于直接攻击目标。以肿瘤血管内皮细胞为靶子的生物疗法有效地克服了这一困 难。利用干扰素-γ(interferon-γ， IFN-γ)能显著增强肿瘤相关的血管内皮细胞上主 要组织相容性复合体(MHC-Ⅱ)抗原表达的特性[9]，用IFN-γ转染肿瘤内皮细 胞，再将蓖麻毒素与抗MHC的单克隆抗体交联，将单克隆抗体交联的毒素导入体内后，蓖麻 毒素聚集在高表达MHC-Ⅱ抗原的肿瘤血管内皮细胞，破坏内皮细胞，激发局部血栓形成， 造成肿瘤组织坏死。研究表明，translocated in extraskeletal chondrosarcoma -11(TE C-11)，VEGF-N末端、整合素αⅤβ3 和酪氨酸激酶(Tie-1)的受体等在肿瘤血管 内皮细胞的表达相对较强，其配体可能具有引导生物导弹的潜在的应用价值。寻找更加特异 的肿瘤血管内皮细胞抗原决定簇是该项研究成败的关键。
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3 以肿瘤血管为靶子的基因疗法
3.1 治疗性基因 近年来有关肿瘤基因疗法在直接杀伤、或(和)增强血管内皮 细胞对放疗或化疗制剂的敏感性，增强化疗和放疗的抗癌效果方面取得了巨大进展，筛选出 大量相关基因[10]。其中，最有前景的基因包括：编码有毒的蛋白质抑制基因，如 绿脓杆菌外毒素A基因；将无毒前药转变成有生物学活性的代谢产物的基因，如单纯疱疹病 毒胸苷激酶基因、带状疱疹病毒胸苷激酶基因、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因等。实验表明只 有在实体肿瘤中那种特殊的微环境中，这些基因的毒性产物才被大量激活，暴露在缺血环境 中的血管内皮细胞对这些基因编码的毒性酶尤其敏感。另外一些编码凝固因子基因的研究正 在进行之中。构建编码在人体内安全、实用而高效的、仅仅作用于肿瘤相关的血管内皮细胞 的基因，还需要进一步努力。
3.2 逆转录病毒载体 静止状态的内皮细胞更新一次需要长达数月之久，肿瘤血 管内皮细胞增生活跃，几天就更新一次。逆转录病毒载体只感染增生的细胞，从而可选择性 感染血管内皮细胞。体外研究表明，逆转录病毒载体能感染内皮细胞并在其中高度表达 [11]。给大鼠注射利多卡因4 d后，明显增强诱导血管生成作用，此时给大鼠后肢注射 含有编码耐热的人类胎盘碱性磷酸酶，指示基因中的pLJ逆转录病毒悬液，转基因在内皮细 胞和肌细胞中持续高水平表达21 d以上，而对照组未经利多卡因诱导的、血管增生不明显的 大鼠始终未见转基因表达。
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逆转录病毒载体在体内有广泛的受体，影响了其转染效率和安全性。改造病毒载体表面包膜 糖蛋白，使之仅仅与靶细胞表面特异受体结合是目前研究的重点之一。大多数逆转录病毒载 体都是以莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus，MMLV)为基础改造而建立 起来的[12]，该病毒包膜糖蛋白上有两个共价联结区，一个被称为SU(gp70)区，另 一个被称为TM(gp20)区，它们来自单一前体分子PR90env。其氨基端SU肽使病毒结合到受体 上，而羧基端TM区使这个分子锚定在病毒体表面。另外TM区还包括一个被称为融合肽的疏水 区，该区在病毒的摄取中发挥着重要作用。最近证实，如果将免疫球蛋白可变区的抗原结合 位点与逆转录病毒包膜蛋白的SU区联结起来，就能使病毒感染有特殊表面分子的细胞。将Ig G的A蛋白结合区与Sindbis病毒载体联结也产生了类似效果。将野生型ecotropic env 糖蛋 白基因和红细胞生成素基因嵌合至逆转录病毒载体，使之产生了专一攻击表达促红细胞素受 体效果。
, 百拇医药 从以上研究成果证实，通过对MMLV包膜蛋白的SU区进行遗传学改造，能够改变逆转录病毒颗 粒结合的靶细胞种类和部位[13]。将一个能与细胞表面配体进行反应的蛋白质嵌合 到病毒包膜蛋白质中时，能使病毒特异感染带配体的细胞。确定参与肿瘤相关血管内皮细胞 迁移、增生的蛋白质，细胞因子或其他衍生因子成为该领域重要课题。
最近发现，噬菌体产生一个九肽，这个九肽与整合素αⅤβ具有强大亲和力，αⅤβ特 异表达在活跃的血管生成部位的内皮细胞上，注射该噬菌体到动物体内，它首先出现在肿瘤 部位。产生与细胞外基质蛋白-纤维联结蛋白(extracellular matrix protein-fibronec tin， ECMP-FN)片段反应的单链抗体的噬菌体也首先出现在肿瘤部位血管基底膜。由于α Ⅴβ和ECMP-FN特异性表达在肿瘤血管内，它们将成为肿瘤治疗新靶子。通过大型噬菌体 文库筛选出与特异地表达在脑和肾脏血管内皮细胞中配体反应的多肽。应用这些技术，可能 筛选出能与病毒载体包膜糖蛋白中的独一无二的多肽，产生专嗜肿瘤内皮细胞的逆转录载体 。
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逆转录病毒载体在体内感染过程中遇到的最大困难之一是被补体系统快速灭活，这是以逆转 录病毒的载体的基因疗法中遇到的最大困难之一，限制了它在人和动物体内全身的应用，克 服这一障碍的有关研究正在进行之中。
3.3 腺病毒载体 缺陷型腺病毒载体具有将遗传物质导入内皮细胞，并使之在其 中表达的能力。与逆转录病毒载体不同，腺病毒载体在体内半衰期长，既攻击增生的细胞， 又攻击非增生细胞[14]。瞬时基因表达和对腺病毒蛋白质产生的免疫反应，妨碍了 腺病毒载体在基因疗法中的应用。但在以迅速消灭靶细胞群为目的，以血管内皮细胞为靶子 的基因治疗中，这一问题就不明显了。
在未受损的动脉里，腺病毒载体的基因转移主要局限在血管内皮细胞中。如果血管的完整性 受到破坏，新暴露在血液中的细胞成为主要攻击目标。与逆转录病毒载体一样，肿瘤内部注 射腺病毒载体，能够发生血管内皮细胞的转导。将辐射治疗与含有编码P53蛋白的腺病毒载 体联合治疗时，虽然转移到肿瘤细胞的基因不多，但能产生出人意料的巨大效应。这反应了 P53蛋白在增强辐射治疗对血管内皮细胞损伤中的作用。
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虽然比逆转录病毒更加复杂，腺病毒载体也能经过基因工程改造而改变靶细胞特异性。腺病 毒的吸附和摄入以包膜蛋白的结合开始，内化和脱衣壳，病毒脱衣壳需要腺病毒penton bas e 蛋白中的RGD氨基motif与出现在靶细胞膜上的整合素αⅤβ3和/或整合素αⅤβ 5相互作用[15]。缺乏整合素αⅤβ3和/或整合素αⅤβ5的细胞对腺病毒 感染的耐受性增加。增强血管生成部位的内皮细胞上的αⅤβ3的表达，将增加对这些 细胞的攻击特异性。
用特异性地被αⅤβ3或αⅤβ1识别，而不被αⅤβ5的其他氨基酸motif取代 野生型RGD motif，成功地改变了腺病毒的结合特异性。将与特异性表达在肿瘤相关血管内 皮细胞上决定簇有亲和力的多肽基因嵌合到腺病毒载体penton base 蛋白，能够产生特异地 攻击肿瘤相关的血管内皮细胞的腺病毒载体。为了保证其特异性，必须阻断病毒包膜纤维蛋 白的吸附作用，已经完成了缺乏功能性纤维蛋白的突变载体的构建，这种载体与细胞的结合 依靠penton base蛋白介导。
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将Fc受体或其他免疫球蛋白结合蛋白嵌合到腺病毒包膜蛋白，结构和空间上存在一些问题有 待解决，但双特抗体已经成功地将腺病毒颗粒结合到那些对腺病毒转导产生耐受的细胞的非 腺病毒受体上，导致基因转染的高效率和高度特异性。将叶酸盐与抗包膜纤维的单克隆抗体 交联，通过高效表达的叶酸盐受体而改变腺病毒载体感染的靶细胞也获得成功。利用VEGF或 其他血管生长因子进行类似研究，产生以增生的肿瘤相关血管内皮细胞为特异靶子的腺病毒 载体的实验研究已经取得重要进展。
3.4 组织特异性启动子和其他调节成分 将特异地存在于靶细胞中的调节成分( 主要包括启动子和增强子)引入到载体系统，可以增加以肿瘤血管为靶子的基因疗法的安全 性和效率。研究发现，人ICAM-2的5′ 区的334个碱基对片段存在于所有内皮细胞中， 而在其他类型的细胞中几乎没有或完全没有活性[16，17]。人von Willebrands 因 子启动子在体外广泛存在于内皮细胞中，而在转基因鼠中，似乎只有在脑血管内皮细胞中才 能驱动高水平的基因表达。
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对血管增生部位内皮细胞的基因进行诱导显示，鼠内皮素原启动子在转基因鼠内皮细胞中能 启动高水平的基因表达，在部分平滑肌细胞和上皮细胞也有活性。鼠Tie-2启动子在转基因 鼠胚胎中，启动Lac Z指示基因内皮细胞特性表达，但在成年转基因鼠中则没有活性。人flt -1 VEGF 4NA 受体基因的5′ 区1 kb片段在内皮细胞中显示出功能活性，但在平滑肌细胞 、上皮细胞和纤维母细胞中则无活性。
肿瘤微环境为某些基因选择性表达提供了独一无二的机会。低氧、低pH和高浓度CO2能激 活相应基因的表达，将启动这些基因表达的启动子嵌入表达载体中，可能促进肿瘤特异性表 达。一个更加强大和更加灵活的途径可能是，将治疗基因放置在一个可以通过外部刺激进行 开关的启动子或其他调节成分控制系统中。最近有作者构建了一个腺病毒载体，它包含TNF -α基因，该基因接受一个来自Erg-1启动子可诱导辐射成分的控制，在受到辐射后，能增 强TNF-α产量和对肿瘤的控制，但不增加对正常组织的损伤。
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另一个增强基因表达的细胞特异性的方法是，将决定信号稳定性的结构基因嵌入到载体中， 使靶细胞中的mRNA聚集。正常细胞与肿瘤细胞剪接某些pre-mRNA的能力不同，将治疗基因 与细胞剪接系列外显子成分的能力联结起来，能够增强肿瘤相关血管中基因表达的选择性。
[作者简介] 张莉(1960-)，女(汉族)，主管药师.
[参 考 文 献]
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[收稿日期] 2000-06-28
[修回日期] 2000-07-20, http://www.100md.com
单位：张莉(第二军医大学长征医院药学部， 上海 200003)；刘皋林(第二军医大学长征医院药学部， 上海 200003)
关键词：血管肿瘤；基因疗法；抗肿瘤药
第二军医大学学报001028
[摘要] 肿瘤血管内皮细胞不易产生耐药性，药物 容易到达，少量破坏即可引起大量癌细胞死亡。以血管网络为靶子的抗癌治疗相关药物，如 细胞因子TNF-α、化疗制剂秋水仙碱、黄酮醋酸(FAA)、二甲基磺醌醋酸(DMXAA)、 combre tastatin-A4 phosphate等抗癌作用已经得到证实。毒性蛋白质基因，将无毒前药转变成有 毒产物的基因，经过特殊改造后能识别肿瘤血管内皮细胞的逆转录病毒和腺病毒载体，以及 肿瘤血管内皮细胞上特异性抗原决定簇的诱导等基因治疗研究显示出良好的抗癌前景。
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[中图分类号] R 979.1 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)10-0987-04
实体肿瘤的生长依赖肿瘤内部血管网络的形成，在癌细胞和相关巨噬细胞释放的血管内 皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)促进下，大量新生血管形成 ，癌细胞持续增生，氧气和葡萄糖大量消耗，酸性代谢产物堆积，刺激新生血管形成[ 1]，新血管又促进癌细胞群体的迅速膨胀，循环往复。阻止血管的形成和功能将是肿瘤 治疗的重要途径。以肿瘤血管内皮细胞为靶子的基因治疗途径主要有两个，一是干扰新生血 管的形成；二是破坏肿瘤血管网络。在抗肿瘤新生血管形成上已经取得了引人瞩目的成绩。 如金属蛋白酶抑制因子、多硫戊聚糖、TNP-470抗血管生长制剂、flk-1酪氨酸激酶活性的 选择性抑制因子、血管生长抑制因子、VEGF受体以及属内皮细胞增生抑制因子的血管抑素(a ngiostatin)和内抑素(endostatin)等都被证实有较强的抗癌活性[2，3]。Angiost atin为第一个从肿瘤细胞中分离、具有强烈抑制血管生成作用的物质，它不是由肿瘤细胞直 接产生，某些肿瘤细胞如前列腺癌细胞可以产生或激活某些蛋白酶，由这些蛋白酶将纤维蛋 白溶酶原前体裂解并释放出多肽片段。Endostatin 是胶原ⅩⅧ的裂解片段，是具有高度特 异性的内皮细胞特异抑制因子。而破坏已经形成的血管网络的研究进展相对较少，本文仅就 以破坏癌组织内部已经形成的血管网络为手段的抗癌治疗研究现状作一综述。
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1 肿瘤内部血管网络在肿瘤生长消退中的作用
实体肿瘤的血管蒂扭曲、血管受损或某些细菌感染后引起的血栓形成，可诱发肿瘤消退 ，阻断血液供应，造成局部缺血，使癌细胞大量死亡。延长缺血时间，可将肿瘤治愈。破坏 肿瘤相关血管已成为肿瘤治疗的又一途径，它具有许多直接以癌细胞为靶子的抗癌治疗所不 具备的优势：第一、每个小血管供应数量庞大的细胞群，损伤少量的血管内皮细胞就可引起 大量癌细胞死亡，产生放大效应；第二、血管内皮细胞与血流接触紧密，克服了以癌细胞为 靶子时常见的药物传递困难；第三、血管内皮细胞是非转化性的，发生耐药性突变的机会较 少。以肿瘤血管作为靶子的成败的关键在于找出肿瘤血管与正常组织内部血管之间的差异 [2，3]。现有资料表明，与正常组织血管相比，肿瘤血管内皮细胞增生迅速，新生血 管多；对低氧环境和酸性代谢产物更加敏感。由于与癌细胞相互靠近，癌细胞又可能改变其 血管内皮细胞的特性，从而制备以肿瘤血管为特异攻击目标的化学和生物制剂成为可能。
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2 抗肿瘤血管网络细胞因子、化学制剂及抗体
2.1 细胞因子 肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor α， TNF-α)是一种由 于细胞感染或注射内毒素诱导机体产生的细胞因子，当TNF-α含量达到一定水平后，既能 够直接杀死癌细胞，还能够引起血管内皮细胞损伤，产生出血性和凝固性坏死，从而使肿瘤 消退[4]。由于TNF-α具有强烈毒副作用，最大耐受剂量与有效治疗剂量之间仅有 10倍的差异，全身给药时，难于取得理想的治疗效果，以局部灌注给药疗效良好。
2.2 化学制剂 黄酮醋酸(flavone acetic acid， FAA)和二甲基磺醌醋酸(dime thylxanthenone acetic acid， DMXAA) 是两个化学结构相似的化合物，具有选择性攻击和 损伤肿瘤血管的作用[5，6]，其作用机制尚不十分清楚。初步研究结果显示，DMXA A能够诱导人类和小鼠肿瘤组织内部激活的巨噬细胞释放TNF-α。FFA仅能诱导小鼠巨噬细 胞释放TNF-α。DMXAA治疗肿瘤的临床试验正在部分国家进行。
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2.3 微管蛋白聚合抑制因子 微管蛋白聚合(tubulin polymerization)抑制因子 对血管的作用已经引起了不少学者的注意[7，8]，秋水仙碱、长春新碱、长春碱( podophyllotoxin)等微管蛋白聚合抑制因子能引起肿瘤内部新生的毛细血管损伤，造成出 血性广泛坏死。Combretastin -A4磷酸酯显著改变新生血管内皮细胞的构象，改变毛细血 管血流量，暴露血管基底膜，引起广泛的出血和凝血，对处于分裂状态的内皮细胞具有强烈 的细胞毒和抗增生效应，而对处于静止状态的细胞无明显作用。有关详细机制正在研究之中 。
2.4 抗肿瘤血管内皮细胞抗体 以癌细胞为攻击目标的“生物导弹”的最大缺陷 之一是药物难于直接攻击目标。以肿瘤血管内皮细胞为靶子的生物疗法有效地克服了这一困 难。利用干扰素-γ(interferon-γ， IFN-γ)能显著增强肿瘤相关的血管内皮细胞上主 要组织相容性复合体(MHC-Ⅱ)抗原表达的特性[9]，用IFN-γ转染肿瘤内皮细 胞，再将蓖麻毒素与抗MHC的单克隆抗体交联，将单克隆抗体交联的毒素导入体内后，蓖麻 毒素聚集在高表达MHC-Ⅱ抗原的肿瘤血管内皮细胞，破坏内皮细胞，激发局部血栓形成， 造成肿瘤组织坏死。研究表明，translocated in extraskeletal chondrosarcoma -11(TE C-11)，VEGF-N末端、整合素αⅤβ3 和酪氨酸激酶(Tie-1)的受体等在肿瘤血管 内皮细胞的表达相对较强，其配体可能具有引导生物导弹的潜在的应用价值。寻找更加特异 的肿瘤血管内皮细胞抗原决定簇是该项研究成败的关键。
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3 以肿瘤血管为靶子的基因疗法
3.1 治疗性基因 近年来有关肿瘤基因疗法在直接杀伤、或(和)增强血管内皮 细胞对放疗或化疗制剂的敏感性，增强化疗和放疗的抗癌效果方面取得了巨大进展，筛选出 大量相关基因[10]。其中，最有前景的基因包括：编码有毒的蛋白质抑制基因，如 绿脓杆菌外毒素A基因；将无毒前药转变成有生物学活性的代谢产物的基因，如单纯疱疹病 毒胸苷激酶基因、带状疱疹病毒胸苷激酶基因、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因等。实验表明只 有在实体肿瘤中那种特殊的微环境中，这些基因的毒性产物才被大量激活，暴露在缺血环境 中的血管内皮细胞对这些基因编码的毒性酶尤其敏感。另外一些编码凝固因子基因的研究正 在进行之中。构建编码在人体内安全、实用而高效的、仅仅作用于肿瘤相关的血管内皮细胞 的基因，还需要进一步努力。
3.2 逆转录病毒载体 静止状态的内皮细胞更新一次需要长达数月之久，肿瘤血 管内皮细胞增生活跃，几天就更新一次。逆转录病毒载体只感染增生的细胞，从而可选择性 感染血管内皮细胞。体外研究表明，逆转录病毒载体能感染内皮细胞并在其中高度表达 [11]。给大鼠注射利多卡因4 d后，明显增强诱导血管生成作用，此时给大鼠后肢注射 含有编码耐热的人类胎盘碱性磷酸酶，指示基因中的pLJ逆转录病毒悬液，转基因在内皮细 胞和肌细胞中持续高水平表达21 d以上，而对照组未经利多卡因诱导的、血管增生不明显的 大鼠始终未见转基因表达。
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逆转录病毒载体在体内有广泛的受体，影响了其转染效率和安全性。改造病毒载体表面包膜 糖蛋白，使之仅仅与靶细胞表面特异受体结合是目前研究的重点之一。大多数逆转录病毒载 体都是以莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus，MMLV)为基础改造而建立 起来的[12]，该病毒包膜糖蛋白上有两个共价联结区，一个被称为SU(gp70)区，另 一个被称为TM(gp20)区，它们来自单一前体分子PR90env。其氨基端SU肽使病毒结合到受体 上，而羧基端TM区使这个分子锚定在病毒体表面。另外TM区还包括一个被称为融合肽的疏水 区，该区在病毒的摄取中发挥着重要作用。最近证实，如果将免疫球蛋白可变区的抗原结合 位点与逆转录病毒包膜蛋白的SU区联结起来，就能使病毒感染有特殊表面分子的细胞。将Ig G的A蛋白结合区与Sindbis病毒载体联结也产生了类似效果。将野生型ecotropic env 糖蛋 白基因和红细胞生成素基因嵌合至逆转录病毒载体，使之产生了专一攻击表达促红细胞素受 体效果。
, 百拇医药 从以上研究成果证实，通过对MMLV包膜蛋白的SU区进行遗传学改造，能够改变逆转录病毒颗 粒结合的靶细胞种类和部位[13]。将一个能与细胞表面配体进行反应的蛋白质嵌合 到病毒包膜蛋白质中时，能使病毒特异感染带配体的细胞。确定参与肿瘤相关血管内皮细胞 迁移、增生的蛋白质，细胞因子或其他衍生因子成为该领域重要课题。
最近发现，噬菌体产生一个九肽，这个九肽与整合素αⅤβ具有强大亲和力，αⅤβ特 异表达在活跃的血管生成部位的内皮细胞上，注射该噬菌体到动物体内，它首先出现在肿瘤 部位。产生与细胞外基质蛋白-纤维联结蛋白(extracellular matrix protein-fibronec tin， ECMP-FN)片段反应的单链抗体的噬菌体也首先出现在肿瘤部位血管基底膜。由于α Ⅴβ和ECMP-FN特异性表达在肿瘤血管内，它们将成为肿瘤治疗新靶子。通过大型噬菌体 文库筛选出与特异地表达在脑和肾脏血管内皮细胞中配体反应的多肽。应用这些技术，可能 筛选出能与病毒载体包膜糖蛋白中的独一无二的多肽，产生专嗜肿瘤内皮细胞的逆转录载体 。
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逆转录病毒载体在体内感染过程中遇到的最大困难之一是被补体系统快速灭活，这是以逆转 录病毒的载体的基因疗法中遇到的最大困难之一，限制了它在人和动物体内全身的应用，克 服这一障碍的有关研究正在进行之中。
3.3 腺病毒载体 缺陷型腺病毒载体具有将遗传物质导入内皮细胞，并使之在其 中表达的能力。与逆转录病毒载体不同，腺病毒载体在体内半衰期长，既攻击增生的细胞， 又攻击非增生细胞[14]。瞬时基因表达和对腺病毒蛋白质产生的免疫反应，妨碍了 腺病毒载体在基因疗法中的应用。但在以迅速消灭靶细胞群为目的，以血管内皮细胞为靶子 的基因治疗中，这一问题就不明显了。
在未受损的动脉里，腺病毒载体的基因转移主要局限在血管内皮细胞中。如果血管的完整性 受到破坏，新暴露在血液中的细胞成为主要攻击目标。与逆转录病毒载体一样，肿瘤内部注 射腺病毒载体，能够发生血管内皮细胞的转导。将辐射治疗与含有编码P53蛋白的腺病毒载 体联合治疗时，虽然转移到肿瘤细胞的基因不多，但能产生出人意料的巨大效应。这反应了 P53蛋白在增强辐射治疗对血管内皮细胞损伤中的作用。
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虽然比逆转录病毒更加复杂，腺病毒载体也能经过基因工程改造而改变靶细胞特异性。腺病 毒的吸附和摄入以包膜蛋白的结合开始，内化和脱衣壳，病毒脱衣壳需要腺病毒penton bas e 蛋白中的RGD氨基motif与出现在靶细胞膜上的整合素αⅤβ3和/或整合素αⅤβ 5相互作用[15]。缺乏整合素αⅤβ3和/或整合素αⅤβ5的细胞对腺病毒 感染的耐受性增加。增强血管生成部位的内皮细胞上的αⅤβ3的表达，将增加对这些 细胞的攻击特异性。
用特异性地被αⅤβ3或αⅤβ1识别，而不被αⅤβ5的其他氨基酸motif取代 野生型RGD motif，成功地改变了腺病毒的结合特异性。将与特异性表达在肿瘤相关血管内 皮细胞上决定簇有亲和力的多肽基因嵌合到腺病毒载体penton base 蛋白，能够产生特异地 攻击肿瘤相关的血管内皮细胞的腺病毒载体。为了保证其特异性，必须阻断病毒包膜纤维蛋 白的吸附作用，已经完成了缺乏功能性纤维蛋白的突变载体的构建，这种载体与细胞的结合 依靠penton base蛋白介导。
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将Fc受体或其他免疫球蛋白结合蛋白嵌合到腺病毒包膜蛋白，结构和空间上存在一些问题有 待解决，但双特抗体已经成功地将腺病毒颗粒结合到那些对腺病毒转导产生耐受的细胞的非 腺病毒受体上，导致基因转染的高效率和高度特异性。将叶酸盐与抗包膜纤维的单克隆抗体 交联，通过高效表达的叶酸盐受体而改变腺病毒载体感染的靶细胞也获得成功。利用VEGF或 其他血管生长因子进行类似研究，产生以增生的肿瘤相关血管内皮细胞为特异靶子的腺病毒 载体的实验研究已经取得重要进展。
3.4 组织特异性启动子和其他调节成分 将特异地存在于靶细胞中的调节成分( 主要包括启动子和增强子)引入到载体系统，可以增加以肿瘤血管为靶子的基因疗法的安全 性和效率。研究发现，人ICAM-2的5′ 区的334个碱基对片段存在于所有内皮细胞中， 而在其他类型的细胞中几乎没有或完全没有活性[16，17]。人von Willebrands 因 子启动子在体外广泛存在于内皮细胞中，而在转基因鼠中，似乎只有在脑血管内皮细胞中才 能驱动高水平的基因表达。
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对血管增生部位内皮细胞的基因进行诱导显示，鼠内皮素原启动子在转基因鼠内皮细胞中能 启动高水平的基因表达，在部分平滑肌细胞和上皮细胞也有活性。鼠Tie-2启动子在转基因 鼠胚胎中，启动Lac Z指示基因内皮细胞特性表达，但在成年转基因鼠中则没有活性。人flt -1 VEGF 4NA 受体基因的5′ 区1 kb片段在内皮细胞中显示出功能活性，但在平滑肌细胞 、上皮细胞和纤维母细胞中则无活性。
肿瘤微环境为某些基因选择性表达提供了独一无二的机会。低氧、低pH和高浓度CO2能激 活相应基因的表达，将启动这些基因表达的启动子嵌入表达载体中，可能促进肿瘤特异性表 达。一个更加强大和更加灵活的途径可能是，将治疗基因放置在一个可以通过外部刺激进行 开关的启动子或其他调节成分控制系统中。最近有作者构建了一个腺病毒载体，它包含TNF -α基因，该基因接受一个来自Erg-1启动子可诱导辐射成分的控制，在受到辐射后，能增 强TNF-α产量和对肿瘤的控制，但不增加对正常组织的损伤。
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另一个增强基因表达的细胞特异性的方法是，将决定信号稳定性的结构基因嵌入到载体中， 使靶细胞中的mRNA聚集。正常细胞与肿瘤细胞剪接某些pre-mRNA的能力不同，将治疗基因 与细胞剪接系列外显子成分的能力联结起来，能够增强肿瘤相关血管中基因表达的选择性。
[作者简介] 张莉(1960-)，女(汉族)，主管药师.
[参 考 文 献]
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[收稿日期] 2000-06-28
[修回日期] 2000-07-20, http://www.100md.com